本發(fā)明涉及抗CD4的抗體及抗CXCR5的抗體的新用途，具體涉及抗CD4的抗體及抗CXCR5的抗體在評估慢性移植物抗宿主病患者病情嚴重程度中的應用。
背景技術：
：慢性移植物抗宿主病(cGVHD)是一種表現(xiàn)為多形性自身免疫性疾病樣綜合癥，導致口腔、眼睛、皮膚、肺及肝臟等多器官組織慢性炎癥及纖維化樣病理損傷；異基因造血干細胞移植術后患者cGVHD的發(fā)病率高達30-70％，5年生存率約30-50％，是異基因造血干細胞移植術后的主要并發(fā)癥和非復發(fā)死亡的主要原因。慢性移植物抗宿主病的發(fā)病機制主要涉及慢性炎癥，細胞免疫，體液免疫及纖維化，異基因造血干細胞移植后1年內的絕大部分患者都有不同程度cGVHD的臨床表現(xiàn)，而中重度cGVHD嚴重影響患者的生活質量。目前對于cGVHD的診斷及病情評估主要根據(jù)NIH工作組的標準，見表1：NIHcGVHD器官或部位評分及積分系統(tǒng)表1注：肺部評分要同時兼顧癥狀和肺功能檢查，當兩者不一致時，選擇評分高者。選擇肺功能評分更好，但如果不能檢查DLCO，應該檢查FEV1。FEV1和DLCO的評分如下：＞80％＝1，70～79％＝2，60～69％＝3，50～59％＝4,40～49％＝5，＜40％＝6，肺功能評分＝FEV1評分+DLCO評分，范圍在2～12分。至少有一個慢性GVHD診斷特征和一個特有的表現(xiàn)，并排除感染及其他原因如在cGVHD并發(fā)癥中甲癬有關的指甲發(fā)育不良，單純皰疹，口腔白色念珠菌感染，藥物中毒等。對于cGVHD的嚴重程度的評估，盡管該評估方式系統(tǒng)全面，但主觀性較強且復雜繁瑣，對醫(yī)務人員的臨床經(jīng)驗要求較高。當前對cGVHD發(fā)病機制的尚不明確，缺乏疾病診斷評估的生物學標志，使得cGVHD的診斷及病情評估仍是一個重大的挑戰(zhàn)。目前對于cGVHD的治療藥物主要包括皮質激素及免疫抑制劑?，F(xiàn)有的治療方式以非選擇性抑制T細胞或清除B細胞為主，非靶向治療導致惡性疾病復發(fā)、反復嚴重感染、繼發(fā)第二腫瘤以及cGVHD病情遷延反復，嚴重影響患者的生活質量。目前臨床上對皮質激素及免疫抑制劑的劑量調整主要根據(jù)NIH評分標準，缺乏療效評估的直接生物學指標，嚴重影響患者的治療。綜上所述，盡管我們對cGVHD的診斷和治療有一定的認識，但是缺乏應用直接指標通過免疫細胞的變化水平來評估疾病，這對于指導用藥，評估藥物療效至關重要，其研制工作勢在必行。大量研究證實B細胞作為免疫應答鏈中的抗原提呈細胞和效應細胞，在cGVHD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。B細胞活化及功能實施依賴于T細胞的輔助，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，定位于淋巴濾泡，持續(xù)表達CXCR5的濾泡輔助性T細胞是B細胞的主要輔助細胞，在啟動體液免疫應答中發(fā)揮重要作用。Tfh細胞最早于2000年被Sehaerli與Breitfeld等幾乎同時在扁桃體中發(fā)現(xiàn)并命名為tfh細胞，2008年，King等確定它是淋巴組織中最重要的效應T細胞亞群之一，主要分布于淋巴組織中，該細胞在淋巴組織中過量表達則會引起自身免疫性疾病，并與靶器官受累嚴重程度有很大關系，2016年，EdouardForcade等發(fā)現(xiàn)活動期cGVHD患者CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞比例顯著高于正常對照組，且cGVHD患者循環(huán)Tfh細胞歸巢至繼發(fā)性淋巴器官的數(shù)量顯著增多。本發(fā)明研究人員研究發(fā)現(xiàn)，中重度cGVHD患者外周血淋巴細胞中低表達CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞，該群細胞可通過流式細胞術檢測出來，并與現(xiàn)有的疾病嚴重程度有極強的相關性，可直接了解患者體內的免疫細胞失衡狀況，對于中重度cGVHD的治療有極高的指導意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供抗CD4的抗體和抗CXCR5的抗體的新用途。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：抗CD4的抗體及抗CXCR5的抗體在制備評估慢性移植物抗宿主病中的試劑中的應用。所述抗CD4的抗體為商購的單克隆抗體或體外培養(yǎng)分泌的抗CD4的單克隆抗體的雜交瘤細胞得到的單克隆抗體。所述抗CD4的抗體為購自ebiscience或Biolegend公司的單克隆抗體。4、根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于：所述抗CXCR5的抗體為商購的單克隆抗體或體外培養(yǎng)分泌的抗CXCR5的單克隆抗體的雜交瘤細胞得到的單克隆抗體。所述抗CXCR5的抗體為購自ebiscience或Biolegend公司的單克隆抗體。