評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒及其儲(chǔ)存方法與流程

本發(fā)明涉及一種用于評(píng)價(jià)疫苗療效的試劑盒、以及所屬試劑盒的儲(chǔ)存方法，尤其涉及一種通過(guò)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)進(jìn)行疫苗療效評(píng)價(jià)的試劑盒、以及所述試劑盒的儲(chǔ)存方法。

背景技術(shù)：

目前，預(yù)防性疫苗的評(píng)價(jià)手段相對(duì)簡(jiǎn)單，主要以跟蹤隨訪隊(duì)列為主，評(píng)價(jià)抗體水平及人群保護(hù)效力，如流感疫苗、乙肝預(yù)防性疫苗、天花疫苗等等。在對(duì)預(yù)防性疫苗作用進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)中，常常以疫苗所產(chǎn)生的抗體滴度作為一個(gè)核心指標(biāo)，而近十年來(lái)隨著檢測(cè)手段的加強(qiáng)，特別是新型細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)技術(shù)的發(fā)展，預(yù)防性疫苗的評(píng)價(jià)也開(kāi)始觸及適應(yīng)性免疫的重要細(xì)胞——T細(xì)胞，如預(yù)防性的流感、天花等疫苗的效果研究中，除了檢測(cè)了IgG之外，也對(duì)T細(xì)胞所表達(dá)的少數(shù)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2等進(jìn)行了檢測(cè)，由此來(lái)推測(cè)疫苗的長(zhǎng)期影響和保護(hù)效果。

治療性疫苗的研制已覆蓋了多種類型的慢性感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病等。在治療性疫苗近二三十年的發(fā)展過(guò)程中，遭遇了諸多瓶頸，以致于目前僅有4種治療性疫苗獲得成功上市。瓶頸之一就是尚未找到一種在臨床研究的早期，可以用來(lái)預(yù)測(cè)疫苗臨床療效的普適的免疫學(xué)替代終點(diǎn)，如預(yù)防性疫苗評(píng)價(jià)的替代終點(diǎn)——中和抗體。由于缺乏這一普適的替代終點(diǎn)，使得目前治療性疫苗的評(píng)價(jià)不得不依賴于臨床治療后最終的療效，而臨床療效的獲得要求大樣本，以及長(zhǎng)時(shí)間、耗力、耗經(jīng)費(fèi)的IIb或III期臨床試驗(yàn)，一旦所選擇的劑量、用法或策略存在不足，即便治療性疫苗本身確實(shí)有效，亦無(wú)法獲得滿意的療效評(píng)價(jià)，從而大大地延遲此類產(chǎn)品的上市，甚至扼殺了這類技術(shù)和產(chǎn)品。

如今，治療性疫苗的研發(fā)和各種關(guān)鍵技術(shù)手段日新月異，但對(duì)于治療替代終點(diǎn)與最終臨床效果平行評(píng)價(jià)方法學(xué)的研究，國(guó)內(nèi)外仍屬空白，從治療性疫苗問(wèn)世至今，尚無(wú)統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)、完善的評(píng)價(jià)手段出現(xiàn)。目前臨床評(píng)價(jià)治療性疫苗主要在 于受試者臨床表型的變化、治療性疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體以及相應(yīng)免疫記憶能力，評(píng)價(jià)體系較為單一。而這種單一的評(píng)價(jià)方式只能針對(duì)于所研發(fā)治療性疫苗的有效與否給予初步的結(jié)論，無(wú)法從治療性疫苗對(duì)于免疫系統(tǒng)整體影響的評(píng)價(jià)來(lái)預(yù)測(cè)其治療效果，更無(wú)法從本質(zhì)上解釋受試者治療成功或失敗的根本原因。

治療性疫苗對(duì)于免疫系統(tǒng)的整體影響，主要體現(xiàn)在對(duì)各類免疫細(xì)胞的抗原特異性影響方面。但此類評(píng)價(jià)的細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)國(guó)內(nèi)外研究尚處于初期，沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)去對(duì)研發(fā)的治療性疫苗進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)，如何從特異性細(xì)胞免疫學(xué)水平上，通過(guò)免疫細(xì)胞上重要的生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行治療性疫苗的評(píng)價(jià)是現(xiàn)今研發(fā)領(lǐng)域所面臨的重大問(wèn)題。

對(duì)于評(píng)價(jià)體系的摸索，目前研究最多的治療性疫苗是人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗。HIV的治療性疫苗至今已有三十多年的時(shí)間，在不斷的失敗中摸索前進(jìn)，對(duì)于HIV的治療性疫苗評(píng)價(jià)的研究也有了新的進(jìn)展，最初的評(píng)價(jià)為能生成廣泛的HIV包膜特異性中和抗體，及病人病毒量、CD4⁺T細(xì)胞數(shù)量的變化等HIV臨床表征的評(píng)價(jià)，卻無(wú)法從免疫學(xué)角度預(yù)測(cè)疫苗的治療效果，解釋治療性疫苗有效或失敗的原因，以及以后的改進(jìn)方向問(wèn)題，從而大大地延遲此類疫苗的上市，甚至扼殺有效疫苗探索。隨著HIV病毒作用機(jī)理研究的深入，目前大多數(shù)的HIV疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)重點(diǎn)是CD8⁺T細(xì)胞的反應(yīng)，因而在評(píng)價(jià)臨床疫苗的過(guò)程中開(kāi)始涉獵CD8⁺T細(xì)胞單一表達(dá)功能性細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α等的評(píng)價(jià)，但是這種評(píng)價(jià)也是不全面的，而且如果分別獨(dú)立地進(jìn)行多種指標(biāo)評(píng)價(jià)將在極大程度上消耗珍貴的臨床樣品。

