檢測人NGAL的膠體金免疫層析試紙條、試劑盒及其制備方法與流程

本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種半定量檢測尿液中的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(ngal)的膠體金免疫層析試紙條、試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，ngal)由kjeldsen等人于1993年在中性粒細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是一種25kd的糖蛋白。它具有l(wèi)ipocalin家族的典型β-折疊桶結(jié)構(gòu)，與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程密切相關(guān)。ngal可參與細胞分化且作為一種存活因子抑制細胞凋亡；在人類腫瘤中如肺腺癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中可見ngal高表達，并且ngal蛋白可通過保護mmp-9的活性而促進腫瘤細胞的侵襲。近年來有研究證明，ngal作為小分子鐵配合物結(jié)合蛋白直接參與了機體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能(goetzdh，2002；yangj，2002)，與腎缺血，腎毒性損傷以及動脈粥樣硬化(forsbladj，2002；hemdahlal，2006)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且作為一種早期標志物幫助判定缺血性腎損傷程度(mishraj，2003；mishraj，2005)。因此，制備重組ngal蛋白對深入研究ngal的功能及其臨床診斷的應(yīng)用具有重要的意義。尋找急性腎損傷(aki)早期診斷標記物的研究中，人們發(fā)現(xiàn)ngal是一個很好的預(yù)測及診斷指標。有學(xué)者在急性缺血再灌注和順鉑誘導(dǎo)的aki小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)在損傷發(fā)生數(shù)小時之內(nèi)即可檢測到ngal的表達明顯增高。尿ngal是缺血性腎損傷的一個早期、敏感的指標，即aki時血、尿ngal水平均升高，尿ngal水平升高更為顯著。并且ngai升高較早期腎臟損傷的其他指標如腎臟損傷分子(kidneyinjurymolecular1，kim-1)、cyr61(cysteinrichprotein61)、132-微球蛋白等出現(xiàn)得要早。同時，ngal水平與腎臟損傷程度呈正相關(guān)，血和尿ngal可作為診斷aki的早期、敏感、特異性的早期生物學(xué)標記物，并在一定程度上可以反映aki嚴重程度及判斷預(yù)后。ngal已被證實作為小兒心臟搭橋手術(shù)后，預(yù)測急性腎損害的早期可靠指標。高達50％的重癥監(jiān)護室患者可能患有一定程度的急性腎功能衰竭。急性腎功能衰竭死亡率處于危重病死亡率前列。在過去40年內(nèi)，急性腎功能衰竭的預(yù)測并沒有顯著進步。目前的診斷方法，如血清肌酐或胱蛋白酶抑制劑c，只在腎功能惡化后才有所表達，而這可能在器官損傷1天以上才顯現(xiàn)甚至仍不明顯。ngal是載脂蛋白的一種，最初是在激活中性粒細胞中被發(fā)現(xiàn)的一種小分子量分泌性蛋白，現(xiàn)代研究表明，ngal是診斷急性腎損傷的最有效生物學(xué)標志之一，也是早期糖尿病腎病的有效標志物之一。人體研究發(fā)現(xiàn)心臟術(shù)后患者在急性腎臟病發(fā)生的2h內(nèi)，血、尿ngal顯著升高，據(jù)此，ngal被認為是腎功能損傷早期的生物標志物。ngal水平偏高通常出現(xiàn)以下情況：心血管手術(shù)患者、病危人員、膿血性或出血性休克、腎移植、靜脈x射線造影劑的反應(yīng)和腎毒性治療反應(yīng)。