本發(fā)明涉及一種檢測用質控品及其配制方法，特別涉及氨基酸與?；鈮A干血斑質控品及其制備方法。
背景技術：
遺傳代謝病是指由于基因突變使合成的酶、受體、載體等蛋白功能缺陷，導致體內生化物質在合成、代謝、轉運和儲存等方面出現各種異常。它屬于單基因遺傳病的一部分，絕大多數屬常染色體隱性遺傳，少數為常染色體顯性遺傳、x連鎖伴性遺傳，或者線粒體遺傳；遺傳代謝病病種繁多，常見500-600種，總數可能達數千余種；單病發(fā)病率低，但總體發(fā)病率較高，有報道患病率在0.5％以上。
新生兒疾病篩查是預防出生缺陷行之有效的三級預防措施，對提高出生人口素質有著重要的意義。串聯質譜檢測的遺傳代謝病項目在2分鐘內可檢測18種氨基酸和45種酰基肉堿，上述遺傳代謝病可檢測超過45種遺傳代謝病，目前已廣泛應用于各種高端實驗室，可更有效、更早地檢出遺傳性代謝性疾病，為針對性治療提供有效依據。隨著該技術越來越多地應用于臨床的輔助診斷，體內氨基酸和酰基肉堿測定的準確性顯得越來越重要。
質控品是專門用于室內質量控制的、穩(wěn)定的、與待測樣品近似的材料，是保證準確測定的重要基礎，并可對方法穩(wěn)定性進行一個長期有效的監(jiān)控，隨著串聯質譜檢測越來越多地應用于臨床的輔助診斷，相關質控品的需求量也逐漸增大。
由于串聯質譜一次檢測的化合物種類繁多，一般而言，為保證其質控效果，其質控品中也需要添加多種組分，而因為各組分的特性不同，難以制備得到均一穩(wěn)定的質控品。因此，目前，商品化氨基酸和?；鈮A干血斑質控品來源少，且產品價格昂貴，到貨周期長，同一批號無穩(wěn)定性來源。因此，研發(fā)穩(wěn)定性、均一性都符合要求的質控品制備方法具有重要意義。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種成份相對簡單、穩(wěn)定性、均一性均符合要求的氨基酸與?；鈮A干血斑質控品及其制備方法。
本發(fā)明所采取的技術方案是：
一種氨基酸與?；鈮A干血斑質控品，主要由氨基酸標準品、酰基肉堿標準品和紅細胞干固于載體上形成，其中，氨基酸標準品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8種氨基酸。
作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的進一步改進，酰基肉堿標準品包括游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、丙二酰肉堿共15種?；鈮A。
作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的進一步改進，質控品中各氨基酸按照以下述終摩爾比配合：
作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的進一步改進，質控品中各酰基肉堿按下述終摩爾比配合：
作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的進一步改進，載體為濾紙。濾紙可以是國際903濾紙片等本領域常用的濾紙。
一種上述的氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的制備方法，包括如下步驟：
1)制備紅細胞液：收集健康人源全血，分離得到紅細胞，用生理鹽水調整紅細胞比容至預定值，得到紅細胞液，并測定其中各氨基酸和酰基肉堿本底值；
2)制備標準溶液：使用水性溶劑將氨基酸和/或水溶性酰基肉堿溶解；使用醇類溶劑溶解脂溶性?；鈮A，得到氨基酸標準溶液和/或?；鈮A標準溶液；
3)制備血斑質控品：在上述紅細胞液中添加氨基酸標準溶液和/或?；鈮A標準溶液至設定值，得到工作液；取上述工作液滴加在載體上，干燥得到氨基酸與?；鈮A干血斑質控品。
作為上述制備方法的進一步改進，水性溶劑為生理鹽水，所述氨基酸為：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性?；鈮A為：游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿和丙二酰肉堿；醇類溶劑為甲醇，所述脂溶性酰基肉堿為：月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿。
作為上述制備方法的進一步改進，制備紅細胞液步驟中，紅細胞比容的預定值為45～55％。