伴隨免疫學(xué)及病毒學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展深入，在疫苗的評(píng)價(jià)中逐漸認(rèn)識(shí)到從單一的某一群淋巴細(xì)胞或者是某一種細(xì)胞因子并不能全面和系統(tǒng)的評(píng)價(jià)疫苗產(chǎn)生作用的方式及成敗的原因。于是在HIV疫苗的臨床評(píng)價(jià)方面，在受試過(guò)程及后期隨訪過(guò)程中，利用多色流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)血液中CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)所有相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行總體評(píng)價(jià)，與相關(guān)臨床表型相結(jié)合，找出多能性的一種或者幾種類型的CD8⁺T細(xì)胞亞群作為疫苗效果預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，已成為HIV疫苗評(píng)價(jià)的一條新的發(fā)展思路，并被逐步地應(yīng)用于正在開(kāi)發(fā)中的結(jié)核治療性疫苗、乙肝治療性疫苗、腫瘤治療性疫苗等的評(píng)價(jià)中。

而目前國(guó)內(nèi)治療性疫苗研究的熱點(diǎn)之一是乙型肝炎治療性疫苗。乙肝治療性 疫苗最初的評(píng)價(jià)主要是針對(duì)于乙肝五項(xiàng)抗原抗體指標(biāo)、HBV DNA水平和ALT的水平。這些指標(biāo)只能在評(píng)價(jià)的最后給出治療和預(yù)防方法是否起到了保護(hù)作用，無(wú)法預(yù)測(cè)治療性疫苗可能起到的效果及成敗的原因。后來(lái)隨著治療性疫苗評(píng)價(jià)的深入，人們也開(kāi)始關(guān)注血清中各種細(xì)胞因子的水平以及T細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平。研究表明，乙型肝炎病毒(HBV)特異性CD8⁺T細(xì)胞能夠通過(guò)分泌細(xì)胞因子，清除感染肝細(xì)胞的病毒。這些細(xì)胞因子主要是干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)和直接的細(xì)胞毒作用(穿孔素和顆粒酶)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此體外檢測(cè)CD8⁺T細(xì)胞的功能成為目前細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)的重點(diǎn)，并且通過(guò)細(xì)胞因子表達(dá)的水平，能夠從一定程度上推測(cè)治療性疫苗可能的治療效果。但與HIV所不同的是，在慢乙肝病人中，人們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病人的T細(xì)胞處于病毒誘導(dǎo)的免疫耐受狀態(tài)，在體外并不能夠在抗原的再次刺激下很好地表達(dá)功能相關(guān)的細(xì)胞因子。因此，如何活化CD8⁺T細(xì)胞使其恢復(fù)對(duì)抗原應(yīng)答的功能，成為體外評(píng)價(jià)HBV治療性疫苗治療效果的一個(gè)難點(diǎn)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在體外采用特異性或者非特異性富集的方式，能夠很好地重新激發(fā)T細(xì)胞的活性，使其恢復(fù)對(duì)抗原的應(yīng)答能力。

而且隨著進(jìn)一步的探入研究，人們發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的T細(xì)胞的分類亞群，而T細(xì)胞的整體功能的體現(xiàn)是各種亞群細(xì)胞相互影響、共同作用的結(jié)果，只檢測(cè)某一種T細(xì)胞亞群或者是某一類特殊功能的亞群并不能夠完整的體現(xiàn)免疫系統(tǒng)的整體影響，隨著多色流式儀器等技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，我們已經(jīng)能夠在一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)十幾種甚至二十幾種細(xì)胞因子，因此，我們不僅可以檢測(cè)CTL細(xì)胞的功能，我們還能夠同時(shí)檢測(cè)輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)在疫苗注射后細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化，這就為全面地評(píng)價(jià)疫苗對(duì)于細(xì)胞因子整體表達(dá)的影響及疫苗療效間關(guān)系提供了可能性。

上世紀(jì)80年代，復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院聞?dòng)衩吩菏柯暑I(lǐng)課題組通過(guò)分析我國(guó)慢性乙型肝炎患者大多為母嬰傳播所導(dǎo)致的對(duì)HBV耐受的特點(diǎn)，認(rèn)為患者對(duì)乙肝表面抗原的免疫耐受為我國(guó)乙型肝炎發(fā)生慢性化的主要機(jī)理，據(jù)此提出組建新抗原、改變耐受原的提呈方式，構(gòu)建乙肝治療性疫苗以消除機(jī)體對(duì)病毒抗原的免疫耐受，達(dá)到治療乙型肝炎的目的，進(jìn)而構(gòu)建了乙肝表面抗原(HBsAg)和人抗HBs免疫復(fù)合物疫苗——乙克(抗原抗體復(fù)合物型治療性乙型肝炎疫苗)。在研究中發(fā)現(xiàn)，在慢乙肝患者體內(nèi)HBsAg很難被樹(shù)突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)識(shí)別進(jìn)行 抗原遞呈，而按一定比例組建成HBsAg-抗HBs復(fù)合物，它可以通過(guò)抗體的Fc段介導(dǎo)，HBsAg可經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞表面的Fc受體被動(dòng)地帶進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞。