最早對血、尿標本中的ngal檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)或者免疫印記法來檢測。但這些都是靠人工操作，無法標準化，檢測周期較長而且費用昂貴，因此并不推薦用于臨床實踐，僅僅用于科學(xué)研究。目前所使用的檢測ngal的elisa試劑盒既可用于手工檢測，也可用于自動化分析，提供實驗室檢測效率。同時，有多個廠家使用免疫比濁法檢測血液或尿液中的ngal的試劑盒獲得注冊證書。比濁法也稱濁度法，屬于散射光譜分析，是在比色的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其測定理論、方法、計算等許多方面和比色法相似，但本質(zhì)上又有區(qū)別。各種濁度都沒有特異(吸收光譜)，只是懸液中的粒子將入射光散射(遮擋)，致使透光度減弱。濁度法分正免疫透射比濁測定技術(shù)和免疫散射比濁測定技術(shù)，是目前檢測人血清中特定蛋白的常用方法。目前以散射比濁為原理的特定蛋白分析儀已在醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域普遍使用。后出現(xiàn)了微量免疫沉淀測定法，即免疫透射比濁測定和免疫散射比濁，自此免疫比濁測定逐漸被廣泛應(yīng)用于臨床體液中蛋白質(zhì)含量檢測的領(lǐng)域。近幾年來，免疫透射比濁測定技術(shù)被廣泛使用在全自動生化分析儀上，實現(xiàn)高速、靈敏和自動化。目前ngal檢測方法有：1、雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法——該法操作簡便，特異性強，敏感性高。但存在操作繁瑣，標本需要預(yù)處理，檢測時間長等缺點。2、金標法——該法具有快速簡便，易觀察的特點。3、透射免疫濁度法——該測定方法簡便、快速，可自動化，適合于批量檢測，但是免疫透射比濁的方法學(xué)及臨床應(yīng)用尚需做進一步的驗證。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條、試劑盒及其制備方法，該檢測試紙條具有能實現(xiàn)半定量檢測、檢測時間短、特異性好，經(jīng)濟成本低等優(yōu)點。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：一種檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條，包括底襯、以及依次設(shè)在所述底襯上的樣品墊、金標墊、包被膜和吸水紙，所述金標墊上包被有膠體金標記的抗人ngal檢測抗體和膠體金標記的雞igy抗體，所述包被膜包括平行設(shè)置、且相互間隔的檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)包被有抗人ngal包被抗體，所述對照區(qū)包被有山羊抗雞igy抗體，所述抗人ngal檢測抗體對應(yīng)具有如seqidno:1～seqidno:7任一所示氨基酸序列的抗原表位。在其中一些實施例中，所述膠體金標記的抗人ngal檢測抗體和膠體金標記的雞igy抗體的濃度分別為0.2-0.5mg/ml和0.2mg/ml，在所述金標墊上的包被量均為1.2ul/cm。在其中一些實施例中，所述金標墊上的膠體金顆粒直徑為35～45nm。在其中一些實施例中，所述檢測區(qū)靠近所述金標墊，所述對照區(qū)靠近所述吸水紙，所述檢測區(qū)和所述對照區(qū)的間隔為0.4cm。在其中一些實施例中，所述抗人ngal包被抗體的濃度為2mg/ml，在所述檢測區(qū)的包被量為1.2ul/cm。在其中一些實施例中，所述山羊抗雞igy抗體的濃度為0.7mg/ml，在所述對照區(qū)的包被量為1.2ul/cm。本發(fā)明還提供了上述檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：(1)、制備抗人ngal包被抗體，在包被膜上分別固定抗人ngal包被抗體和山羊抗雞igy抗體，形成檢測區(qū)和對照區(qū)；(2)、將抗人ngal檢測抗體和雞igy抗體用膠體金進行標記，并噴涂在金標墊上；所述抗人ngal檢測抗體具有如seqidno:1～seqidno:7任一所示氨基酸序列的抗原表位；(3)、在底襯上搭接粘貼樣品墊、金標墊、包被膜和吸水紙，即得。