一種電化學免疫傳感器及其制備方法和應用與流程

本發(fā)明涉及電化學電極材料制備技術領域，具體涉及一種電化學免疫傳感器的制備方法，以及所制備的傳感器在檢測人體尿液中萊克多巴胺的應用。

背景技術：

電化學免疫傳感器將免疫反應的高特異性與電化學分析的高靈敏度相結合，因其樣品消耗量小、靈敏度高及儀器廉價等優(yōu)點，成為臨床、生物醫(yī)藥、環(huán)境化學以及食品安全分析中一種有力的分析手段。其中，電極修飾是制備免疫電化學傳感器的關鍵所在。傳統(tǒng)的電極修飾方法需要對電極表面進行層層修飾，過程繁瑣，靈敏度低，新型的修飾方法有待開發(fā)。

janus是古羅馬神話中具有前后兩張臉的神，分別代表過去和將來。1991年degenne在諾貝爾獲獎致辭中首次應用它來表示微粒同時具有兩種不同特性。這一術語后用來表示具有各向異性的非中心對稱的顆粒，即janusparticles。janus粒子不僅在形狀和外觀上呈現(xiàn)各向異性，在化學組成及性能方面也呈現(xiàn)非對稱性。如janus粒子的兩個半球面可以同時攜帶表面親/疏水的化學物質(zhì)，利用janus粒子的這種特性雙親性可以用來對玻碳電極表面進行修飾，從而開發(fā)一種新型的電極修飾方法，制備一種新型電化學免疫傳感器。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種電化學免疫傳感器及其制備方法和應用，該傳感器應具有高的靈敏度和選擇性，電極修飾過程更加簡便，且具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，該傳感器可以應用于人體尿液中萊克多巴胺的檢測。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種電化學免疫傳感器，是以適配體/十八硫醇作為功能化基團制備具有獨特親水/疏水性的janus粒子，并用其修飾玻碳電極表面制得到。

本發(fā)明提供的一種電化學免疫傳感器的制備方法，步驟包括：

(1)按體積比10-15:1將濃度為1mmol/l的氯金酸溶液加入帶有回流裝置的燒瓶中，攪拌，加熱到沸騰，然后快速加入濃度為38-40mmol/l的檸檬酸鈉溶液，回流直到溶液變?yōu)榫萍t色；將燒瓶移出熱源，繼續(xù)攪拌，冷卻至室溫，制得納米金溶液，0-5℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)用50％-70％的濃硫酸，20％-30％的雙氧水，按體積比3-4:1配置piranha溶液，將硅片置入溶液中，在70-90℃下加熱煮沸10-20分鐘，清除硅片表面的雜質(zhì)，取出，用超純水沖洗干凈，備用；

(3)按體積比1:1-1.2將質(zhì)量分數(shù)1-2％的氨基聚苯乙烯微球水溶液分散在無水乙醇中；將分散后的ps微球超聲20-40s；在玻璃培養(yǎng)皿中加入超純水，將處理過的ps微球溶液緩慢滴加在超純水的表面，加入少量十二烷基磺酸鈉溶液使ps微球排列為緊密單層；用步驟(2)制備的硅片撈出排列為單層的ps微球，并使其負著在硅片表面，干燥后備用；

(4)用真空熱蒸鍍儀在步驟(3)制備的單層排列的ps微球的上表面蒸鍍金層，使金層厚度為20-30nm，將其迅速浸入1×10^-3-2×10^-3mol/l十八硫醇溶液中，3-6小時后，用超純水沖洗硅片，除去吸附松散的十八硫醇；用超聲波把修飾好的ps微球從硅片上脫離下來使其分散在超純水中，制備得到janus粒子溶液，保存?zhèn)溆茫?/p>

(5)將步驟(4)得到的janus粒子溶液超聲，使其在溶液中分散均勻，然后吸取分散均勻的janus粒子溶液緩慢滴加在玻碳電極表面，用紅外燈烤干，用超純水輕輕沖洗，除去吸附松散的janus粒子，得到janus粒子修飾電極；