目前，乙克疫苗成為唯一一個(gè)進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的慢性乙型肝炎治療性疫苗。臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了乙克對(duì)于慢性乙肝的治療效果，但是目前除了臨床表現(xiàn)結(jié)果之外，尚無(wú)特定的免疫學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)或替代終點(diǎn)對(duì)乙克的治療效果進(jìn)行早中期評(píng)價(jià)，因此在免疫學(xué)層面上，仍缺乏對(duì)治療慢性乙肝疫苗的免疫學(xué)替代終點(diǎn)的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了對(duì)治療性疫苗臨床治療效果進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)，本發(fā)明提供了一種新的評(píng)價(jià)疫苗效果的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明第一個(gè)方面是提供一種評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒，包括MHC(主要組織相容性復(fù)合體，Major Histocompatibility Complex)限制性抗原肽。

所述疫苗優(yōu)選為治療性疫苗。

其中，所述抗原表位肽可以是腫瘤細(xì)胞表面的抗原表位肽和/或病毒表面的抗原表位肽中的任意一種或幾種。

其中，所述病毒優(yōu)選為對(duì)人和動(dòng)物致病的病毒，并優(yōu)選為皰疹病毒、流感病毒、狂犬病病毒、天花病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、HIV病毒、人類乳頭瘤病毒中的任意一種或幾種。

其中，所述腫瘤可以是胃腸道腫瘤(如胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌等)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、惡性畸胎瘤、甲狀腺腫瘤、顱內(nèi)腫瘤、食管癌、膀胱癌、皮膚癌、血癌、淋巴瘤、子宮肌瘤、宮頸癌、泌尿道腫瘤、骨腫瘤等。

其中，所述MHC限制性抗原肽優(yōu)選為至少包括如下a)、b)抗原表位肽中的任意一種或幾種：a)針對(duì)CD4⁺T細(xì)胞抗原表位肽和/或CD8⁺T細(xì)胞抗原表位肽，b)所述表位抗原氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的具有該抗原表位肽功能的氨基酸序列。

在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述MHC限制性病毒抗原肽優(yōu)選為至少包括如下a1)、b1)抗原表位肽中的任意一種或幾種：a1)針對(duì)CD4⁺T細(xì)胞乙肝表面抗 原(HBsAg)表位肽和/或CD8⁺T細(xì)胞乙肝表面抗原(HBsAg)表位肽，b1)所述表位抗原氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的具有HBsAg抗原表位肽功能的氨基酸序列。

上述的抗原表位肽可以是任意已知的抗原表位肽。

在一種更優(yōu)選實(shí)施例中，所述針對(duì)CD4⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽包括、但不限于如下氨基酸序列中的任意一種或幾種：

FFLLTRILTI；

FFLLTRILTIPQSLD；

TSLNFLGGTTVCLGQ；

QSPTSNHSPTSCPPIC；

CTTPAQGNSMFPSC；

CTKPTDGN；

WASVRFSW；

LLPIFFCLW；

上述任意氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的具有CD4⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。

在一種更優(yōu)選實(shí)施例中，所述針對(duì)CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽包括、但不限于如下氨基酸序列中的任意一種或幾種：

VLQAGFFLL；

FLLTRILTI；

FLGGTPVCL；

LLCLIFLLV；

LVLLDYQGML；

LLDYQGMLPV；

WLSLLVPFV；

GLSPTVWLSV；

SIVSPFIPLL；

ILSPFLPLL；

LLVPFVQWFV；

FLPSDFFPSI；

FLPSDFFPSV；

CLTFGRETV；

EYLVSFGVW；

TPPATRPPNAPIL；

KYTSFPWL；

IPIPSSWAF；

WMMWYWGPSLY；

ILLLCLIFLL；

RWMCLRRFII；

RFSWLSLLVPF；

LYNILSPFL；

PFLPLLPIF；

PFVQWFVGL；

上述任意氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的具有CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。

在一種更優(yōu)選實(shí)施例中，所述針對(duì)CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽包括、但不限于如下氨基酸序列組A)-C)中的任意一組或幾組：

A)CD8⁺T細(xì)胞A2HBsAg表位肽

VLQAGFFLL；

FLLTRILTI；

FLGGTPVCL；

LLCLIFLLV；

LVLLDYQGML；

LLDYQGMLPV；

WLSLLVPFV；

GLSPTVWLSV；

SIVSPFIPLL；

ILSPFLPLL；

上述任意氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的具有CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列；

B)CD8⁺T細(xì)胞HBV混合表位肽

FLLTRILTI；

WLSLLVPFV；

GLSPTVWLSV；

LLVPFVQWFV；

FLPSDFFPSI；

FLPSDFFPSV；

CLTFGRETV；

EYLVSFGVW；

TPPATRPPNAPIL；

KYTSFPWL；

上述任意氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的具有CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列；

C)CD8⁺T細(xì)胞非A2HBsVg混合表位肽

IPIPSSWAF；

WMMWYWGPSLY；

ILLLCLIFLL；

RWMCLRRFII；

RFSWLSLLVPF；

LYNILSPFL；

PFLPLLPIF；

PFVQWFVGL；

上述任意氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的具有CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽功能的氨基酸序列。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，針對(duì)CD4⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽和針對(duì)CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽可以單獨(dú)使用，也可以組合使用。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，各組針對(duì)CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽可以是單獨(dú)使用， 也可以是兩組或三組組合使用。

在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒還可以包括待測(cè)細(xì)胞的富集激活信號(hào)和共刺激信號(hào)。

