技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域中利用熒光碳納米點(diǎn)對谷胱甘肽的檢測。
背景技術(shù)：
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谷胱甘肽(gsh)作為低分子量脂肪族硫醇是非常重要的，其存在于幾乎所有的細(xì)胞中并引導(dǎo)多種細(xì)胞過程，并且在引導(dǎo)哺乳動物系統(tǒng)中的許多生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人體的gsh的異常水平可以影響到許多細(xì)胞功能作用，包括細(xì)胞內(nèi)氧化還原活性的維持、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控和肝臟損傷，并與癌癥、阿爾茨海默氏癥和不同種類的心血管疾病等疾病密切相關(guān)。然而，半胱氨酸(cys)和高半胱氨酸(hcy)具有和gsh一樣的硫醇結(jié)構(gòu)，它們的結(jié)構(gòu)是相似的，所以使它們難以區(qū)分開來。因此，開發(fā)出能夠快速、靈敏和選擇性檢測三種氨基酸的方法是非常重要的，特別是可以區(qū)分這三種物質(zhì)的方法。
熒光探針由于其靈敏度高、特異性高、實(shí)時(shí)檢測和操作簡單等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，已被用于檢測硫醇結(jié)構(gòu)。用于檢測gsh、cys和hcy的熒光探針已經(jīng)被廣泛使用，包括香豆素衍生物、羅丹明衍生物、半導(dǎo)體量子點(diǎn)(qds)、納米團(tuán)簇、碳點(diǎn)(cds)等。用于檢測gsh、cys和hcy的反應(yīng)具有多種，諸如邁克爾加成、環(huán)化、配位置換和裂解反應(yīng)。幾年前，基于cys、hcy與醛或丙烯酸酯的環(huán)化反應(yīng)的探針的開發(fā)，顯示出納米顆粒對cys和hcy的選擇性。此外，基于兩種反應(yīng)的擴(kuò)展，本發(fā)明開發(fā)了用于區(qū)別檢測gsh、cys和hcy的特異性熒光探針。隨后，通過使用鹵素取代環(huán)化反應(yīng)而不是丙烯酸酯反應(yīng)的加成環(huán)化來改性有機(jī)熒光探針，此有機(jī)熒光探針可直接用于檢測gsh、cys和hcy。然而，很少有無機(jī)熒光探針可以直接區(qū)分gsh、cys和hcy，并且主要通過開啟過程在整個(gè)探針-m2+復(fù)合體系(m＝hg、cu和pb)中用硫醇來檢測氨基酸。
在無機(jī)熒光探針中，作為熒光傳感器的cds由于其優(yōu)異的熒光特性，如光學(xué)穩(wěn)定性和激發(fā)依賴發(fā)射性，特別是良好的生物相容性，使其受到研究人員越來越廣泛地關(guān)注，由于其細(xì)胞毒性低，使得它在現(xiàn)代生物成像，分子檢測和光催化中的具有潛在的應(yīng)用。cds的表面含有羧基和氨基官能團(tuán)等。含有鹵素(cl，br和i)的熒光探針不發(fā)熒光，鹵素也是眾所周知的熒光猝滅劑，這是由于重原子效應(yīng)。鹵素基團(tuán)可以被-sh所取代，導(dǎo)致其明顯的熒光增強(qiáng)?？紤]到這些，我們設(shè)計(jì)和合成了富含氨基的cds，然后通過共價(jià)連接溴乙酰溴分子，以形成溴乙酰溴功能化cds(cds-br)熒光探針，基于cds的優(yōu)異熒光性質(zhì)，該探針能夠用于檢測gsh、cys和hcy基于鹵素取代環(huán)化和內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ict)過程。結(jié)果表明，基于這種鹵素探針，特別是針對大多數(shù)基于醛或丙烯酸酯的熒光探針在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)水溶液中區(qū)分檢測gsh、hcy和cys中的gsh，從而為在生物系統(tǒng)中研究gsh相關(guān)的生理過程和疾病創(chuàng)造了機(jī)會。此外，該熒光探針可以區(qū)分它們，并且已經(jīng)成功應(yīng)用于監(jiān)測活細(xì)胞中的gsh。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明改進(jìn)了現(xiàn)有檢測方法毒性高、生物相容性差、水溶性不好和選擇性差等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了利用功能化的熒光碳點(diǎn)對gsh的區(qū)別于hcy和cys檢測。