(6)將步驟(5)得到的janus粒子修飾電極在步驟(1)制得的納米金溶液中浸泡1-3時間，用超純水沖洗，除去吸附松散的納米金顆粒，吹干備用；

(7)將步驟(6)處理的janus粒子修飾電極浸泡在萊克多巴胺適配體溶液中，2-10℃下過夜，吹干備用；

(8)將步驟(7)處理的janus粒子修飾電極浸泡在bsa溶液中2-4小時，用超純水沖洗，除去表面吸附松散的bsa，吹干，浸入ph6-8的緩沖液中，備用。

所述的步驟(1)中優(yōu)選條件：檸檬酸鈉的濃度為38.8mmol/l，回流時間15分鐘，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的步驟(2)中優(yōu)選條件：濃硫酸的濃度為70％，雙氧水的濃度為30％，按體積比3:1配置piranha溶液，將硅片置入溶液中，在85℃下加熱煮沸15分鐘。

所述的步驟(3)中優(yōu)選條件：按體積比1:1將質(zhì)量分數(shù)2％的聚苯乙烯微球水溶液分散在無水乙醇中；將分散后的ps微球超聲30s；十二烷基磺酸鈉溶液的濃度為2wt％。

所述的步驟(4)中蒸鍍的金層厚度優(yōu)選為25nm，十八硫醇的濃度優(yōu)選為1×10^-3mol/l，浸泡時間優(yōu)選為4小時。

所述的步驟(5)中超聲時間優(yōu)選為30秒。

所述的步驟(6)中浸泡時間優(yōu)選為2小時。

所述的步驟(8)中bsa溶液濃度優(yōu)選為0.25％，浸泡時間優(yōu)選為2小時，緩沖溶液ph優(yōu)選為7.4。

本發(fā)明方法制備的電化學免疫傳感器可用于檢測人體尿液中的萊克多巴胺。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)以適配體/十八硫醇制備janus粒子，將其修飾在玻碳電極表面，提高了電極的靈敏度且使電極修飾過程更加簡單。

(2)制得的電化學免疫傳感器，將其用于構建實際人體尿液中檢測萊克多巴胺的傳感體系，可以顯著提高免疫電極的選擇性。本發(fā)明制備得到的電化學免疫傳感器可檢測實際人體尿液中的萊克多巴胺。

(3)制得的電化學免疫傳感器，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，是對janus粒子獨特性質(zhì)的開發(fā)和應用，也為未來萊克多巴胺的檢測提供了新的思路。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器的修飾過程。

圖2為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器用掃描電鏡表征janus粒子。

圖3為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器掃描電鏡表征圖像。

圖4為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器用循環(huán)伏安法表征電極修飾過程。

圖5為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器免疫電極在不同掃描速度下的循環(huán)伏安圖。

圖6為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器免疫電極隨在萊克多巴胺溶液中孵育時間的變化其陽極峰電流的變化。

圖7為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器用循環(huán)伏安法表征不同ph下免疫電極對于萊克多巴胺檢測的影響。

圖8為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器用差分脈沖法表征免疫電極在不同濃度萊克多巴胺溶液中的檢測。

圖9為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器萊克多巴胺濃度與峰電流的線性關系。

圖10為本發(fā)明制備電化學免疫傳感器用差分脈沖法峰電流表征免疫電極選擇性。

具體實施方式

本發(fā)明是以適配體/十八硫醇作為功能化基團合成具有獨特親水/疏水性的janus粒子，并用以修飾玻碳電極表面，制備一種電化學免疫傳感器，并用于人體尿液中萊克多巴胺的檢測。下面通過實施例結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

以janus粒子修飾玻碳電極的電化學免疫傳感器的制備：

(1)將150ml濃度為1mm的氯金酸溶液加入帶有回流裝置的燒瓶中，攪拌，加熱到沸騰，然后快速加入15ml濃度為38.8mm檸檬酸鈉溶液，回流15分鐘直到溶液變?yōu)榫萍t色。將燒瓶移出熱源，繼續(xù)攪拌，冷卻至室溫，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取濃度為30％的雙氧水，用70％的濃硫酸，30％的雙氧水配置piranha溶液，將硅片置入溶液中，在85℃下加熱煮沸15分鐘，清除硅片表面的雜質(zhì)，取出，用超純水沖洗干凈，備用；

(3)將200μl2wt％氨基聚苯乙烯微球分散在200μl乙醇溶液中。將稀釋后ps微球超聲30s。在玻璃培養(yǎng)皿中加入超純水，將處理過的ps微球溶液緩慢滴加在超純水的表面，加入10μl2wt％十二烷基磺酸鈉溶液。用步驟(2)制備的硅片撈出排列為單層的ps微球，干燥后備用；