在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述富集激活信號(hào)選擇為凝集素類分子、離子霉素(Iono)和/或抗-CD3抗體中的任意一種或幾種，并優(yōu)選至少包括抗-CD3抗體。

其中，本發(fā)明所述凝集素類分子指的是凝集素以及具有凝集素功能的凝集素衍生物。

其中，所述凝集素可以是豆科植物凝集素、單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素(如黃精凝集素)。

所述黃精凝集素如：多花黃精凝集素(PMA)、新疆黃精凝集素(PRA)、囊絲黃精凝集素(PCA)中的一種或幾種。

所述都可植物凝集素如：如刀豆凝集素(如Con A)、豌豆凝集素、花生凝集素、蠶豆凝集素、二花扁豆凝集素、菜豆凝集素中的一種或幾種。

在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述共刺激信號(hào)優(yōu)選為至少包括抗-CD28抗體。

本發(fā)明所述待測(cè)細(xì)胞優(yōu)選為病毒特異性T細(xì)胞。

所述病毒特異性T細(xì)胞更優(yōu)選為分離自所述病毒感染者。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述T細(xì)胞的亞群可以是包括輔助性T細(xì)胞(Th1、Th2和Th17)、殺傷性T細(xì)胞(Tc1和Tc17)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg和Tcreg)。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述T細(xì)胞的標(biāo)志物分子包括CD3、CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α、IL-2、MIP-1β、IL-17A、IL-13、IL-10、IL-22、PD-1、Foxp3、TGF-β、IFN-α、IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12p70、IL-15、IL-16、IL-21、IL-27、IL-29、IL-33、IP-10、MIP-1α、G-CSF和CXCL9等。

在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒還可以包括蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑。

在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒還可以包括移液設(shè)備、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)容器中的任意一種或幾種。

所述細(xì)胞培養(yǎng)容器如多孔板，如96孔預(yù)包被細(xì)胞刺激板。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述MHC限制性病毒表位肽在進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)中與待檢測(cè)細(xì)胞接觸時(shí)，優(yōu)選為能夠?qū)崿F(xiàn)濃度1-20μg/ml，更優(yōu)選為5-15μg/ml， 更優(yōu)選為8-10μg/ml。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述抗-CD3和抗-CD28在進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)中與待檢測(cè)細(xì)胞接觸時(shí)，優(yōu)選為分別能夠?qū)崿F(xiàn)濃度0.05-0.2μg/ml，更優(yōu)選為0.1-0.15μg/ml，如分別為0.1μg/ml和0.05μg/ml、0.05μg/ml和0.05μg/ml、0.2μg/ml和0.05μg/ml、0.1μg/ml和0.1μg/ml以及0.1μg/ml和0.2μg/ml。

本發(fā)明第二個(gè)方面是提供一種上述評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒的儲(chǔ)存方法。

所述儲(chǔ)存方法中，MHC限制性病毒抗原肽儲(chǔ)存溫度≤5℃，更優(yōu)選為≤4℃，更優(yōu)選為≤3℃，更優(yōu)選為≤0℃，并優(yōu)選為0℃至4℃。

所述儲(chǔ)存方法中，細(xì)胞培養(yǎng)容器儲(chǔ)存溫度≤-10℃，更優(yōu)選為≤-15℃，更優(yōu)選為≤-20℃，更優(yōu)選為≤-30℃，并優(yōu)選為-30℃至-10℃。

所述儲(chǔ)存方法中，如果存在的話，其他試劑和/或儀器儲(chǔ)存溫度優(yōu)選為≤5℃，更優(yōu)選為≤4℃，更優(yōu)選為≤3℃，更優(yōu)選為≤0℃，并優(yōu)選為0℃至4℃。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述氨基酸序列、及其經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生得到的氨基酸序列，可以是通過(guò)生物合成、化學(xué)合成中的任意一種或幾種來(lái)獲得，比如設(shè)計(jì)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)固相合成獲得相應(yīng)的氨基酸序列。在本發(fā)明沒(méi)有特定限定的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用已知的氨基酸表達(dá)或合成方法來(lái)實(shí)施。

本發(fā)明評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒，能夠利用處于臨床試驗(yàn)階段的治療性疫苗研究數(shù)據(jù)庫(kù)與標(biāo)本，并應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)，對(duì)免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行全面檢測(cè)，從而建立細(xì)胞免疫學(xué)療效評(píng)價(jià)體系。并且所述評(píng)價(jià)疫苗療效的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性好，儲(chǔ)存一年以上時(shí)穩(wěn)定性仍能保持90％以上。

附圖說(shuō)明

圖1為慢乙肝患者未使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)，直接用表位肽刺激后IFN-γ表達(dá)結(jié)果，其中，陽(yáng)性富集刺激物為PMA+Iono，表位肽為CD8⁺T細(xì)胞S表位肽肽池，陰性對(duì)照為未刺激細(xì)胞；

圖2為慢乙肝患者細(xì)胞凍存后，經(jīng)復(fù)蘇、富集3天，刺激后檢測(cè)IFN-γ表 達(dá)的結(jié)果，其中，陽(yáng)性刺激物為PMA+Iono，實(shí)驗(yàn)組刺激物為CD8⁺T細(xì)胞S表位肽肽池，陰性對(duì)照為未刺激細(xì)胞；

