一種定量檢測試劑盒的制作方法

本實用新型涉及生物化學及分子生物學領域，具體涉及一種定量檢測試劑盒，適用于各種DNA的定量檢測。
背景技術：
：在分子生物學領域進行DNA分析時常常需要對DNA進行準確定量。在臨床診斷方面，病毒DNA的定量檢測是臨床診斷的重要依據。SYBRGreenI是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBRGreenI的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。SYBRGreenI核酸凝膠染液是一種高敏感性的熒光染液，可用于檢測瓊脂糖凝膠及聚丙烯酰胺凝膠中的雙鏈DNA和寡核苷酸。當染液與核酸結合后，SYBRGreenI核酸凝膠染液的熒光信號會明顯增強，因此經SYBRGreenI核酸凝膠染液染色的凝膠顯示出非常好的性價比，沒有背景熒光。目前，常規(guī)利用SYBRGreenI熒光染料檢測DNA含量的方法存在以下方面的不足：1、PCR擴增過程中SYBRGreenI熒光染料與DNA結合的方法存在非特異性擴增導致定量不準確的風險；2、SYBRGreenI熒光染料直接作用于樣本存在對樣本含量、檢測儀器靈敏度要求高的問題，檢測成本較高，而且樣本中其他雜質也會對檢測結果造成一定影響，導致定量不準確。技術實現要素：針對以上現有技術問題，本實用新型的目的在于提供一種定量檢測試劑盒，排出了樣本中其他雜質和非特異性擴增產物對最終檢測結果的影響，更準確、低成本的完成DNA含量的定量檢測，包括以下步驟：粗濾；瓊脂糖凝膠電泳；DNA回收；SYBRGreenI熒光染色；檢測及結果分析。該方法利用簡化的DNA回收方法得到高純度的DNA，再通過SYBRGreenI染色和紫外分光光度計檢測熒光，計算分析得到DNA濃度。具體技術方案如下：一種定量檢測試劑盒，包括盒體，支架，第一EP管以及第二EP管，其中，所述盒體內設置支架；所述支架上設有4-6個管架；所述第一EP管設置于第一管架上，所述第一EP管底部設有鉆孔，管內設有定性濾紙；所述第二EP管設置于第二管架上，所述第二EP管底部設有鉆孔，管內設有定性濾紙；所述第一EP管為0.5ml或1.5ml容量的EP管，所述第二EP管為0.5ml或1.5ml容量的EP管。還包括盒蓋，所述盒蓋一側連接至盒體并用于扣合盒體。還包括第三EP管，第四EP管，第五EP管以及第六EP管，分別設置于支架的第三管架，第四管架，第五管架以及第六管架上。上述定量檢測DNA含量的SYBRGreenI定量檢測試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：(1)粗濾；(2)瓊脂糖凝膠電泳；(3)DNA回收；(4)SYBRGreenI熒光染色；(5)檢測；(6)結果分析。進一步地，步驟(1)中包括：(1-1)取待測樣品放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(1-2)將套好的EP管離心，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體全部進行瓊脂糖凝膠電泳。進一步地，步驟(2)中包括：(2-1)配膠；(2-2)電泳準備；(2-3)上樣；(2-4)電泳。進一步地，步驟(3)中包括：(3-1)將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(3-2)將套好的EP管離心，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體定容；(3-3)加入NaAc和無水乙醇，冷凍；沉淀干燥后溶于TE溶液。進一步地，步驟(4)中包括：(4-1)加入與DNA復溶液等體積的稀釋好的SYBRGreenI工作液，混勻；(4-2)放置30分鐘左右。進一步地，步驟(5)中包括：(5-1)將染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度計上，260nm波長處分別讀取熒光值A260；(5-2)根據WdsDNA＝A260×50μg/ml公式換算待測樣品中目的DNA含量。進一步地，(2-1)配膠：根據基因組片段大小，配置相應濃度的瓊脂糖凝膠；取適量的瓊脂和TAE緩沖液至錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，放入微波爐煮，煮好的凝膠應無氣泡、色澤均勻；將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，加入適量的SYBRGreenI熒光染料，及時將凝膠倒入裝好的干凈電泳模具中；待凝膠完全凝固后，小心的將梳子拔出；(2-2)電泳準備：把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負極，往電泳槽中倒入一定量的TAE緩沖液至剛好將凝膠淹沒；(2-3)上樣：將樣品、6×溴酚藍按5：1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣；(2-4)電泳：上樣后，蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，設置電泳參數：120V30min。本實用新型方法操作簡便、成本低廉、準確度高。附圖說明圖1為已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管示意圖圖2為套入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5mlEP的1.5ml的EP管示意圖圖3為定量檢測DNA含量的SYBRGreenI定量檢測試劑盒具體實施方式下面根據附圖對本實用新型進行詳細描述，其為本實用新型多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。在一個優(yōu)選實施例中，一種定量檢測DNA含量的SYBRGreenI定量檢測試劑盒及其檢測方法，進一步地包括以下步驟：(1)粗濾：①取待測樣品100μl，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；②將套好的EP管在4℃10000rpm下離心10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體全部進行瓊脂糖凝膠電泳；(2)瓊脂糖凝膠電泳：①配膠：根據基因組片段大小，配置相應濃度的瓊脂糖凝膠。取適量的瓊脂和TAE緩沖液至錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，放入微波爐煮，煮好的凝膠應無氣泡、色澤均勻。