在其中一些實施例中，步驟(1)中所述抗人ngal檢測抗體的制備方法為：根據(jù)ngal全蛋白序列設(shè)計不同肽段，免疫動物獲得特異性抗體；將特異性抗體進行配對，篩選得到靈敏度最高的抗體，即得。本發(fā)明還提供了一種檢測人ngal的膠體金免疫層析試劑盒，包括上述檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、采用本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條進行臨床驗證，共檢測尿液樣本135例(其中陽性33例，陰性102例)，陽性符合率為100％，陰性符合率為100％，總符合率為100％，約登指數(shù)為1，kappa值為1(kappa檢驗，p<0.05)，檢測結(jié)果符合率為100％，與現(xiàn)有對照試紙條有很好的一致性，結(jié)果表明本發(fā)明的試紙條穩(wěn)定性好，結(jié)果較為準確可靠；試紙條操作簡單方便，且成本較進口試紙條價格低廉，具有很好的市場應(yīng)用價值；2、本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條的顯色強弱與尿液樣本中ngal濃度成正比，可根據(jù)提供的比色卡判讀檢測樣本中ngal的濃度范圍，實現(xiàn)半定量檢測，具有簡便、快捷、實用、靈敏、高效的有益效果；3、本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條可批量生產(chǎn)，適用于臨床快速診斷和現(xiàn)場快速檢測，易于保存，適合在基層醫(yī)院的推廣使用。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1的膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明試驗例1中采用抗ngal-5抗體作為檢測抗體的相關(guān)性驗證結(jié)果；圖3為三批本發(fā)明實施例1的膠體金免疫層析試紙條的hook效應(yīng)試驗結(jié)果；附圖標記：1、樣品墊；2、金標墊；3、包被膜；4、檢測區(qū)；5、對照區(qū)；6、吸水紙；7、底板。具體實施方式以下通過附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。以下實施例中所使用的原料如無特殊說明，均來源于市售。實施例1檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法請參閱圖1，為本發(fā)明的檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，本實施例的檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條，包括底襯7、以及依次設(shè)在所述底襯7上的樣品墊1、金標墊2、包被膜3和吸水紙6，所述金標墊2上包被有膠體金標記的抗人ngal檢測抗體和膠體金標記的雞igy抗體，所述包被膜3包括平行設(shè)置、且相互間隔的檢測區(qū)4和對照區(qū)5，所述檢測區(qū)4包被有抗人ngal包被抗體，所述對照區(qū)5包被有山羊抗雞igy抗體，所述抗人ngal檢測抗體具有如seqidno:5的氨基酸序列。在本實施例中，所述膠體金標記的抗人ngal檢測抗體和膠體金標記的雞igy抗體的濃度分別為0.2mg/ml和0.2mg/ml，在所述金標墊2上的包被量均為1.2ul/cm。所述金標墊2上的膠體金顆粒直徑約為40nm。所述檢測區(qū)4靠近所述金標墊2，所述對照區(qū)5靠近所述吸水紙6，所述檢測區(qū)4和所述對照區(qū)5的間隔為0.4cm。所述抗人ngal包被抗體的濃度為2mg/ml，在所述檢測區(qū)4的包被量為1.2ul/cm。