一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條及其制備方法
【專利摘要】一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條及其制備方法，屬于免疫檢測【技術(shù)領域】。本發(fā)明應用的抗體是利用從花生粗蛋白中提取純化的Ara h 2免疫雌性BALB/c小鼠得到的高特異性的單克隆抗體。由于采用的是單克隆抗體，穩(wěn)定性和特異性較好，適用于花生過敏原Arah2的快速檢測。CGMCC No.93142014.05.28CGMCC No.93152014.05.28
【專利說明】—種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種花生過敏原成分Ara h 2的免疫膠體金快速檢測試紙條及其制備方法，且可以通過對Ara h 2的監(jiān)測實現(xiàn)對花生過敏原的快速診斷，屬于免疫檢測【技術(shù)領域】。
【背景技術(shù)】
[0002]花生過敏是食物過敏中導致死亡人數(shù)最高的一種。因食物過敏引發(fā)的死亡90%都是由花生導致的?；ㄉ^敏反應因其潛在的危險性、長期性以及不斷增加的發(fā)病率而日益受到重視。
[0003]花生過敏原包括多種蛋白質(zhì)成分，其中Ara h 2是一種分子質(zhì)量為17kDa?20kDa的同種異型蛋白，約占花生蛋白總量的10%。Ara h 2被認為是主要的過敏原成分，90%以上的花生過敏患者對其過敏。因此,可通過對Ara h 2的監(jiān)測實現(xiàn)對花生過敏原的快速診斷。
[0004]目前，對過敏原的定量檢測方法很多，如雙免疫擴散試驗、放射免疫法和高效液相法、聚合酶鏈式反應(PCR)分析法、組胺釋放實驗(HRT)、過敏原指紋圖譜快速檢測方法等。但都存在各自不同的問題，如檢測速度慢、成本高、需要特定的分析儀器等。而免疫層析膠體金試紙條具有操作簡單快速、處理樣品量大、靈敏度高且廉價等優(yōu)點，而且不需要借助專門儀器，適合現(xiàn)場快速檢測，因此對于大量樣品的現(xiàn)場檢測具有重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明目的在于提供一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條，操作簡單，快速方便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低廉，用于食品中花生過敏原的快速大量檢測。
[0006]本發(fā)明另一個目的在于提供一種免疫膠體金試紙條的制備方法，包括抗Ara h 2特異性抗體的制備，Ara h 2雙抗體檢測的配對篩選,Ara h 2免疫膠體金檢測試紙條的制備。該試紙條操作簡便、快速、準確，檢測全過程只需5min，不受環(huán)境條件的干擾，特異性好，檢測靈敏度高，最低檢測限為Ing/mL。
[0007]本發(fā)明適用于醫(yī)院，企業(yè)及普通家庭等，可實現(xiàn)食品或臨床樣本中花生過敏原Arah 2的快速檢測。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條，包括PVC底板，在PVC底板兩端分別設有樣品墊和吸水墊；PVC底板中部設置有硝酸纖維素膜檢測層，在硝酸纖維素膜檢測層與樣品墊之間設置有膠體金結(jié)合墊；所述膠體金結(jié)合墊一端與樣品墊相連接疊放，另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測層上。
[0009]所述硝酸纖維素膜檢測層上依次設置有檢測線和質(zhì)控線。所述膠體金結(jié)合墊包被有金標標記抗Ara h 2抗體Ara h 2-mAb_5 (CGMCC N0.9314)，所述檢測線上包被有抗Arah 2抗體Ara h 2-mAb-l (CGMCC N0.9315)。所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0010]所述花生過敏原Ara h 2的膠體金快速檢測試紙條的制備方法，步驟為: (I)提取花生過敏原粗蛋白:
將新鮮花生仁去皮，經(jīng)高速粉碎機處理得到粉末狀，稱取10g，按1:10 (W/V)浸入石油醚(60?90。0中脫脂,4。(^磁力攪拌下浸提4h, 8000 r/mim離心10 min,棄上清,沉淀反復浸提三次后置于通風櫥使石油醚揮發(fā)得脫脂花生。隨即按1:10 (胃八)浸入0.01 M pH7.4PBS中在4 °C下浸提過夜，8000 r/min離心10 min,棄去沉淀,上清即為花生粗蛋白浸提液。
[0011](2)提取純化 Ara h 2:
在花生粗蛋白浸提液中緩慢加入飽和硫酸銨固體，邊加邊攪拌，加入的完全溶解后才繼續(xù)往后加，直至飽和度為40%，4 °C靜置I h，8000 r/min離心20 min，收集沉淀復溶于0.01 M pH7.4 PBS中，得40%飽和度組分。上清中繼續(xù)加入飽和硫酸銨固體直至飽和度為60%，按上述40%飽和度組分獲得方法得到60%飽和度組分。同樣繼續(xù)往上清中加入硫酸銨得到80%飽和度組分。上述三個分級組分別在0.01 M pH7.4 PBS中透析24 h后用SDS-PAGE鑒定，Ara h 2含量最高的組分再進行凝膠過濾層析分離。對洗脫峰進行SDS-PAGE鑒定，Ara h 2含量最高的洗脫峰將用于下一步實驗。