圖3為慢乙肝病人PBMC富集3天，刺激后凍存，復(fù)蘇后IFN-γ流式檢測(cè)的結(jié)果，其中，陽(yáng)性刺激為PMA+Iono，實(shí)驗(yàn)組所用刺激物為CD8⁺T細(xì)胞S抗原表位肽，陰性對(duì)照為富集3天后未刺激細(xì)胞；

圖4為實(shí)施例1中治療前后不同T細(xì)胞亞群比例的變化，其中，A為不同CD4⁺T細(xì)胞亞型比例隨免疫進(jìn)程變化的餅圖；B為不同CD8⁺T細(xì)胞亞型比例隨免疫進(jìn)程變化的餅圖；橫坐標(biāo)為免疫次數(shù)(第0、2、4、6次免疫)；YIC：乙克組；ALUM：鋁佐劑組；SALINE：生理鹽水組；

圖5為實(shí)施例1中治療前后不同亞群CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞因子變化，其中，圖5A為三個(gè)治療組CD4+T細(xì)胞因子表達(dá)水平的平均數(shù)隨免疫進(jìn)程變化趨勢(shì)圖；YIC：乙克組，綠色；ALUM：鋁佐劑組，藍(lán)色；SALINE：生理鹽水組，黑色；圖5B為乙克組(左)、鋁佐劑組(中)和生理鹽水組(右)中每個(gè)受試者CD4⁺T細(xì)胞IFN-γ的分泌水平隨免疫進(jìn)程變化；橫坐標(biāo)為免疫次數(shù)(第0、2、4、6次免疫)；

圖6為實(shí)施例1中治療前后不同亞群CD8⁺T細(xì)胞的細(xì)胞因子變化，其中，圖6A為三個(gè)治療組CD8⁺T細(xì)胞因子表達(dá)水平的平均數(shù)隨免疫進(jìn)程變化趨勢(shì)圖；YIC：乙克組，綠色；ALUM：鋁佐劑組，藍(lán)色；SALINE：生理鹽水組，黑色；圖6B為乙克組(左)、鋁佐劑組(中)和生理鹽水組(右)中每個(gè)受試者CD8⁺T細(xì)胞IL-2的分泌水平隨免疫進(jìn)程變化，橫坐標(biāo)為免疫次數(shù)(第0、2、4、6次免疫)；

圖7為實(shí)施例2中乙克臨床樣本細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的穩(wěn)定性，其中，圖7A為乙克臨床樣本細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月后CD8⁺T細(xì)胞IFN-γ表達(dá)水平；Positive：陽(yáng)性刺激孔(PMA+離子霉素iono)；Negative：陰性刺激孔；圖7B為乙克臨床樣本細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月后的穩(wěn)定性百分比平均值，橫坐標(biāo)均為保存時(shí)間；樣本數(shù)為3例乙克治療后慢性乙肝患者。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特別說(shuō)明，均可從已知的生物公司購(gòu)買。

(1)治療性乙型肝炎疫苗(商品名：乙克)60μg/1ml/安瓿，北京生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20120301，20100501。

(2)氫氧化鋁佐劑注射液：0.1％氫氧化鋁佐劑1ml每安瓿，外觀及一般檢定同治療用藥，由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。批號(hào)：20120302，20100801。

(3)生理鹽水注射液：1ml生理鹽水每安瓿，由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。批號(hào)：20110705。

(4)阿德福韋酯片：采用國(guó)內(nèi)上市療效佳的產(chǎn)品，由申辦方統(tǒng)一提供。100mg/片，14片/盒。批號(hào)：110980，111195，120661，120871，1211105，130436，1312102。

實(shí)施例1，乙肝治療性疫苗乙克的臨床樣本細(xì)胞免疫學(xué)評(píng)價(jià)

一、材料與試劑

10ml EDTA抗凝采血管(BD，貨號(hào)：367525)、凍存管(Corning，430659)、15ml離心管(Corning，430791)、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，3513)、96孔U底細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，3799)、10ml移液管(Costar，4488)、無(wú)菌1.5ml LEP管、流式細(xì)胞管，及其他耗材。

(1)無(wú)菌磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)購(gòu)自Gibco公司,貨號(hào)為20012-027。(2)人淋巴細(xì)胞分離液(LymphoprepTM)購(gòu)自Axis-Shield公司，貨號(hào)為11114547。(3)4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)：將8g PFA溶解于PBS，終體積200mL，加熱攪拌并加幾滴濃NaOH，待完全溶解后冷卻至室溫，加HCl調(diào)節(jié)溶液pH至7.4，室溫保存。(4)0.2％破膜劑(Triton X-100，購(gòu)自Genview)：將400μL TritonX-100加入到PBS中，終體積為200ml，放置在60℃水浴中直至完全溶解(約20min)， 冷卻至室溫，4℃保存。(5)雙抗、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI1640培養(yǎng)基：均購(gòu)自gibco公司，貨號(hào)分別為10099-141和22400-089。(6)DMSO、PMA和離子霉素(Iono)：均購(gòu)自sigma公司。(7)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑(BFA)購(gòu)自BD公司。(8)抗-CD3抗體(anti-CD3)和抗-CD28抗體(anti-CD28)，購(gòu)自Miltenyi Biotec公司。(9)熒光標(biāo)記抗體見(jiàn)下表。