所述山羊抗雞igy抗體的濃度為0.7mg/ml，在所述對照區(qū)5的包被量為1.2ul/cm。本實施例的檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：(1)、膠體金制備取0.5-1.2％檸檬酸三鈉水溶液3ml于297ml三蒸水中，并搖勻加入500ml的圓底燒瓶中；將圓底燒瓶置于加熱套上加入合適大小的攪拌子攪拌；加熱至沸騰，且開始攪拌，并立刻計時；沸騰3分鐘時間，迅速加入3ml的0.5-0.8％氯金酸水溶液，攪拌器攪拌10分鐘之后將攪拌速度調(diào)低；將圓底燒瓶從加熱套中取出，放至放有防熱墊的操作臺；制備好的膠體金溶液室溫放置溫度降下來后，密封避光保存于4℃冰箱。磁力加熱攪拌器燒制的膠體金顆粒大小均一，直徑約為40nm；(2)、金標墊制備將金標墊鋪在鋪金工具里，15*20cm的金標墊中加入12ml的金標墊處理液；37℃鼓風干燥箱中干燥4小時以上至金標墊完全干燥；將處理干燥好的金標墊取出，用鋁箔袋密封。金標墊處理液：20-100mmtris-hcl、5％蔗糖、5％bsa、0.5％-1.0％檸檬酸三鈉和0.1％-0.15％曲拉通-100組成。按包被量1.2ul/cm的量，使用噴膜儀將濃度均為0.2mg/ml的膠體金標記的抗人ngal檢測抗體和膠體金標記的雞igy抗體噴于處理好的金標墊上并真空冷凍干燥備用；(3)、樣品墊制備將樣品墊平放在鋪金工具里；15*20cm的樣品墊中加入25ml的樣品墊處理液；用鋪金涂布均勻；37℃鼓風干燥箱中干燥4小時以上至樣品墊完全干燥。樣品墊處理液的配方為：20-100mmtris-hcl、5％蔗糖、5％bsa、0.5％-1.0％檸檬酸三鈉和0.1％-0.15％吐溫-20。(4)、包被膜的制備按包被量1.2ul/cm的量，使用噴膜儀將濃度為2mg/ml的抗人ngal包被抗體噴于包被膜的檢測區(qū)，按包被量1.2ul/cm的量，使用噴膜儀將濃度為0.7mg/ml的山羊抗雞igy抗體噴于包被膜的對照區(qū)，檢測區(qū)和對照區(qū)平行設(shè)置、相互間隔0.4cm。(5)、試紙條的組裝將吸水紙黏貼在底板的右側(cè)，底板的左側(cè)黏貼樣品墊，金標墊黏貼在樣品墊與包被膜交接處上面，然后在金標墊表面貼上薄膜膠，包裝。試驗例1抗ngal特異性抗體的制備根據(jù)ngal全蛋白序列設(shè)計不同肽段，免疫動物獲得特異性抗體，具體步驟如下：(1)、ngal天然蛋白的制備根據(jù)genbank中提供的人ngal的dna序列，設(shè)計一對引物，由兩個引物的5‘端分別引入ndei+xhoi酶切位點，通過pcr擴增得到ngal的目的基因，將載體pet-28a及經(jīng)過瓊脂糖凝膠純化的ngal目的基因片段，均用ndei+xhoi進行雙酶切處理，用t4dna連接酶將純化后酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pet-28a-ngal，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌dh5α，在含有氨芐青霉素的lb平板上挑選克隆，小量制備質(zhì)粒，通過雙酶切/pcr鑒定篩選出陽性克隆，測序結(jié)果表明重組的ngal片段與設(shè)計的序列完全一致。重組質(zhì)粒pet-28a-ngal經(jīng)測序驗證后，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌(bl21)，在含有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可在lb平板上挑選陽性克隆并進行質(zhì)粒酶切鑒定，小量制備質(zhì)粒，用雙酶切pcr鑒定篩選出陽性克隆，最終獲得含有ngal的重組質(zhì)粒工程菌。在表達時，將ngal的重組質(zhì)粒工程菌于含100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，a600達到0.5-0.6之間，然后加入終濃度為0.5mm的isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside(iptg)于37℃誘導(dǎo)4h，誘導(dǎo)完成后的菌液4,000rpm離心10min，收集菌體，并用pbs洗滌沉淀；pbs重懸沉淀后置于冰浴中，超聲破菌后12000rpm離心20min，上清和沉淀分別進行sds-page電泳，結(jié)果表明：表達的ngal重組蛋白為胞漿不可溶性表達，將該重組蛋白命名為bl21(de3)-ngal。