將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，加入適量的SYBRGreenI熒光染料，及時將凝膠倒入裝好的干凈電泳模具中。待凝膠完全凝固后，小心的將梳子拔出；②電泳準備：把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負極，往電泳槽中倒入一定量的TAE緩沖液至剛好將凝膠淹沒；③上樣：將樣品、6×溴酚藍按5：1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣；④電泳：上樣后，蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，設置電泳參數：120V30min；(3)DNA回收：①將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；②將套好的EP管在4℃10000rpm下離心10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體用移液槍定容；③加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍體積的無水乙醇，在-20℃冷凍30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。(4)SYBRGreenI熒光染色：①加入與DNA復溶液等體積的稀釋好的SYBRGreenI工作液(稀釋比例根據SYBRGreenI的說明書)，混勻；②放置30分鐘。(5)檢測及結果分析：①將染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度計上，260nm波長處分別讀取熒光值A260；②根據WdsDNA＝A260×50μg/ml公式換算待測樣品中目的DNA含量。粗濾步驟①取待測樣品100μl，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；DNA回收步驟①將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；DNA回收步驟②將套好的EP管在4℃10000rpm下離心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體用移液槍定容；DNA回收步驟③加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍體積的無水乙醇，在-20℃冷凍30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。在另一個優(yōu)選實施例中，一種SYBRGreenI熒光染料定量檢測DNA含量的方法，通過粗濾、瓊脂糖凝膠電泳、DNA回收、SYBRGreenI熒光染色、檢測及結果分析完成待測樣品DNA的定量檢測，具體包括以下步驟：1、粗濾：(1)取待測樣品100μl，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(2)將套好的EP管在4℃10000rpm下離心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體全部進行瓊脂糖凝膠電泳；2、瓊脂糖凝膠電泳：(1)配膠：根據基因組片段大小，配置相應濃度的瓊脂糖凝膠。取適量的瓊脂和TAE緩沖液至錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，放入微波爐煮，煮好的凝膠應無氣泡、色澤均勻。將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，加入適量的SYBRGreenI熒光染料，及時將凝膠倒入裝好的干凈電泳模具中。待凝膠完全凝固后，小心的將梳子拔出；(2)電泳準備：把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負極，往電泳槽中倒入一定量的TAE緩沖液至剛好將凝膠淹沒；(3)上樣：將樣品、6×溴酚藍按5：1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣；(4)電泳：上樣后，蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，設置電泳參數：120V30min；3、DNA回收：(1)將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(2)將套好的EP管在4℃10000rpm下離心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體用移液槍定容；(3)加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍體積的無水乙醇，在-20℃冷凍30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。4、SYBRGreenI熒光染色：(1)加入與DNA復溶液等體積的稀釋好的SYBRGreenI工作液(稀釋比例根據SYBRGreenI的說明書)，混勻；(2)放置30分鐘。5、檢測及結果分析：(1)將染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度計上，260nm波長處分別讀取熒光值A260；(2)根據WdsDNA＝A260×50μg/ml公式換算待測樣品中目的DNA含量。應用本實用新型檢測待測樣品A中基因片段長度約1kb的DNA含量，同時設定一組已知DNA濃度(30ng/μl)的標準對照，經過粗濾和瓊脂糖凝膠電泳，再經過DNA回收、SYBRGreenI熒光染色和檢測及結果分析，測得結果如表2：樣本名稱A260DNA含量待測樣品A0.0170.85ng/μl標準對照0.59829.9ng/μl表2如圖1所示，該EP管包含已在底部鉆好孔的0.5ml的EP21和定性濾紙22。如圖2所示，該EP管包含已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管31和1.5ml的EP管32。如圖3所示，該試劑盒包括圖1所示的已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管41和圖2所示的套入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5mlEP的1.5ml的EP管42。當前第1頁1 2 3