病毒抗原肽見(jiàn)下表：

CD4⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽

CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表位肽

CD8⁺T細(xì)胞HBV混合表位肽池

CD8⁺T細(xì)胞非A2HBsAg表位肽

二、實(shí)驗(yàn)方法

研究設(shè)計(jì)及研究對(duì)象：

研究采用隨機(jī)、多中心、聯(lián)和用藥的研究。研究對(duì)象為HBeAg陽(yáng)性慢性病毒性乙型肝炎患者，計(jì)劃入組病例總數(shù)為60例，受試者按1:1:1的比例隨機(jī)分到下列三組：

研究對(duì)象分組治療情況

最終入組52例，其中鋁佐劑組、乙克組和生理鹽水組分別為18例、17例和17例，所有研究對(duì)象肌肉注射6針乙克、鋁佐劑或生理鹽水，每隔四周注射一次，連續(xù)注射6針。用藥結(jié)束時(shí)為24周，接著隨訪24周時(shí)間，總體研究時(shí)間為48周。出于倫理考慮，所有研究對(duì)象均結(jié)合抗病毒藥物阿德福韋酯治療。于0、4、12和20周采集抗凝血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)樣本

采血、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離及體外T細(xì)胞的富集：

(1)用BD EDTA抗凝管采集10ml全血。取血后緩慢顛倒混勻5-10次，豎放靜置，室溫保存運(yùn)輸，并于24小時(shí)內(nèi)處理檢測(cè)。

(2)將采血管置于離心機(jī)中室溫離心(轉(zhuǎn)速為1600rpm)10min，取上層血漿，并按每管1ml分裝于凍存管內(nèi)，放置于-70℃保存，待血清學(xué)檢測(cè)時(shí)用。

(3)取2支15ml離心管，分別加入5ml預(yù)熱后的淋巴細(xì)胞分離液。

(4)將步驟2中離心后的剩余血液與無(wú)菌PBS混勻，至終體積20ml，每10ml沿管壁加到5ml淋巴細(xì)胞分離液的液面上，避免血液沖到管底。

(5)將離心管置于水平轉(zhuǎn)子中，并將離心機(jī)的升降速調(diào)至最低(升降速0)，在22-23℃離心(轉(zhuǎn)速為2000rpm)30min。

(6)吸取白膜層細(xì)胞(此為PBMC)，吸取的液體分別置于2個(gè)新15ml離心管中，分別加入無(wú)菌PBS至15ml并重懸，在水平轉(zhuǎn)頭22-23℃離心(2000rpm)5min，棄上清?？芍貜?fù)此洗滌步驟一次。

(7)可重復(fù)洗滌步驟6一次。

(8)用3mL完全培養(yǎng)基R10(RPMI 1640培養(yǎng)基含10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)重懸細(xì)胞后，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(9)用含R10培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×10⁶細(xì)胞/ml。

(10)取3ml步驟9中的細(xì)胞，加入anti-CD3(終濃度0.1μg/ml)和anti-CD28(終濃度0.05μg/ml)，隨后按每孔1ml放入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)富集3天。

但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以確定其它的抗-CD3和抗-CD28抗體刺激濃度，例如0.05μg/mL和0.05μg/mL、0.2μg/mL和0.05μg/mL、0.1μg/mL和0.1μg/mL以及0.1μg/mL和0.2μg/mL等。

但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以確定其它的富集時(shí)間，例如一天、五天和七天等。

但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以確定可用的亞群包括輔助性T細(xì)胞(Th1、Th2和Th17)、殺傷性T細(xì)胞(Tc1和Tc17)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg和Tcreg)。

抗原肽體外特異性刺激：

(1)3天后，將富集的細(xì)胞用R10培養(yǎng)基洗一次后重懸，加入anti-CD28 (終濃度0.1μg/ml)和BFA(1μl/ml)，按100μl/孔加入96孔預(yù)包被細(xì)胞培養(yǎng)板。

(2)96孔預(yù)包被細(xì)胞培養(yǎng)板中設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組、抗原肽刺激組和空白對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組加入PMA(終濃度0.1μg/ml)和離子霉素(終濃度1μg/ml)；抗原肽刺激組分別加入針對(duì)HBsAg的CD4/CD8肽池(每種肽的終濃度均為10μg/ml)。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以確定其它的抗原肽刺激濃度，例如1μg/mL、5μg/mL和20μg/mL等。

(3)37℃，5％二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時(shí)。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以確定其它的刺激時(shí)間，例如4小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)等。

細(xì)胞凍存：

(1)將細(xì)胞整個(gè)96孔板22-23℃離心(2000rpm)5min，棄上清。

(2)加入200μl/孔凍存液(10％DMSO+90％胎牛血清)，重懸后，梯度降溫：4℃ 1小時(shí)，-20℃ 40分鐘，-80℃凍存。待統(tǒng)一批次流式檢測(cè)。

流式檢測(cè)：

(1)37℃快速解凍刺激后96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞。1500rpm離心5min，棄上清，加入2％FBS的PBS(表面稀釋液)200μl洗一次，1500rpm離心5min，棄上清。

(2)將表面染色用抗體用表面稀釋液稀釋好，每孔50μl，吹吸混勻3-5次，冰上避光染色30min。

(3)加入150μl表面稀釋液，終止表面染色，1500rpm離心5min，棄上清。

(4)加入200μl 4％PFA室溫避光固定8min，2000rpm離心5min,，棄上清，快速加入200μl表面稀釋液吹吸重懸細(xì)胞，2000rpm離心5min，棄上清。

(5)以0.2％Triton X-100(含2％FBS)作為胞內(nèi)抗體稀釋液預(yù)先配好破膜染色液，每孔50μl，吹吸混勻，避光冰上染色2小時(shí)。