將大量表達得到的菌體，經(jīng)超聲破碎后離心，再進行包涵體洗滌，洗滌完成后用gehealthcare公司的histrapff純化柱將蛋白進行純化(按照產(chǎn)品說明書進行試劑配制和純化)。最終獲得的蛋白用sds-page電泳進行分析，用bca蛋白定量試劑盒測得其濃度為0.23mg/ml。(2)、ngal肽段的制備首先將步驟1得到的ngal重組蛋白序列導(dǎo)入在線抗原表位設(shè)計軟件，將位于蛋白構(gòu)象外部氨基酸序列統(tǒng)計出來。再將全ngal蛋白序列導(dǎo)入dnastar軟件，通過抗原表位預(yù)測工具統(tǒng)計肽段組合。將兩組數(shù)據(jù)進行比對得出最有可能為抗原表位的7組肽段。通過上海吉爾生化生物公司合成7組肽段，具體序列如下：肽段1：nh2-cqdstsdlipapplskvplq(seqidno:1)肽段2：nh2-cilredkdpqkmyatiyel(seqidno:2)肽段3：nh2-ctfvpgcqpgeftlgniksy(seqidno:3)肽段4：nh2-csqnreyfkitlygrtkelts(seqidno:4)肽段5：nh2-capplskvplqqnfqdnqf(seqidno:5)肽段6：nh2-crtkeltselkenfirfsks(seqidno:6)肽段7：nh2-clpenhivfpvpidqcidg(seqidno:7)(3)、特異性抗體的制備與純化采用ngal天然蛋白以及上述7組肽段免疫8周齡、體重18g左右且健康的雌性balb/c小鼠各2只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采集陰性血作為對照用；采用中程免疫方案(0.3ml/只，2周/次)，首次免疫時(50μg/只)按免疫原與等體積的弗氏完全佐劑攪拌乳化，背部皮下多點注射，此后按免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑攪拌乳化進行常規(guī)免疫；3次免疫時，一般50μg抗原+titermax等量混合乳化后背部多點注射，7天后測效價。小鼠效價明顯達到一定要求后加強免疫，加強免疫不加佐劑，加強免疫劑量為50μg，加強免疫后3天，摘眼球采血，分離血清保存。同時取脾臟進行融合。細胞融合時，將脾細胞與骨髓瘤細胞按4:1左右進行混合，并在聚乙二醇(peg，分子量為1450)的促融作用下進行融合，融合細胞再hat選擇性培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，10天后通過間接elisa方法篩選出能與ngal天然蛋白反應(yīng)的陽性雜交瘤細胞，并將初篩得到的陽性雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，用有限稀釋法將獲得的陽性雜交瘤細胞連續(xù)亞克隆至少兩次以上，每次亞克隆用ht選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，亞克隆8-10天后進行elisa篩選，直至單克隆細胞陽性率為100％為止，獲得能穩(wěn)定分泌針對ngal天然蛋白與肽段的特異性抗體的單克隆細胞株。選擇8-12周齡雌性健康balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，0.5ml/只；7-10天后，給每只小鼠腹腔注射1×106～5×106個單克隆雜交瘤細胞，注意吹下細胞或稀釋細胞需用pbs或無血清培養(yǎng)基；將腹水10,000r/min離心15min，除去細胞成分和其他的沉淀物、脂肪以及油層等，收集中間層，測定抗體效價，分裝，置-70℃凍存?zhèn)溆?。