作為上述制備方法的進一步改進，工作液中，各氨基酸的濃度分別為：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、纈氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各?；鈮A的濃度分別為：游離肉堿30～70μm、乙酰肉堿20～40μm、丙酰肉堿5～12μm、丁酰肉堿1～3.5μm、異戊酰肉堿0.5～2.0μm、己酰肉堿0.4～1.2μm、辛酰肉堿0.4～1.2μm、葵酰肉堿0.4～1.2μm、月桂酰肉堿0.3～1.0μm、肉豆蔻酰肉堿0.4～1.4μm、棕櫚酰肉堿4.0～12.0μm、十八碳酰肉堿1.5～6.0μm、3-羥基異戊酰肉堿0.4～1.2μm、戊二酰肉堿1.0～3.0μm、丙二酰肉堿0.2～1.0μm。
作為上述制備方法的進一步改進，制備血斑質控品步驟中，取70～100μl工作液滴加在載體上。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明的氨基酸與酰基肉堿干血斑質控品，通過精心設計組份，綜合考慮檢測方法的特點和18種氨基酸與45種?；鈮A檢測指標的重要性之后選出，最具代表性，在大幅減少標準品使用的情況下，獲得了穩(wěn)定性、均一性都符合要求的氨基酸與?；鈮A干血斑質控品。
并且，該質控指標的濃度也是非常關鍵的，同樣是綜合考慮檢測方法的特點和各檢測指標的特點之后選出，具有最佳的代表性和穩(wěn)定性。
該質控品制備方法成本低，操作簡單，能夠較大量的進行配制，使用周期較長，不需頻繁更換質控批號，方便日常質控分析，從而滿足臨床和日常檢測對質控品的需求。
采用本發(fā)明提供的制備方法制得的氨基酸與?；鈮A干血斑質控品在-20℃的條件下可保存4個月以上，從-20℃條件取出恢復常溫后的均一性、穩(wěn)定性都能符合質控品要求。
具體實施方式
一種氨基酸與?；鈮A干血斑質控品，主要由氨基酸標準品、酰基肉堿標準品和紅細胞干固于載體上形成，其中，氨基酸標準品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8種氨基酸。
作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的進一步改進，?；鈮A標準品包括游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、丙二酰肉堿共15種?；鈮A。
作為上述氨基酸與酰基肉堿干血斑質控品的進一步改進，質控品中各氨基酸按照以下述終摩爾比配合：
作為上述氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的進一步改進，質控品中各?；鈮A按下述終摩爾比配合：
作為上述氨基酸與酰基肉堿干血斑質控品的進一步改進，載體為濾紙。濾紙可以是國際903濾紙片等本領域常用的濾紙。
一種上述的氨基酸與?；鈮A干血斑質控品的制備方法，包括如下步驟：
1)制備紅細胞液：收集健康人源全血，分離得到紅細胞，用生理鹽水調整紅細胞比容至預定值，得到紅細胞液，并測定其中各氨基酸和?；鈮A本底值；
2)制備標準溶液：使用水性溶劑將氨基酸和/或水溶性?；鈮A溶解；使用醇類溶劑溶解脂溶性?；鈮A，得到氨基酸標準溶液和/或酰基肉堿標準溶液；
3)制備血斑質控品：在上述紅細胞液中添加氨基酸標準溶液和/或酰基肉堿標準溶液至設定值，得到工作液；取上述工作液滴加在載體上，干燥得到氨基酸與?；鈮A干血斑質控品。
作為上述制備方法的進一步改進，水性溶劑為生理鹽水，所述氨基酸為：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性?；鈮A為：游離肉堿、乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、己酰肉堿、辛酰肉堿、葵酰肉堿、3-羥基異戊酰肉堿、戊二酰肉堿和丙二酰肉堿；醇類溶劑為甲醇，所述脂溶性?；鈮A為：月桂酰肉堿、肉豆蔻酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿。
醇類溶劑也包括醇的水溶液。
作為上述制備方法的進一步改進，制備紅細胞液步驟中，紅細胞比容的預定值為45～55％。
作為上述制備方法的進一步改進，工作液中，各氨基酸的濃度分別為：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、纈氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各?；鈮A的濃度分別為：游離肉堿30～70μm、乙酰肉堿20～40μm、丙酰肉堿5～12μm、丁酰肉堿1～3.5μm、異戊酰肉堿0.5～2.0μm、己酰肉堿0.4～1.2μm、辛酰肉堿0.4～1.2μm、葵酰肉堿0.4～1.2μm、月桂酰肉堿0.3～1.0μm、肉豆蔻酰肉堿0.4～1.4μm、棕櫚酰肉堿4.0～12.0μm、十八碳酰肉堿1.5～6.0μm、3-羥基異戊酰肉堿0.4～1.2μm、戊二酰肉堿1.0～3.0μm、丙二酰肉堿0.2～1.0μm。