(6)用表面稀釋液150μl/孔終止反應(yīng)，2000rpm離心5min，棄上清。

(7)用表面稀釋液200μl/孔重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到流式管進(jìn)行檢測(cè)。

(8)檢測(cè)指標(biāo)：

——T細(xì)胞表面標(biāo)志物：anti-CD4、anti-CD8，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公 開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以確定其它的T細(xì)胞表面標(biāo)志物，如anti-CD3。

——功能相關(guān)細(xì)胞標(biāo)志物：anti-IFN-γ、anti-TNF-α、anti-IL-2、anti-MIP-1β、anti-IL-17A、anti-IL-13、anti-IL-10、anti-IL-22、anti-PD-1、anti-Foxp3和anti-TGF-β，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可以確定其它的功能相關(guān)細(xì)胞標(biāo)志物，如anti-IFN-α、anti-IL-1β、anti-IL-3、anti-IL-4、anti-IL-5、anti-IL-6、anti-IL-7、anti-IL-8、anti-IL-12p70、anti-IL-15、anti-IL-16、anti-IL-21、anti-IL-27、anti-IL-29、anti-IL-33、anti-IP-10、anti-MIP-1α、anti-G-CSF和anti-CXCL9等。

(9)細(xì)胞獲取使用LSR Fortessa多色流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,USA)，先用單熒光染色調(diào)補(bǔ)償。流式結(jié)果分析用FlowJo 7.6.1(TreeStar,US)，結(jié)果呈現(xiàn)采用陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

統(tǒng)計(jì)分析：

兩組之間用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組以上的數(shù)據(jù)用One-way ANOVA檢測(cè)，P＜0.05的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*表示P＜0.05。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、由于慢乙肝病人的T細(xì)胞對(duì)HBV抗原具有耐受性，因此為了尋找合適的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)慢乙肝病人的PBMC進(jìn)行預(yù)處理，我們對(duì)刺激和凍存方案進(jìn)行了摸索。我們以CD8⁺T的IFN-γ表達(dá)量為例，首先對(duì)未進(jìn)行任何富集和凍存的慢乙肝病人的細(xì)胞分別用陽(yáng)性刺激物PMA+Iono，10μg/mL S抗原表位肽和20μg/mL S抗原表位肽進(jìn)行刺激，如圖1中結(jié)果所示，未進(jìn)行任何預(yù)處理的病人PBMC對(duì)S抗原表位肽未有陽(yáng)性反應(yīng)。在摸索了合適的富集條件后，我們對(duì)先凍存還是先富集刺激進(jìn)行了方法學(xué)上的摸索，發(fā)現(xiàn)，先凍存慢乙肝病人的PBMC，后進(jìn)行富集和刺激，如圖2所示，慢乙肝病人CD8⁺T的IFN-γ表達(dá)量整體下降，而且未有明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，而經(jīng)過(guò)富集刺激后再進(jìn)行細(xì)胞凍存，復(fù)蘇后直接流式檢測(cè)，如圖3所示，可以看到慢乙肝病人CD8⁺T的IFN-γ表達(dá)量經(jīng)過(guò)S抗原表位肽刺激后相對(duì)于未刺激組有明顯上升，證明試劑盒說(shuō)明書(shū)所提供的方法可以有效地檢測(cè)慢乙肝病人T細(xì)胞對(duì)S抗原的反應(yīng)。

2、為了評(píng)價(jià)疫苗的效果，我們研究了乙克組、鋁佐劑組和生理鹽水組中不同T細(xì)胞亞型的比例隨著免疫進(jìn)程變化的規(guī)律，我們按照細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答中 所發(fā)揮的不同免疫功能，將檢測(cè)到的T細(xì)胞因子分類。我們將檢測(cè)的CD4⁺T細(xì)胞因子歸類為Th1、Th2、Th17和Treg，Th1中的因子主要在抗病毒過(guò)程中起到活化作用，Th2中的因子主要在體液免疫中發(fā)揮作用，Th17中主要是炎癥因子，Treg中的因子主要發(fā)揮免疫抑制作用。而CD8⁺T細(xì)胞因子歸類為Tc1、Tc17和Tcreg，Tc1中的因子主要起殺傷作用，Tc17中主要是炎性細(xì)胞因子，Tcreg中主要是發(fā)揮免疫抑制作用的因子。

如圖4-A所示，對(duì)于CD4⁺T細(xì)胞，乙克治療組中Treg細(xì)胞比例從基線時(shí)的78％下降至治療終點(diǎn)時(shí)的35％，Th1細(xì)胞比例從7％增加至24％，Th2細(xì)胞比例從15％增加至41％；在鋁佐劑和生理鹽水治療組中并未觀察到類似的變化，Th1、Th2和Treg細(xì)胞比例隨著免疫進(jìn)程基本未發(fā)生變化。如圖4-B所示，對(duì)于CD8⁺T細(xì)胞，乙克治療組中Tc1和Tc17細(xì)胞比例隨著免疫進(jìn)程均有著一定的增加，Tcreg細(xì)胞比例從基線時(shí)的60％下降至治療終點(diǎn)時(shí)的39％；鋁佐劑治療組中Tc17細(xì)胞比例隨著免疫進(jìn)程有著微弱的增加(從基線時(shí)的8％增加至治療終點(diǎn)時(shí)的14％)，生理鹽水組中Tc17細(xì)胞比例隨著免疫進(jìn)程呈現(xiàn)不規(guī)律的變化；鋁佐劑和生理鹽水治療組中Tc1細(xì)胞比例均有所下降，Tcreg細(xì)胞比例均有所增加。