飽和硫酸銨沉淀：吸取5ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，逐滴加入過0.22μm濾膜的pbs5.0ml；混合均勻后，再逐滴加入10ml飽和硫酸銨溶液(ph7.4)，繼續(xù)緩慢攪拌30min；靜置2h后10,000r/min離心15分鐘，棄去上清，沉淀物用過0.22μm濾膜的pbs重懸，然后再將該重懸液過0.22μm濾膜；根據(jù)抗體不同亞型，選定不同的gehealthcare公司的純化柱，收集抗體峰；用pbs緩沖液將抗體進行透析，用bca蛋白定量試劑盒測定抗體濃度，并將抗體分裝保存。(4)配對實驗，獲得針對天然ngal蛋白效價最高的抗體對由天然ngal蛋白作為抗原，天然蛋白制備的抗體作為捕獲抗體，而肽段制備的抗體作為檢測抗體。通過配對實驗(將100ng/100ul的捕獲抗體包被在96孔板中孵育；依次加入按遞度稀釋的天然ngal蛋白100ng,50ng,25ng,12.5ng,6.25ng,3.125ng,1.5625ng,以及空白對照pbs；再加入7組不同的檢測抗體以驗證其效價)檢測配對的抗體對。實驗結(jié)果如表1所示。表1配對實驗結(jié)果表1結(jié)果表明，由抗ngal-1抗體、抗ngal-2抗體、抗ngal-3抗體和抗ngal-6抗體(肽段1，2，3，6制備的抗體)作為檢測抗體，抗ngal抗體作為捕獲抗體可獲得針對天然ngal蛋白效價較高的抗體對。(5)、血清學(xué)驗證特異性抗體對采用抗ngal抗體作為捕獲抗體，抗ngal-1抗體，抗ngal-2抗體，抗ngal-3抗體，抗ngal-4抗體、抗ngal-5抗體、抗ngal-6抗體和抗ngal-7抗體作為檢測抗體分別測定了30例樣本并做了相關(guān)性分析，結(jié)果證明抗ngal-1抗體，抗ngal-2抗體，抗ngal-3抗體，抗ngal-6抗體對血清中的ngal識別比較弱，而且相關(guān)性均較低，普遍測定值比樣本真實值低的較多；經(jīng)過交叉配對后，篩選得到了一對對血清識別較好的抗體對：抗ngal抗體與抗ngal-5抗體，因此，說明肽段5(seqidno：5)為特異性較高的抗原表位。采用抗ngal-5抗體作為檢測抗體的相關(guān)性驗證結(jié)果如圖2所示，從圖2可知，采用抗ngal-5抗體與抗人ngal抗體的組合檢測，與醫(yī)院的檢測值的相關(guān)性一致，r2達到0.9853。試驗例2實施例1的膠體金免疫層析試紙條的性能檢測1、陰性參考品符合率1.1試驗方法將各批次的本發(fā)明實施例1的檢測試紙條分別各取5人份，每個批次檢測5份陰性參考品，每個陰性參考品樣本(混合健康人血清)測定1次，保證結(jié)果的正確，5～10min內(nèi)觀察結(jié)果，統(tǒng)計各檢測試紙條的陰性參考品符合率。1.2試驗結(jié)果如表2所示。表2陰性參考品符合率試驗結(jié)果批號5份陰性參考品顯色情況陰性參考品符合率2015001無顯色100％2015002無顯色100％2016001無顯色100％1.3試驗結(jié)論通過表2結(jié)果可見，檢測試紙條陰性參考品無顯色，符合率為100％。2、陽性參考品符合率2.1試驗方法將各批次的本發(fā)明實施例1的檢測試紙條分別各取3人份，對陽性參考品(經(jīng)校準的ngal重組蛋白)進行檢測，每個陽性參考品樣本測定1次，保證結(jié)果的正確，5～10min內(nèi)觀察結(jié)果，將各批次參考品顯色情況與相應(yīng)批次參考比色卡進行比較，統(tǒng)計顯色結(jié)果一致性，從而統(tǒng)計各檢測試紙條的陽性參考品符合率。2.2試驗結(jié)果如表3所示。表3陽性參考品符合率試驗結(jié)果2.3試驗結(jié)論通過表3結(jié)果可見，本發(fā)明實施例1的檢測試紙條的陽性參考品顯色與參考比色卡一致，符合率為100％。3、最低檢測限3.1驗證最低檢測限試驗方法從2015001產(chǎn)品隨機抽取10人份試紙條，取陽性參考品(經(jīng)校準的ngal重組蛋白，100ng/ml)，采用陰性新生牛血清做為稀釋液將陽性參考品(100ng/ml)逐級稀釋至60ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、0(稀釋液)。