[0012](3)抗Ara h 2特異性單克隆抗體的制備:
將步驟(2)中提取純化的Ara h 2作為免疫原免疫BALB/c小鼠，多次免疫后用直接ELISA法挑選親和性最高的小鼠進行融合，通過篩選得到6個對Ara h 2具有強親和性的細胞株。
[0013](4)抗Ara h2特異性單克隆抗體的配對篩選:
將步驟(3)得到的細胞株制備抗體純化后分別用辣根過氧化物酶HRP進行標記。標記成功后進行雙抗體夾心ELISA法配對篩選。確定特異性免疫膠體金快速檢測試紙條所需要抗體；Ara h 2-mAb_5為金標抗體，Ara h 2-mAb-l為檢測抗體。
[0014](5)花生過敏原Ara h 2免疫膠體金快速檢測試紙條的制備:
A:膠體金的制備:
米用朽1檬酸鹽還原法用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金溶液:在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%的氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱15-20min至呈亮紅色，然后室溫中冷卻，4°C冷藏保存。
[0015]B -M Ara h2抗體-膠體金標記物的制備:
取步驟A中制備的膠體金溶液，每ImL中加入4μ L 0.1M K2CO3調(diào)節(jié)pH至6，攪拌中滴加 150 μ L 0.2mg/mL 抗體 Ara h 2-mAb_5 (CGMCC N0.9314)，繼續(xù)攪拌 30min，離心，吸取上清，用金標抗體保存液重懸。
[0016]金標抗體重懸液為pH 8.2 的含 10% 蔗糖，0.05% Tween-20,1% BSA, 0.2%PEG20000, 1% PVP-K30 的 0.05M Tris-HCl 溶液。
[0017]C:膠體金結(jié)合墊的制備:
調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的抗Ara h 2抗體Ara h2-mAb-5 (CGMCC N0.9314)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6pL/cm, 37°C烘干過夜，封袋備用。
[0018]D:檢測層的制備:
調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的抗Ara h 2抗體Ara h2-mAb-l (CGMCC N0.9315)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量為0.6pL/cm，37°C烘干過夜，封袋備用。
[0019]E:試紙條的組裝:
將樣品墊，膠體金結(jié)合墊，硝酸纖維素膜，吸水墊由一端依次粘貼在PVC底板上，即得到用于檢測花生過敏原Ara h 2的免疫膠體金層析試紙條。
[0020]生物材料樣品保藏:
一株單克隆細胞株，細胞株S號,株號為Ara h 2-mAb-5,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，登記編號為CGMCC N0.9314，保藏日期為2014年5月28日；
一株單克隆細胞株，細胞株T號，株號為Ara h 2-mAb-l,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，登記編號為CGMCC N0.9315，保藏曰期為2014年5月28日。
[0021]本發(fā)明試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用Ara h 2特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測樣品中是否含有Ara h 2。當待檢樣品中含有Arah 2時,抗原先和膠體金標記的抗Ara h 2抗體Ara h 2-mAb_5結(jié)合，由于層析作用復合物沿檢測層向前移動，當遇到檢測線上的抗Ara h 2抗體Ara h 2-mAb-l時,形成抗體-抗原-金標抗體復合物，在檢測線上富集，形成紅色沉淀線。
[0022]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，費用較低且操作簡單，不需要儀器設備及專業(yè)人員容易普及到食品企業(yè)，醫(yī)院和家庭。檢測速度快，全程僅5min適用于大批量樣品的的現(xiàn)場快速檢測。并且靈敏度高，最低檢測線為Ing/mL。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1 一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條，1、PVC底板，2、樣品墊，3、膠體金結(jié)合墊，4、硝酸纖維素膜檢測層，5、吸水墊，6、檢測線，7、質(zhì)控線；