作為上述制備方法的進一步改進，制備血斑質控品步驟中，取70～100μl工作液滴加在載體上。
氨基酸、?；鈮A既可以單獨溶解配置成為相應的標準品溶液，也可以根據需要將多種標準品一并溶解，或分成多組溶解。優(yōu)選的，根據不同氨基酸、?；鈮A的溶解特性差異進行分組溶解，這樣可以大大減少標準品溶液的配制量，降低配制的難度。
配制時，可以參考美國cdc質控品濃度、實驗室臨床參考值和紅細胞液中的目標氨基酸及?；鈮A本底濃度，加入目標氨基酸及?；鈮A標準品，將濃度調節(jié)至目標濃度，具體如下：
計算所需配制濃度質控品所需標準品用量
n(理論物質的量)＝c(需要加強的濃度)×v(配制的質控總體積)
m(實際稱取量)＝n(理論物質的量)*m(相對分子質量)
計算所需加入標準物質溶液的總體積，計算所需加入生理鹽水體積，即得50％紅細胞比容質控基質；
v(生理鹽水體積)＝v1(紅細胞體積)-v2(加入標準物質溶液總體積)。
本領域技術人員也可以使用其他為本領域技術人員熟知的手段進行配制。
濃度單位μm指μmol/l。
下面結合實施例，進一步說明本發(fā)明的技術方案。
實施例1
1)紅細胞的分離：
收集健康人源肝素抗凝全血，要求無明顯溶血、黃疸、脂肪或污染，以3000r/min的速度離心5min，離心后分出上清液及白膜，加入約紅細胞量等量的生理鹽水，使用混勻器充分混勻5-7min，3000r/min離心5min后分出上清液及白膜，重復此步驟3次，即得紅細胞。使用生理鹽水調整紅細胞比容為50％，得到紅細胞液，測定紅細胞液中氨基酸及?；鈮A本底濃度。
2)氨基酸和酰基肉堿的配制：
使用生理鹽水溶解丙氨酸ala、苯丙氨酸phe、亮氨酸lue、甲硫氨酸met、纈氨酸val、瓜氨酸cit、精氨酸arg、酪氨酸t(yī)yr共8種氨基酸標準品，得到氨基酸溶液；
使用生理鹽水溶解游離肉堿c0、乙酰肉堿c2、丙酰肉堿c3、丁酰肉堿c4、異戊酰肉堿c5、己酰肉堿c6、辛酰肉堿c8、葵酰肉堿c10、3-羥基異戊酰肉堿c5-oh、戊二酰肉堿c5dc、丙二酰肉堿c3dc，得到水溶性酰基肉堿溶液；
使用40v/v％甲醇水溶解月桂酰肉堿c12、肉豆蔻酰肉堿c14、棕櫚酰肉堿c16、十八碳酰肉堿c18，得到脂溶性?；鈮A溶液。
將氨基酸溶液和水溶性酰基肉堿溶液與紅細胞液混合，之后滴加脂溶性?；鈮A溶液，充分混勻，得到混合液。根據紅細胞液中氨基酸及?；鈮A本底濃度，通過調節(jié)氨基酸溶液和?；鈮A溶液的添加量以及生理鹽水的添加量，控制氨基酸和?；鈮A溶液在混合液中的終濃度如表1所示：
表1、目標氨基酸與肉堿配置濃度范圍
3)干血斑質控品的制備
使用移液器吸取上一步驟中的混合液85μl，滴加于國際903#濾紙片上，室溫下過夜晾干，得到氨基酸和酰基肉堿干血斑質控品。
氨基酸和酰基肉堿干血斑質控品使用自封袋密封，置于-20℃以下，濕度30rh％以下的條件下保存。
下面結合實驗，進一步展示本發(fā)明方法制得的氨基酸和?；鈮A干血斑質控品的優(yōu)勢。
氨基酸和?；鈮A質控干血斑均一性評估
隨機抽取氨基酸和?；鈮A干血斑質控各20個血斑，按照日常檢測流程處理樣品，使用lc-ms/ms進行測定，計算rsd。實驗結果如表2～表5所示：
表2氨基酸干血斑質控(low)均一性評估數據
表3氨基酸干血斑質控(high)均一性評估數據
表4?；鈮A干血斑質控(low)均一性評估數據
表5酰基肉堿干血斑質控(high)均一性評估數據
實驗數據表明：質控品中氨基酸的rsd均在4.00％～15.00％之間，?；鈮A的rsd均在5.00％～20.00％之間，說明質控基質均勻，均一性良好。
氨基酸和?；鈮A質控干血斑穩(wěn)定性評估
血斑晾干保存后，每次實驗采用3天的結果，每天檢測4組質控，每隔60天，重復此操作，計算其均值、rsd，并進行趨勢性分析，以初始3天均值為初始值，計算回收率。結果如表6～9所示：
表6、氨基酸干血斑質控(low)穩(wěn)定性評估數據
表7、氨基酸干血斑質控(high)穩(wěn)定性評估數據
表8、?；鈮A干血斑質控(low)穩(wěn)定性評估數據
表9、?；鈮A干血斑質控(high)穩(wěn)定性評估數據
使用lc-ms/ms對氨基酸和?；鈮A干血斑質控長期穩(wěn)定性進行驗證，其中氨基酸回收率均在80％～110％之間，?；鈮A回收率均在80％～120之間，氨基酸和?；鈮A干血斑質控品在-20℃以下，濕度30rh％以下的條件下，可穩(wěn)定保存4個月。
以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。