用實施例1的檢測試紙條對以上樣品(60ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、0(稀釋液)進行檢測，以上實驗重復(fù)2次，最低檢測限以試紙條檢測線能顯示結(jié)果的ngal最低濃度值來表示。3.2最低檢測限重復(fù)試驗方法各批次的本發(fā)明實施例1的檢測試紙條分別取20人份，對最低檢測限進行檢測，5～10min內(nèi)觀察結(jié)果，顯色情況與相應(yīng)批次參考比色卡進行比較，應(yīng)都能顯色，且顯色一致。3.3試驗結(jié)果如表4和表5所示。表4最低檢測限檢測結(jié)果表5最低檢測限重復(fù)檢測結(jié)果3.4試驗結(jié)論經(jīng)以上表4和表5的最低檢測限檢測結(jié)果，本發(fā)明實施例1的檢測試紙條的最低檢測限為30ng/ml。4、干擾物質(zhì)試驗4.1干擾物質(zhì)檢測試驗方法采用陰性新生牛血清將三種干擾物質(zhì)膽紅素、血紅蛋白及甘油三酯配制成濃度為1mg/ml的溶液，用本發(fā)明實施例1的檢測試紙條進行檢測，觀察以上三種干擾物質(zhì)添加在陰性樣本中對陰性樣本檢測結(jié)果的影響。4.2干擾物質(zhì)驗證試驗方法配制膽紅素濃度400μg/ml、血紅蛋白濃度100μg/ml、甘油三酯濃度100μg/ml，用三批試紙條檢測，5～10min內(nèi)觀察顯色情況。4.3試驗結(jié)果如表6～9所示。表6膽紅素干擾檢測結(jié)果表7血紅蛋白干擾檢測結(jié)果表8甘油三酯干擾檢測結(jié)果表9干擾驗證檢測結(jié)果4.4試驗結(jié)論以上表6～9干擾性試驗檢測結(jié)果表明，膽紅素低于400μg/ml時不影響檢測結(jié)果；血紅蛋白濃度低于100μg/ml時不會影響檢測結(jié)果；甘油三酯濃度低于100μg/ml時不會影響檢測結(jié)果。5、hook效應(yīng)5.1試驗方法將ngal校準抗原(美國raybiotech公司)分別添加至陰性新生牛血清中，得到以下濃度的溶液：10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml、1200ng/ml、1500ng/ml，用本發(fā)明實施例1的檢測試紙條進行檢測，將檢測校準抗原的濃度作為x軸，以試紙條在5～10min內(nèi)顯色的強度(用數(shù)值表示)作為y軸，做曲線，觀察產(chǎn)生高劑量hook效應(yīng)的檢測濃度。5.2試驗結(jié)果如圖3所示。5.3試驗結(jié)論通過圖3結(jié)果可見，本發(fā)明的檢測試紙條在不超過1000ng/ml情況下不會觀察到高劑量hook效應(yīng)。6重復(fù)性6.1試驗方法從每批試紙條中隨機抽樣20條，分別加入高濃度精密性參考品(300ng/ml)，重復(fù)測定10次；加入低濃度精密性參考品(100ng/ml),重復(fù)測定10次，保證結(jié)果的正確，5～10min內(nèi)觀察結(jié)果。將各批次高、低濃度精密性參考品顯色情況與相應(yīng)批次的高、低濃度精密性參考比色卡進行比較，統(tǒng)計顯色結(jié)果一致性從而統(tǒng)計各批次內(nèi)試紙條的重復(fù)性。6.2試驗結(jié)果如表10所示。表10重復(fù)性檢測結(jié)果6.3試驗結(jié)論3個批次的檢測試紙條的低、高濃度精密性參考品重復(fù)檢測10次，都與參考比色卡顯色條帶顯色一致。試驗例3本發(fā)明實施例1的檢測試紙條的臨床性能驗證本試驗例共收集尿液樣本135例，其中陽性樣本(對照試劑檢測＞100ng/ml)33例，陰性檢測(對照試劑檢測＜30ng/ml)102例。用本發(fā)明實施例1的檢測試紙條與已上市的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白測定試紙條對收集的135份尿液樣本分別進行檢測，匯總檢測結(jié)果。用四格表分析135份數(shù)據(jù)的陰陽性符合率、約登指數(shù)，并進行kappa檢驗，評價本發(fā)明實施例1的檢測試紙條與對照試紙條的一致性。