(4)用真空熱蒸鍍儀在步驟(3)制備的單層排列的ps微球的上表面蒸鍍金層，使金層厚度為25nm，將其迅速浸入1×10^-3mol/l十八硫醇溶液中浸泡4小時，用超純水沖洗硅片，除去吸附松散的十八硫醇。用超聲波把修飾好的粒子從硅片上脫離下來使其分散在超純水中，制備得到janus粒子，溶液保存?zhèn)溆茫?/p>

(5)將步驟(4)得到的janus粒子溶液超聲30秒，使其在溶液中分散均勻，然后吸取10μl緩慢滴加在玻碳電極表面，用紅外燈烤干，用超純水輕輕沖洗，除去吸附松散janus粒子。

(6)將步驟(5)中janus粒子修飾電極在步驟(1)制得的納米金溶液中浸泡兩小時，用超純水沖洗，除去吸附松散的金納米顆粒，吹干備用。

(7)將步驟(6)制得的電極浸泡在萊克多巴胺適配體溶液中，4℃下過夜，吹干備用；

(8)將步驟(7)制得的電極浸泡在0.25wt％的bsa溶液中兩小時，用超純水沖洗，除去表面吸附松散的bsa，吹干，浸入ph7.4的緩沖液中，備用。

制備的免疫電化學傳感器修飾過程示意圖見圖1。

實施例2

用真空熱蒸鍍技術在聚苯乙烯微球的一面蒸鍍了25nm的金層用來制備janus粒子。對所制備的janus粒子使用掃描電鏡進行觀察。如圖2所示，掃描電鏡圖片中，可以清楚地看到janus粒子表面蒸鍍了一半的金層，janus粒子的金屬-ps邊界處成半月狀。

實施例3

對實施例1修飾好的玻碳電極表面進行掃描電鏡表征。如圖3所示，從圖中可以看到，janus粒子附著在玻碳電極表面且吸附了大量的納米金顆粒，而納米金表面可以固定大量的萊克多巴胺適配體，可以使免疫電極的靈敏度有很大的提高。說明本發(fā)明制備的適配體/十八硫醇janus粒子免疫電極修飾成功。

實施例4

實施例1制備的免疫電化學傳感器修飾過程表征：

取實施例1制備的janus修飾電極，在0.1mmph7的磷酸緩沖液中以10mm[fe(cn)6]^3-/4-作為探針利用循環(huán)伏安法表征電極的修飾過程。如圖4所示：修飾了janus粒子后電極產(chǎn)生的峰電流減小，這是因為十八硫醇的疏水性使janus粒子金層朝著電極方向附著在電極表面，在鐵氰化鉀溶液中暴露的是沒有鍍金的ps粒子的聚苯乙烯面，所以其導電性能會減小。在修飾了納米金之后，由于納米金導電性強，所以峰電流增大，并且高于裸玻碳電極的峰電流。在萊克多巴胺適配體中浸泡后檢測到的峰電流減小，說明萊克多巴胺抗體很好地附著在了金層表面。在牛血清白蛋白溶液中浸泡后，電流又有一定程度的降低，證明了牛血清白蛋白完成了在納米金粒子表面的封閉活性位點的作用。該圖說明了實施例1中制備的電極每一步的修飾過程都是成功的。

利用循環(huán)伏安法通過峰電流和掃描速率之間的關系來研究實施例1制備的免疫電化學傳感器的電化學過程機理。見圖5：在10mmol/l[fe(cn)6]^3-/4-中，掃描速度在20-200mv/s的范圍內(nèi)，峰電流與掃描速率成正相關。峰電流與掃描速率的平方根成良好的線性關系，線性回歸方程為：ipa(μa)＝0.68548v^1/2(mvs^-1)^1/2+3.6889，r²＝0.958；ipc(μa)＝-0.75666v^1/2(mvs^-1)^1/2-0.83826，r²＝0.988。這說明電極反應是受擴散控制的。

實施例5

實施例1制備的電化學免疫傳感器在萊克多巴胺溶液中陽極峰電流隨孵育時間的影響：

將實施例1中制備的免疫器電極插入1×10^-6mol/l的萊克多巴胺溶液中，每五分鐘用差分脈沖法測定檢測一次電流值。陽極峰電流隨浸泡時間的影響見圖6：浸泡時間越長，免疫電極表面附著的萊克多巴胺越多，峰電流相應變小。起初變化明顯，最后變化緩慢，在60分鐘時電流值不變。說明免疫電極上的適配體已經(jīng)被萊克多巴胺全部作用。因此選用60分鐘為孵育時間。