本發(fā)明利用這種熒光碳點(diǎn)(cds)通過溴乙酰溴功能化之后，由于重原子效應(yīng)導(dǎo)致cds熒光的猝滅，加入-sh之后導(dǎo)致熒光的恢復(fù)，并且加入gsh以及hcy和cys的反應(yīng)機(jī)理的不同實(shí)現(xiàn)了區(qū)別的檢測gsh。用不同濃度的gsh測得不同熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)可得到方程f/f0-1＝0.26c-0.55，其中f0為不加入gsh的熒光強(qiáng)度，f為gsh濃度為c時(shí)的熒光強(qiáng)度，相關(guān)系數(shù)為0.9943。gsh濃度范圍在2.5μm到30μm。從而推算出對于gsh的檢測限為0.14μm。
本發(fā)明對上述檢測過程中的干擾性因素進(jìn)行了深入研究，包括溫度、ph值、以及離子強(qiáng)度對碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響。干擾性測試是在磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行。測試結(jié)果表明溫度對熒光強(qiáng)度幾乎沒有影響，對ph值的測試中我們發(fā)現(xiàn)，在ph值為7.0-8.0時(shí)有最好的檢測效果，這個(gè)ph值和生物體內(nèi)的環(huán)境很相似，這表明了這種碳點(diǎn)可以在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。離子強(qiáng)度測試顯示：nacl對結(jié)果的影響也很小，這說明這種碳點(diǎn)可以在實(shí)際中進(jìn)行很好的應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本發(fā)明的cds的合成：將含有檸檬酸1.26g和二乙烯三胺1.5ml的透明溶液溶解在30ml的蒸餾水中。然后將溶液轉(zhuǎn)移到聚(四氟乙烯)高壓反應(yīng)釜(50ml)中，并在200℃下加熱5小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)釜自然冷卻至環(huán)境溫度時(shí)，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，將所得固體溶解于乙醇中，通過離心(4000rpm，15分鐘)除去不溶性沉淀物。對最終產(chǎn)物進(jìn)行透析(mw＝3500da)，從而獲得cds。
本發(fā)明的功能化碳點(diǎn)(cds-br)的合成：將cds(0.1g)溶于20ml氯仿中，將溶液在冰浴上冷卻。三頸燒瓶配備有兩個(gè)加料漏斗，一個(gè)含有溴乙酰溴(5ml)的20ml氯仿溶液，另一份含有碳酸鉀(3.3g)的10ml水溶液。在30分鐘內(nèi)將加料漏斗內(nèi)的物質(zhì)同時(shí)加入到攪拌反應(yīng)器中。加完后，停止冰浴，使反應(yīng)在室溫下繼續(xù)冷卻12小時(shí)。分離水層和有機(jī)層，水相用乙酸乙酯(4×100ml)萃取。然后將合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，真空除去溶劑，得到cds-br。然后使用二氯甲烷和乙醇的混合物作為洗脫劑，用硅膠柱色譜法純化cds-br。終產(chǎn)物在真空下在50℃干燥過夜。
實(shí)施例2
本發(fā)明中使用的功能化cds對gsh敏感性以及濃度的檢測。
把gsh按照濃度從0μm到200μm逐漸加入到碳點(diǎn)溶液中，檢測熒光強(qiáng)度的變化以及不同gsh濃度(20μm到80μm)和熒光猝滅效率f/f0-1之間的線性關(guān)系。結(jié)果表明隨著gsh的加入，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說明這種碳點(diǎn)對于的gsh感性很好并且具有很低的檢測限0.14μm。