結(jié)果如表11所示。表11臨床性能驗證結(jié)果從表11，計算結(jié)果如下：陽性樣本符合率(真陽性率)＝33/33×100％＝100％陰性樣本符合率(真陰性率)＝102/102×100％＝100％假陽性率＝0/76×100％＝0假陰性率＝0/34×100％＝0總符合率＝135/135×100％＝100％約登指數(shù)＝33/33+102/102-1＝1kappa值＝1，>0.75，說明本發(fā)明實施例1的檢測試紙條與對照試紙條一致性很好。檢測結(jié)果符合率＝(總樣本數(shù)-差異樣本數(shù))/總樣本數(shù)×100％＝(135-0)/135×100％＝100％從以上數(shù)據(jù)可以看出，采用本發(fā)明實施例1的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(ngal)檢測試紙條(膠體金法)進行臨床驗證，以已上市的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白測定試紙條(膠乳增強免疫比濁法)為對照，共檢測尿液樣本135例(其中陽性33例，陰性102例)，整理并分析檢測結(jié)果，評價試劑盒的臨床性能，陽性符合率為100％，陰性符合率為100％，總符合率為100％，約登指數(shù)為1。kappa值為1(kappa檢驗，p<0.05)，檢測結(jié)果符合率為100％，本發(fā)明實施例1的檢測試紙條與對照試紙條有很好的一致性?？己私Y(jié)果表明本發(fā)明實施例1的檢測試紙條與對照試紙條檢測性能相仿，穩(wěn)定性好，結(jié)果較為準確可靠。試紙條操作簡單方便，且成本較進口試紙條價格低廉，具有很好的市場應(yīng)用價值。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。序列表＜110＞廣州瑞博奧生物科技有限公司＜120＞檢測人ngal的膠體金免疫層析試紙條、試劑盒及其制備方法＜130＞7＜170＞patentinversion3.1＜210＞1＜211＞20＜212＞pro＜213＞人工序列＜400＞1cys-gln-asp-ser-thr-ser-asp-leu-ile-pro-ala-pro-pro-leu-ser-lys-val-pro-leu-gln5101520＜210＞2＜211＞19＜212＞pro＜213＞人工序列＜400＞2cys-ile-leu-arg-glu-asp-lys-asp-pro-gln-lys-met-tyr-ala-thr-ile-tyr-glu-leu5101519＜210＞3＜211＞20＜212＞pro＜213＞人工序列＜400＞3cys-thr-phe-val-pro-gly-cys-gln-pro-gly-glu-phe-thr-leu-gly-asn-ile-lys-ser-tyr5101520＜210＞4＜211＞23＜212＞pro＜213＞人工序列＜400＞4cys-ser-gln-asn-arg-glu-tyr-phe-lys-ile-tyr-leu-tyr-leu-tyr-gly-arg-thr-lys-glu-5101520leu-thr-ser23＜210＞5＜211＞19＜212＞pro＜213＞人工序列＜400＞5cys-ala-pro-pro-leu-ser-lys-val-pro-leu-gln-gln-asn-phe-gln-asp-asn-gln-phe5101519＜210＞6＜211＞20＜212＞pro＜213＞人工序列＜400＞6cys-arg-thr-lys-glu-leu-thr-ser-glu-leu-lys-glu-asn-phe-ile-arg-phe-ser-lys-ser5101520＜210＞7＜211＞19＜212＞pro＜213＞人工序列＜400＞7cys-leu-pro-glu-asn-his-ile-val-phe-pro-val-pro-ile-asp-gln-cys-ile-asp-gly5101519當前第1頁12