圖2、一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條的硝酸纖維素膜檢測層示意圖。
[0024]圖3是本發(fā)明花生粗蛋白提取液三個不同飽和度組分的SDS-PAGE電泳圖；
1,2:低分子量標準蛋白；3，6:40%飽和硫酸銨沉淀組分；4，7:60%飽和硫酸銨沉淀組分；5，8:80%飽和硫酸銨沉淀組分；
圖4是本發(fā)明花生粗蛋白提取液的80%飽和硫酸銨沉淀組分的凝膠過濾層析圖；
圖5是本發(fā)明花生粗蛋白提取液的80%飽和硫酸銨沉淀組分經(jīng)凝膠過濾層析后洗脫峰的SDS-PAGE電泳圖；1，2:80%硫酸銨組分;3，4:80%硫酸銨組分第一個洗脫峰(峰1)；5,6:80%硫酸銨組分第二個洗脫峰(峰2) ；M:低分子標準蛋白；
圖6是本發(fā)明制備的Ara h 2膠體金試紙條實際檢測樣品圖；1、5 ppb,2、2.5 ppb,3、2 ppb，4、l ppb，5、0.5 ppb，6、0 ppb。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明通過提取過敏原粗蛋白后作為免疫原，免疫小鼠得到抗體，經(jīng)過細胞融合技術(shù)，得到特異性識別Ara h 2的單克隆抗體。利用該單抗，采用膠體金免疫層析技術(shù)，制備一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條。
[0026]實施例1
(1)提取花生過敏原粗蛋白:
將新鮮花生仁去皮，經(jīng)高速粉碎機處理得到粉末狀，稱取10g，按1:10 (W/V)浸入石油醚(60?90。0中脫脂,4。(^磁力攪拌下浸提4h, 8000 r/mim離心10 min,棄上清,沉淀反復浸提三次后置于通風櫥使石油醚揮發(fā)得脫脂花生。隨即按1:10 (胃八)浸入0.01 M pH7.4PBS中在4 °C下浸提過夜，8000 r/min離心10 min,棄去沉淀,上清即為花生粗蛋白浸提液
(2)提取純化Arah 2:
在花生粗蛋白浸提液中緩慢加入飽和硫酸銨固體，邊加邊攪拌，加入的完全溶解后才繼續(xù)往后加，直至飽和度為40%，4 °C靜置I h，8000 r/min離心20 min，收集沉淀復溶于
0.01 M pH7.4 PBS中，得40%飽和度組分。上清中繼續(xù)加入飽和硫酸銨固體直至飽和度為60%，按上述40%飽和度組分獲得方法得到60%飽和度組分。同樣繼續(xù)往上清中加入硫酸銨得到80%飽和度組分。上述三個分級組分別在0.01 M pH7.4 PBS中透析24 h后經(jīng)SDS-PAGE鑒定，80%飽和度組分中Ara h 2含量最高，對進行凝膠過濾層析分離。對洗脫峰進行SDS-PAGE鑒定，第二個洗脫峰中Ara h 2含量最高。
[0027](3)抗Ara h2特異性單克隆抗體的配對篩選:
將步驟(2)得到的細胞株制備抗體純化后分別用辣根過氧化物酶HRP進行標記。標記成功后進行雙抗體夾心ELISA法配對篩選。確定特異性免疫膠體金快速檢測試紙條所需要抗體；Ara h 2-mAb_5為金標抗體，Ara h 2-mAb-l為檢測抗體。
[0028](4)花生過敏原Ara h 2免疫膠體金快速檢測試紙條的制備:
A:膠體金的制備:
米用朽1檬酸鹽還原法用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金溶液； B:抗Ara h 2抗體-膠體金標記物的制備:
取步驟A中制備的膠體金溶液，每Iml中加入4 μ L 0.1M K2CO3調(diào)節(jié)pH至6，攪拌中滴加 150 μ L 0.2mg/mL 抗體 Ara h 2-mAb_5 (CGMCC N0.9314)，繼續(xù)攪拌 30min,離心，吸取上清，用金標抗體重懸液重懸；
C:膠體金結(jié)合墊的制備:
調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的抗Ara h 2抗體Ara h2-mAb-5 (CGMCC N0.9314)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6pL/cm，37°C烘干過夜，封袋備用；
D:檢測層的制備:
調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的抗Ara h 2抗體Ara h 2-mAb-l(CGMCC N0.9315)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量為0.6pL/cm，37°C烘干過夜，封袋備用；
E:試紙條的組裝:
