一種煙草及煙草制品中水溶性糖的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,它利用加速溶劑萃取提取煙草中的水溶性糖,再分別利用肟化-硅烷化與糖氰化-乙?;N衍生化方法,肟化-硅烷化產物直接氣相色譜-火焰離子化檢測器測定;糖氰化-乙?;a物利用超聲輔助-分散液液微萃取進行提取后再進行氣相色譜-火焰離子化檢測器測定。本發(fā)明與其它分析煙草中的水溶性糖的方法相比,具有簡單快速,重現性好,靈敏度高,以及對水溶性糖分離能力好的特點,能對煙草中的水溶性糖進行準確定量。
【專利說明】一種煙草及煙草制品中水溶性糖的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于煙草化學成分的測定方法【技術領域】,具體涉及一種煙草及煙草制品中 水溶性糖的測定方法。
【背景技術】
[0002] 水溶性糖是煙草生長發(fā)育過程中重要的初級代謝產物,它們不僅與煙草的光合與 呼吸作用直接相關,還直接影響著煙草的品質與質量。水溶性糖的含量高低與煙草的香味、 刺激性及焦油的產生關系密切,例如,水溶性的還原糖與氨基化合物能燃燒產生呋喃類美 拉德反應產物,能有效改善煙草的品質,減少木質雜氣,增加煙香。此外,高含量糖的煙草也 會導致主流煙氣中有毒及致癌物質的增加,主要有甲醛、乙醛、丙酮和丙烯醛等。據研究報 道,乙醛還能夠增加吸煙者對尼古丁的依耐性。不同品種、部位、產地的煙草中水溶性糖含 量的不同,也導致了煙葉配伍性的顯著差異。因此,建立煙葉中水溶性糖的檢測方法,對于 煙葉生產、煙葉品質評價、煙葉配伍性及安全性研究等具有非常重要的指導意義。
[0003] 目前還沒有一套簡單,快速和對環(huán)境綠色友好的關于煙草及煙草制品中水溶性糖 的測得方法。建立一套簡單,快速、對環(huán)境綠色友好且準確的方法以提高樣品檢測通量,減 少環(huán)境污染是非常必要的。
[0004] 文獻調研表明:煙草中水溶性糖的提取及凈化方法主要為振蕩提取,超聲提取和 固相萃取凈化,但振蕩提取與超聲提取都存在提取時間長,溶劑消耗大等缺陷,從而導致樣 品檢測通量不高,環(huán)境污染較大。此外,水溶性糖的固相萃取凈化也大大增加了樣品的檢測 成本。
[0005] 煙草中水溶性的檢測方法主要分為兩大類,第一類為非衍生化方法:該方法主要 利用液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器和離子色譜-脈沖安培檢測器進行檢測,由于水溶性糖 的結構非常相似,導致其在液相色譜柱和離子色譜柱上不能基線分離,從而影響定量。第二 類為衍生化方法:該方法主要利用氣相色譜進行檢測,氣相色譜具有非常高的理論塔板數, 能順利分離各種結構非常相似的水溶性糖。但通過對以往文獻的調研表明:煙草中水溶性 糖的衍生化檢測主要存在三個問題1)由于水溶性糖(果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)的結 構非常相似,沒有單獨的一種衍生化方法能較好的將其基線分離;2)衍生化方法的反應時 間較長;3)衍生化后的后處理較復雜,需要多步驟的溶劑萃取。因此,有必要開發(fā)一種簡單, 快速,準確和對水溶性糖分離能力好的檢測方法。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題:提供一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,該 方法具有簡單快速,重現性好,靈敏度高,以及對水溶性糖分離能力好的特點,能對煙草中 的水溶性糖進行準確定量,可以克服現有技術的不足。
[0007] 本發(fā)明技術方案: 一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,它包括以下步驟: A、 煙草及煙草制品中水溶性糖的提?。