3、我們進(jìn)一步分析了乙克組、鋁佐劑組和生理鹽水組Th1細(xì)胞IL-2、IFN-γ、TNF-β這三種代表性細(xì)胞因子，Th2細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IL-13，Th17細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IL-17A，Treg細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Foxp3以及抑制性分子IL-22和PD-1在第0、2、4、6次免疫后的表達(dá)水平變化。根據(jù)三個(gè)治療組細(xì)胞因子在不同免疫次數(shù)表達(dá)水平的平均數(shù)，我們做了以上各種特征性標(biāo)記物表達(dá)水平隨免疫進(jìn)程變化的趨勢(shì)圖，如圖5-A所示。乙克治療組中CD4⁺T細(xì)胞表達(dá)IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平隨著治療進(jìn)程均有著上升趨勢(shì)，而鋁佐劑組和生理鹽水組中這三種細(xì)胞因子的表達(dá)水平呈現(xiàn)不規(guī)律的變化。乙克治療組中CD4⁺T細(xì)胞表達(dá)這五種抑制性因子的水平隨著治療進(jìn)程均有著下降趨勢(shì)，而鋁佐劑組中這五種抑制性因子的表達(dá)水平首先上升隨后又下降，生理鹽水組呈現(xiàn)不規(guī)律的變化。

同時(shí)，根據(jù)乙克組、鋁佐劑組和生理鹽水組中每個(gè)受試者CD4⁺T細(xì)胞IFN-γ在不同免疫次數(shù)的表達(dá)水平,我們分析了三個(gè)治療組中每個(gè)受試者這種細(xì)胞因 子分泌水平隨免疫進(jìn)程變化的趨勢(shì)，如圖5-B所示。

4、我們也研究了CD8⁺T細(xì)胞的細(xì)胞因子變化，并分析了乙克組、鋁佐劑組和生理鹽水組Tc1細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和趨化因子MIP-1β，Tc17細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IL-17A，Tcreg細(xì)胞代表性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Foxp3以及抑制性分子IL-22和PD-1在第0、2、4、6次免疫后的表達(dá)水平變化。根據(jù)三個(gè)治療組這些因子在不同免疫次數(shù)表達(dá)水平的平均數(shù)，我們做了以上各種特征性標(biāo)記物表達(dá)水平隨免疫進(jìn)程變化的趨勢(shì)圖，如圖6-A所示。乙克治療組中CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平隨著治療進(jìn)程均有著上升趨勢(shì)；而鋁佐劑組和生理鹽水組中這三種因子的表達(dá)水平呈現(xiàn)不規(guī)律的變化。乙克治療組中CD8⁺T細(xì)胞表達(dá)TGF-β、Foxp3、IL-22的水平隨著治療進(jìn)程均有著下降趨勢(shì)，PD-1的表達(dá)水平有一定升高，IL-10的表達(dá)水平基本未發(fā)生變化；而鋁佐劑組中TGF-β、PD-1的表達(dá)水平隨著治療進(jìn)程有明顯的升高，IL-10、Foxp3和IL-22的表達(dá)水平變化不明顯；生理鹽水組這五種抑制性因子的表達(dá)基本未發(fā)生變化。

同時(shí)，根據(jù)乙克組、鋁佐劑組和生理鹽水組中每個(gè)受試者CD8⁺T細(xì)胞IL-2在不同免疫次數(shù)的表達(dá)水平,我們分析了三個(gè)治療組中每個(gè)受試者這種因子分泌水平隨免疫進(jìn)程變化的趨勢(shì)，如圖6-B所示。

實(shí)施例2：乙克臨床樣本細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒長(zhǎng)期穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)

材料與試劑參考實(shí)施例1，PBMC來(lái)源于乙克治療組慢性乙肝病人，檢測(cè)指標(biāo)主要為CD8⁺T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)。

我們監(jiān)測(cè)了乙克臨床樣本細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的穩(wěn)定性。試劑盒中96孔預(yù)包被細(xì)胞刺激板于-20℃保存，其它試劑于4℃保存。

如圖7A所示，與0天相比，保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的試劑盒經(jīng)檢測(cè)，陽(yáng)性刺激孔CD8⁺T細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)水平基本未發(fā)生變化，陰性刺激孔作為對(duì)照。如圖7B，假定0天時(shí)試劑盒穩(wěn)定性為100％，經(jīng)換算，保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的試劑盒的穩(wěn)定性仍保持在90％以上。這些結(jié)果表明乙克臨床樣本細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒保存一年后仍有著較好地穩(wěn)定性。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，CD8⁺T細(xì)胞S是指兩組或三組CD8⁺T細(xì)胞HBsAg表 位肽同時(shí)使用。

本發(fā)明雖然以乙肝疫苗為例進(jìn)行了介紹，但是在本發(fā)明上述實(shí)施例的指導(dǎo)下，本發(fā)明試劑盒也同樣適用于其他含有針對(duì)CD4⁺T細(xì)胞的抗原表位肽和/或CD8⁺T細(xì)胞抗原表位肽的腫瘤細(xì)胞和/或病毒，以及針對(duì)所述腫瘤細(xì)胞和/或病毒的疫苗療效的評(píng)價(jià)。

以上具體實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也在本發(fā)明范圍內(nèi)。