本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)cGVHD患者及正常人外周血淋巴細胞中可檢測到表達具有CD4，CXCR5等標志性表面分子的循環(huán)Tfh細胞。我們的研究證明，CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞在中重度cGVHD患者的淋巴細胞中比例明顯減少。若移植后患者淋巴細胞中CD4+CXCR+循環(huán)Tfh細胞表達降低明顯，提示患者可能出現(xiàn)中重度排斥反應。因此檢測CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞可以作為免疫細胞標志物，正確判斷中重度的cGVHD，直接反應異常的免疫細胞狀態(tài)，對于臨床治療具有重要的指導意義。本發(fā)明的目的是提供抗CD4抗體及抗CXCR5抗體作為評價cGVHD嚴重程度的衡量指標，指導臨床治療?；谝陨涎芯?，本研究發(fā)明人用流式細胞學方法檢測正常人和異基因造血干細胞移植術后患者外周血中CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞，通過簡便有效的細胞免疫學方法確定疾病的病情嚴重程度，指導臨床治療。附圖說明圖1a～圖1c為流式結果顯示正常人及異基因造血干細胞移植術后患者外周血淋巴細胞中CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞的比例示意圖其中，圖1a：HC健康對照組；圖1b：mildcGVHD輕度cGVHD；圖1c：moderate&severveGVHD中重度cGVHD。圖2是CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞比例在健康對照者、移植后輕微cGVHD患者及中重度cGVHD患者外周血中的比例示意圖。(P均<0.05)。具體實施方式1、以下實施例的所有cGVHD患者的疾病分層均根據(jù)NIHcGVHD器官或部位評分及積分系統(tǒng)(見上文表1)。NIH全球cGVHD積分系統(tǒng)是NIH工作組根據(jù)受累器官或部位的數(shù)目與各個器官/部位受累嚴重程度所制訂的全球cGVHD積分系統(tǒng)，詳見下表2：表2器官/部位數(shù)目輕度cGVHD中度cGVHD重度cGVHD1個積分1積分2積分32個積分1積分2積分33個積分1積分3肺受累積分1積分2注：積分0＝無癥狀，積分1＝輕微癥狀，積分2＝中度癥狀，積分3＝嚴重癥狀。輕度cGVHD累及1個或2個器官(肺除外)，各器官中受累程度最大積分為1，中度cGVHD累及1個或2個器官，或3個及更多的最大的積分為1的器官，或肺受累積分為1。重度cGVHD累及至少一個嚴重程度為3的器官，或肺受累積分為2。2、CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞的具體檢測方法：使用流式細胞技術檢測CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞，其操作流程如下：取外周血100ul，淋巴細胞約為1～3×105個，標記熒光抗體CD4-FITC(ebioscience)5ul/test，CXCR5-APC-cy7(biolegend)5ul/test，渦旋混勻，室溫避光孵育25分鐘，加入1×紅細胞裂解液3mL，稍混勻，室溫避光放置10分鐘，300g離心5min，棄上清液，加入1mlPBS，300g離心5min，棄上清液，加入400ulPBS上機檢測。應用BDCantoII流式細胞儀檢測淋巴細胞中CD4+CXCR5+的細胞表達比例。本研究表明：CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞在中重度cGVHD患者外周血中低表達，明顯低于正常對照組及輕度cGVHD患者，對中重度cGVHD患者的確定具有重要的意義。本研究通過流式細胞術檢測各組CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞的表達率，各組檢測示意圖見圖1a～圖1c(三組圖中方框內所圈細胞群體即為CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞)。本研究共檢測29例正常人，35例輕度cGVHD患者及36例中重度cGVHD患者外周血淋巴細胞中循環(huán)Tfh細胞的比例。以低于正常人的均數(shù)－SD定義為陽性界點。本研究用FACS方法檢測了CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞在各組病人及正常人的陽性率，見表3：CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh細胞在不同嚴重程度cGVHD患者中表達陽性率的比較。應用X2檢驗比較各組數(shù)據(jù)，結果顯示，CD4+CXCR5+循環(huán)Tfh在中重度cGVHD患者中的陽性率顯著高于正常人及輕度cGVHD患者，P均<0.05。表3當前第1頁1 2 3