簩煵輼悠贩鬯楹筮^80-100目篩后,向5mL萃 取池中放入纖維素濾膜,再放入適量硅藻土,稱取200mg煙草樣品粉末按照1: 2與硅藻土 混合后放入萃取池,加入內標溶液進行加速溶劑萃取;將提取溶劑轉移至10mL容量瓶中, 再用乙醇:水(1:1V/V)定容到10mL后混勻,分別取二個500yL提取溶液至2mL色譜 瓶和10mL離心管中,38 - 40°C條件下氮氣吹干進行衍生化; B、 煙草及煙草制品中水溶性糖的衍生化:(1)肟化-硅烷化:將2mL色譜瓶中的吹干 殘留物先進行肟化反應,再將肟化產物進行硅烷化,反應后直接用氣相色譜-火焰離子化 檢測器進行檢測;(2)糖氰化-乙?;簩?0mL離心管中的吹干殘留物先進行糖氰化反 應,再將糖氰化產物進行乙?;磻Y束后用超聲輔助-分散液液微萃取萃取糖氰化-乙 ?;a物; C、 煙草及煙草制品中水溶性糖的衍生化產物的提取:向氰化-乙?;a物中加入氯化 鈉水溶液,再加入提取溶劑進行提取,提取結束后,用100UL微量進樣針吸取離心管中的 沉淀相,將其轉移至250yL微量進樣瓶中用氣相色譜-火焰離子化檢測器進行檢測; D、 煙草及煙草制品中水溶性糖的色譜檢測條件:氣相色譜-火焰離子化檢測器色譜條 件為:色譜柱為TR-1柱,長度60m,內徑0.32mm,膜厚0.25Mm,載氣:高純氮氣,載氣流 量:1.5mL/min,進樣口與檢測器溫度為260°C,進樣量為1ML,分流進樣,分流比為7:1,檢 測器氣體流量為干燥空氣:350mLmirT1,高純氫氣:35mLmirT1和尾吹氣高純氮氣30mL min-1;柱溫升溫程序為80°C保持2min,5°Cmin_1升到240°C保持5min,再以20°CmirT1 升到280°C保持15min,一共運行56min; E、 煙草及煙草制品中水溶性糖的定性及定量方法:分別采用保留時間和內標法進行定 性和定量分析。
[0008] 上述內標溶液為80iiL濃度為25mgmL4的苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷乙醇: 水(1:1V/V)溶液。
[0009] 上述加速溶劑萃取的條件為:萃取溶劑為乙醇:水(1:1V/V)、壓力為1500psi、 溫度為80°C、靜態(tài)萃取時間為5min、靜態(tài)循環(huán)次數為2次、沖洗體積為0%,吹掃時間為80 So
[0010] 上述肟化條件為加入300ML濃度為25mgmr1的鹽酸甲羥胺(吡啶溶解),80°C肟 化 10min。
[0011] 上述硅烷化條件為加入1〇〇MLN,0-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(含1%三甲基氯 硅烷),80°C硅烷化10min。
[0012] 上述糖氰化反應的條件為加入300ML濃度為25mgmr1的鹽酸羥胺(吡啶:N-甲 基咪唑:甲醇2:1:1V/V/V溶解),80°C糖氰化5min,乙酰化條件為加入500yL乙酸酐溶 液,常溫反應5min。
[0013] 上述超聲輔助-分散液液微萃取的條件為加入2. 3mLll%w/v的氯化鈉水溶液, 再加入44yL三氯甲烷,渦旋混勻1min后放入超聲波中超聲輔助-分散液液微萃取5 min,微萃取后放入離心機中4000rpm離心5min。
[0014] 上述內標法定量的方法為果糖采用肟化-硅烷化方法進行定量,木糖、甘露糖、葡 萄糖、半乳糖、肌醇、山梨醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖10種水溶性糖采用糖氰化-乙酰 化方法進行定量。
[0015] 本發(fā)明的有益效果: 本發(fā)明建立了一種以加速溶劑萃取提取煙草中的水溶性糖,再分別以肟化-硅烷化和 糖氰化-乙酰化進行衍生化,衍生化后肟化-硅烷化產物直接用氣相色譜-火焰離子化檢 測器進行檢測,糖氰化-乙?;a物利用超聲輔助-分散液液微萃取進行提取后采用氣相 色譜-火焰離子化檢測器進行檢測的方法。同時本發(fā)明為了獲得超聲輔助-分散液液微萃 取中最佳的富集因子和回收率,分別采用了部分析因設計、Doehlert設計和渴望函數進行 方法優(yōu)化。與現有技術相比,本方法的優(yōu)點是:采用加速溶劑萃取提取的方法減少了有機溶 劑的使用和提取時間;采用二種衍生化方法的方法,完全分離了 11種水溶性糖;采用吡啶: N-甲基咪唑:甲醇2:1:1V/V/V為糖氰化-乙酰化的溶劑,大大減少了衍生化的反應時間; 采用超聲輔助-分散液液微萃取的方法,減少了有機溶劑的使用及提取的時間,提高了方 法的靈敏度。本發(fā)明具有簡單快速,重現性好,靈敏度高,以及對水溶性糖分離能力好的優(yōu) 點,能對煙草中的水溶性糖進行準確定量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1本發(fā)明中煙草中水溶性糖的檢測方法流程圖; 圖2中A為果糖肟化-硅烷化后的煙草樣品色譜圖;B為果糖肟化-硅烷化后的標準 樣品色譜圖;1為果糖;IS為內標苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷; 圖3中A為10種水溶性糖糖氰化-乙?;蟮臒煵輼悠飞V圖;B為10種水溶性糖 糖氰化-乙?;蟮臉藴蕵悠飞V圖;2木糖、3甘露糖、4葡萄糖、5半乳糖、6肌醇、7山梨 醇、8麥芽糖、9乳糖、10蔗糖、11蜜二糖;IS內標苯基-beta-D-吡喃葡萄糖苷。 具體實施方案