實施例6

實施例1制備的電化學免疫傳感器在不同ph溶液中免疫電極對萊克多巴胺檢測的影響：

取實施例1制備的電化學免疫傳感器與1×10^-6mol/l萊克多巴胺作用60分鐘，將其放入10mmol/l[fe(cn)6]^3-/4-探針的不同ph磷酸緩沖溶液中用循環(huán)伏安法表征，見圖7，ph5-7范圍內(nèi)，電流信號一直在減弱，而ph7、8和9時電流信號比較接近。可能原因是在堿性環(huán)境下，電極表面帶負電荷，與[fe(cn)6]^3-/4-發(fā)生電荷相互排斥作用，使探針分子不易接觸到電極表面。由于免疫電極中適配體對ph的特殊要求，最終選擇在生理條件ph7的環(huán)境中進行萊克多巴胺的測定。

實施例7

實施例1制備的電化學免疫傳感器對萊克多巴胺檢測的實驗：

采用差分脈沖法用于實施例1制備的電化學免疫傳感器對萊克多巴胺檢測的實驗。如圖8所示，實施例1制備的免疫電極在一系列濃度從低到高的標準濃度的萊克多巴胺ph7的磷酸緩沖液中孵育60分鐘，其中a-j萊克多巴胺濃度分別為0,1×10^-13,0.5×10^-12,1×10^-12,0.5×10^-11,1×10^-11,1×10^-10,1×10^-9,1×10^-8,1×10^-7mol/l。用其進行差分脈沖法測定，免疫電極對于萊克多巴胺的檢測限可以達到1×10^-13mol/l。此外，本發(fā)明制備的電化學免疫傳感器的電流變化與萊克多巴胺濃度的對數(shù)呈良好的線性關系，如圖9所示，在濃度為1×10^-13mol/l到1×10^-11mol/l范圍內(nèi)，線性方程為ip(μa)＝4.94819logc(mol/l)+35.66248，r＝

0.992；在濃度為1×10^-11mol/l到1×10^-7mol/l范圍內(nèi)，線性方程為ip(μa)＝2.08logc(mol/l)+4.18，r＝0.993。

實施例8

實施例1制備的電化學免疫傳感器對萊克多巴胺選擇性的實驗：

通過對一些常見的干擾物質(zhì)的測試研究，來分析實施例1制備的免疫傳感器的選擇性。如圖10所示，選擇克羅特倫、葡萄糖、尿素、甘油、l-谷氨酸、l-色氨酸、ca²⁺、mg²⁺作為干擾物質(zhì)進行研究。以1×10^-6mol/l萊克多巴胺溶液為基準，以相同萊克多巴胺濃度的干擾物溶液為實驗對象，分別對二者進行電化學檢測分析。結果表明，二者測定的電流信號沒有明顯差別。說明本發(fā)明制備的檢測萊克多巴胺的電化學免疫傳感器選擇性良好。

實施例9

實施例1制備的電化學免疫傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性實驗：

將實施例1制備好的免疫電極在4℃下保存兩周后，該電極在相同的實驗條件下檢測濃度為1×10^-6mol/l的萊克多巴胺溶，發(fā)現(xiàn)峰電流沒有明顯的差別(低于6％)。免疫電極具有良好的穩(wěn)定性可能是由于janus粒子和納米金顆粒在保存的過程中可以保持數(shù)量不變，而萊克多巴胺抗體則可以牢固地吸附在納米金粒子上面，不易從電極表面脫落。另外，利用差分脈沖法進行了重復性實驗，在同樣1×10^-6mol/l萊克多巴胺中分別測定了10次。結果表明，這10次測定結果的標準偏差為0.32，說明實施例1制備的免疫電極重復性良好。

實施例10

實施例1制備的電化學免疫傳感器在尿液中萊克多巴胺檢測應用的實驗：

采用標準加入法用于實施例1制備的電化學免疫傳感器在尿液中萊克多巴胺檢測應用的實驗。如表1所示，將萊克多巴胺標準溶液加入到稀釋了100倍的人體尿樣中，用免疫傳感器進行定量檢測，回收率為94.3％-103％，說明實施例1制備的電化學免疫傳感器可以用于人體尿液中萊克多巴胺的測定。

表1為本發(fā)明制備的電化學免疫傳感器用于人體尿液中萊克多巴胺的檢測