將樣品墊，膠體金結(jié)合墊，硝酸纖維素膜，吸水墊由一端依次粘貼在PVC底板上，即得到用于檢測花生過敏原Ara h 2的免疫膠體金層析試紙條。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測花生過敏原Ara h 2的膠體金試紙條，其特征在于包括PVC底板(1)，在PVC底板兩端分別設有樣品墊(2)和吸水墊(5) ;PVC底板中部設置有硝酸纖維素膜檢測層(4)，在硝酸纖維素膜檢測層與樣品墊之間設置有膠體金結(jié)合墊(3);所述膠體金結(jié)合墊一端與樣品墊相連接疊放，另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測層上； 所述硝酸纖維素膜檢測層上依次設置有檢測線(6)和質(zhì)控線(7)； 所述膠體金結(jié)合墊包被有金標標記抗Ara h 2抗體Ara h 2-mAb_5，即CGMCC N0.9314 ；所述檢測線上包被有抗Ara h 2抗體Ara h 2-mAb_l，即CGMCC N0.9315 ;所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
2.權(quán)利要求1所述快速檢測花生過敏原Arah 2的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于步驟為: A:膠體金的制備: 米用朽1檬酸鹽還原法用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金溶液； B:抗Ara h 2抗體-膠體金標記物的制備: 取步驟A中制備的膠體金溶液，每lmL中加入4yL 0.1M K2C03調(diào)節(jié)pH至6，攪拌中滴加 150 μ L 0.2mg/mL 抗體 Ara h 2-mAb_5 CGMCC N0.9314，繼續(xù)攪拌 30min,離心，吸取上清，用金標抗體重懸液重懸； 金標抗體重懸液為 pH 8.2 的含 10%蔗糖，0.05% Tween-20,1% BSA, 0.2% PEG20000, 1%PVP-K30 的 0.05M Tris-HCl 溶液； C:膠體金結(jié)合墊的制備: 調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的抗Ara h 2抗體Ara h2-mAb-5 CGMCC N0.9314均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6pL/cm, 37°C烘干過夜，封袋備用; D:檢測層的制備: 調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的抗Ara h 2抗體Ara h 2-mAb-lCGMCC N0.9315均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的羊抗鼠IgG均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量為0.6pL/cm，37°C烘干過夜，封袋備用； E:試紙條的組裝: 將樣品墊，膠體金結(jié)合墊，硝酸纖維素膜，吸水墊由一端依次粘貼在PVC底板上，即得到用于檢測花生過敏原Ara h 2的免疫膠體金試紙條。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述快速檢測花生過敏原Arah 2的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于所述的一株單克隆細胞株，細胞株S號，株號為Ara h 2-mAb-5，為特異性Ara h 2特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記編號為CGMCC N0.9314。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述快速檢測花生過敏原Arah 2的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于所述的一株單克隆細胞株，細胞株T號，株號為Ara h 2-mAb-l，為特異性Ara h 2特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記編號為CGMCC N0.9315。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述快速檢測花生過敏原Arah 2的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于所述單克隆細胞株的制備過程中所用到的免疫原的制備步驟為:對花生粗蛋白浸提液進行40%、60%及80%的飽和硫酸銨分級沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，對80%飽和硫酸銨沉淀組分進行凝膠過濾、層析分離，對洗脫峰進行SDS-PAGE電泳鑒定后，選定第二個洗脫峰作為制備Ara h 2單克隆抗體的免疫原。
【文檔編號】G01N33/68GK104280555SQ201410576447
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】匡華, 彭娟, 胥傳來, 徐麗廣, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學