[0017] 本發(fā)明通過以下實例對上述方法進一步進行描述,但并不限制本發(fā)明。
[0018] 實施例1 本發(fā)明煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法包括如下步驟: (1)將煙草樣品粉碎后過80-100目篩后,向5mL萃取池中放入纖維素濾膜,再放入適 量硅藻土,稱取200mg煙草粉末按照1: 2與硅藻土混合后放入萃取池,加入80iiL濃度 為25mgml/1的苯基-beta-D-批喃葡萄糖苷內標后進行加速溶劑萃取。其中加速溶劑萃 取條件為:萃取溶劑為乙醇:水(1:1V/V)、壓力為1500psi、溫度為80°C、靜態(tài)萃取時間為 5min、靜態(tài)循環(huán)次數為2次、沖洗體積為0%和吹掃時間為80s。
[0019] (2)將提取溶劑轉移至10mL容量瓶中,再用乙醇:水(1:1V/V)定量到10mL后 混勻,分別取二個500yL提取溶液至2mL色譜瓶和10mL離心管中,38 - 40°C條件下氮 氣吹干進行衍生化。
[0020] (3)將2mL色譜瓶中的吹干殘留物進行肟化-硅烷化:加入300ML濃度為25mg mL-1的鹽酸甲羥胺(批啶溶解),80°C肟化10min,再加入100MLN,0-雙(三甲基硅烷基) 乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷),80°C硅烷化10min,反應后用氣相色譜-火焰離子化檢測器 進行檢測。
[0021] (4)將10mL離心管中的吹干殘留物進行糖氰化-乙?;杭尤?00ML濃度為 25mgmL4的鹽酸羥胺(吡啶:N-甲基咪唑:甲醇2:1:1V/V/V溶解),80°C糖氰化5min,再 加入500yL溶液,常溫乙酰化5min,反應結束后用超聲輔助-分散液液微萃取提取糖氰 化-乙?;a物。
[0022] (5)加入2. 3mLll%w/v的氯化鈉水溶液,再加入44iiL三氯甲燒,渦旋混勻1 min后放入超聲波中超聲輔助-分散液液微萃取5min,萃取后放入離心機中4000rpm離 心5min,用100yL微量進樣針吸取離心管中的沉淀相,將其轉移至250yL微量進樣瓶 中用氣相色譜-火焰離子化檢測器進行檢測。
[0023] (6)本發(fā)明中果糖采用肟化-硅烷化方法進行定量,其它10種水溶性糖(木糖、甘 露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇、山梨醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖)采用糖氰化-乙?;椒?進行定量。
[0024] 本發(fā)明中氣相色譜-火焰離子化檢測器色譜分析條件為:色譜柱為TR-1柱,長度 60m,內徑0.32mm,膜厚0.25Mm,載氣:高純氮氣,載氣流量:L5mL/min,進樣口與檢測 器溫度為260°C,進樣量為1ML,分流進樣,分流比為7:1,檢測器氣體流量為干燥空氣:350 mLmirT1,高純氫氣:35mLmirT1和尾吹氣高純氮氣30mLmin'柱溫升溫程序為80°C保 持 2min,5°Cmin_1 升到 240°C保持 5min,再以 20°Cmin_1 升到 280°C保持 15min,一 共運行56min。
[0025] 配制相應濃度的母液,然后按照對應的衍生化方法將母液混合并稀釋成5個濃度 梯度的混合標樣分別進行衍生化并提取,再進行氣相色譜-火焰離子化檢測器分析,并以 目標化合物峰面積與內標物峰面積的比為縱坐標(Y),目標化合物量與內標量(100呢)的 比值為橫坐標(X)進行回歸分析,得到回歸方程及相關參數,將最低濃度的標準溶液按照信 噪比(S/N=3)為3計算方法的最低檢測限(L0D),同時向煙草中添加兩個濃度梯度的水溶性 糖后進行提取,對方法的回收率進行評價,重復5次,從而對方法的精密度(RSD)進行評價。 結果見表1。
【權利要求】
1. 一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:包括以下步驟: A、 煙草及煙草制品中水溶性糖的提?。簩煵輼悠贩鬯楹筮^80-100目篩后,向5 mL萃 取池中放入纖維素濾膜,再放入適量硅藻土,稱取200 mg煙草樣品粉末按照1: 2與硅藻土 混合后放入萃取池,加入內標溶液進行加速溶劑萃?。粚⑻崛∪軇┺D移至10 mL容量瓶中, 再用體積比為1:1的乙醇和水的溶液定容到10 mL后混勻,分別取二個500 y L提取溶液 至2 mL色譜瓶和10 mL離心管中,38 - 40°C條件下氮氣吹干進行衍生化; B、 煙草及煙草制品中水溶性糖的衍生化:(1)肟化-硅烷化:將2 mL色譜瓶中的吹干 殘留物先進行肟化反應,再將肟化產物進行硅烷化,反應后直接用氣相色譜-火焰離子化 檢測器進行檢測;(2)糖氰化-乙?;簩?0 mL離心管中的吹干殘留物先進行糖氰化反 應,再將糖氰化產物進行乙?;磻Y束后用超聲輔助-分散液液微萃取萃取糖氰化-乙 ?;a物; C、 煙草及煙草制品中水溶性糖的衍生化產物的提?。合蚯杌?乙酰化產物中加入氯化 鈉水溶液,再加入提取溶劑進行提取,提取結束后,用100 UL微量進樣針吸取離心管中的 沉淀相,將其轉移至250 y L微量進樣瓶中用氣相色譜-火焰離子化檢測器進行檢測; D、 煙草及煙草制品中水溶性糖的色譜檢測條件:氣相色譜-火焰離子化檢測器色譜分 析條件為:色譜柱為TR-1柱,長度60 m,內徑0.32 mm,膜厚0.25 Mm,載氣:高純氮氣,載氣 流量:1.5 mL/min,進樣口與檢測器溫度為260°C,進樣量為1 ML,分流進樣,分流比為7:1, 檢測器氣體流量為干燥空氣:350 mL mirT1,高純氫氣:35 mL mirT1和尾吹氣高純氮氣30 mL min-1;柱溫升溫程序為80 °C保持2 min,5 °C min_1升到240°C保持5 min,再以20 °C min-1 升到 280°C保持 15 min,一共運行 56 min ; E、 煙草及煙草制品中水溶性糖的定性及定量方法:分別采用保留時間和內標法進行定 性和定量分析。
2. 根據權利要求1所述的一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:所述內標溶液為80 y L濃度為25 mg mL4,以及體積比例為1:1的苯基-beta-D-吡喃葡 萄糖苷乙醇:水溶液。
3. 根據權利要求1所述的一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:所述加速溶劑萃取的條件為:萃取溶劑為體積比例為1:1的乙醇:水溶液、壓力為1500 psi、溫度為80°C、靜態(tài)萃取時間為5 min、靜態(tài)循環(huán)次數為2次、沖洗體積為0%,吹掃時間為 80 s〇
4. 根據權利要求1所述的一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:所述I虧化條件為加入300 ML濃度為25 mg mL4的鹽酸甲輕胺,80°C|虧化10 min。
5. 根據權利要求1所述的一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:所述硅烷化條件為加入100 ML N,0-雙乙酰胺,80°C硅烷化10 min。
6. 根據權利要求1所述的一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:所述糖氰化反應的條件為加入300 ML濃度為25 mg mL4的鹽酸羥胺,80°C糖氰化5 min, 乙?;瘲l件為加入500 ii L乙酸酐溶液,常溫反應5 min。
7. 根據權利要求1所述的一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:所述超聲輔助-分散液液微萃取的條件為加入2. 3 mLll% w/v的氯化鈉水溶液,再加入44 UL三氯甲烷,渦旋混勻1 min后放入超聲波中超聲輔助-分散液液微萃取5 min,微萃取 后放入離心機中4000 rpm離心5 min。
8.根據權利要求1所述的一種煙草及煙草制品中水溶性糖的測定方法,其特征在于:所述內標法定量的方法為果糖采用肟化-硅烷化方法進行定量,木糖、甘露糖、葡萄糖、半 乳糖、肌醇、山梨醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖和蜜二糖10種水溶性糖采用糖氰化-乙?;椒ㄟM 行定量。
【文檔編號】G01N30/02GK104458934SQ201410579991
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】蔡凱, 趙會納, 雷波, 潘文杰, 向章敏 申請人:貴州省煙草科學研究院