非洲豬瘟病毒vp73蛋白特異性多克隆抗體的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種非洲豬瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗體的制備方法，旨在提供一種腹水效價(jià)高，親和力高，抗原用量少、操作簡(jiǎn)便的新型多克隆抗體的制備方法。所述的非洲豬瘟病毒多克隆抗體的制備包括：對(duì)ASFV VP73基因序列PCR擴(kuò)增、抗原的制備、動(dòng)物免疫、腹水多克隆抗體提取的步驟。本發(fā)明提供的非洲豬瘟病毒VP73蛋白多克隆抗體與常規(guī)兔源、鼠源抗血清的制備方式相比，該制備方式具有抗原用量少、操作簡(jiǎn)便,非洲豬瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗體可以用于非洲豬瘟病毒VP73抗體的檢測(cè)，為我國非洲豬瘟病的防控提供重要的技術(shù)手段。
【專利說明】非洲豬瘟病毒VP73蛋白特異性多克隆抗體的制備方法及 應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及抗非洲豬瘟病毒抗原性結(jié) 構(gòu)蛋白VP73蛋白特異性腹水多克隆抗體，以及制備方法和用途。
[0002] 非洲豬癌（African swine fever, ASF)主要是由非洲豬癌病毒（African swine fever virus，ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (OIE)規(guī)定的法定報(bào)告動(dòng)物疫病。臨床上以高熱、皮膚充血、內(nèi)臟器官出血、高死亡率為特 征。非洲豬瘟自1921由肯尼亞首次報(bào)道以來，已蔓延至非洲、歐洲、美洲加勒比海地區(qū)和歐 亞接壤地區(qū)的49個(gè)國家。無論在非洲豬瘟新發(fā)地區(qū)還是流行地區(qū)，疫情的爆發(fā)和流行都會(huì) 對(duì)發(fā)病國家產(chǎn)生嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響。非洲豬瘟雖然不感染人，但對(duì)于那些把豬肉及其相 關(guān)豬制品作為主要?jiǎng)游锏鞍讈碓吹膰遥侵挢i瘟的流行大大降低了豬產(chǎn)品的供應(yīng)能力， 改變當(dāng)?shù)鼐用竦娘嬍辰Y(jié)構(gòu)，間接對(duì)人體健康造成危害。
[0003] ASFV屬于雙鏈DNA病毒目（dsDNA)、非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae)、非洲豬瘟 病毒屬（Asfivirus)，而且是其唯一已知的代表物種。ASFV有囊膜呈二十面體對(duì)稱，平均直 徑200nm，結(jié)構(gòu)復(fù)雜?；蚪M約為170-192kb，與痘病毒相似，具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、末端反向重復(fù) 序列以及早期RNA合成所必需的酶。整個(gè)基因組有151個(gè)0RF，其編碼的蛋白中有131種病 毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能已有報(bào)道。
[0004] ASFV可以編碼34種以上的結(jié)構(gòu)蛋白，VP73蛋白作為ASFV主要的抗原性結(jié)構(gòu)蛋 白，包含396個(gè)氨基酸，分子量約為44. 8KDa，抗原性穩(wěn)定，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，選 擇ASFV VP73蛋白作為免疫原制備特異性的單克隆抗體、多克隆抗體，從而建立ELISA、免 疫印跡技術(shù)、間接免疫熒光等方法來檢測(cè)ASF具有明顯的優(yōu)勢(shì)性。
[0005] 2007年至2014年7月，越來越多的國家遭受到非洲豬瘟的侵襲，先后在格魯吉亞、 亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯、烏克蘭、白俄羅斯等國暴發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威 脅我國的養(yǎng)豬業(yè)。俄羅斯：6月20日-7月8日在卡盧加州、斯摩棱斯克州、普斯科夫州、諾 夫哥羅德州發(fā)生12起非洲豬瘟疫情，發(fā)病野豬5頭，病死野豬4頭，野豬病死率80%，撲殺 野豬1頭；發(fā)病豬34頭，病死豬23頭，病死率67. 65%。拉托維亞：7月2日-13日發(fā)生11 起非洲豬瘟疫情，發(fā)病野豬10頭，病死野豬9頭，銷毀野豬1頭；發(fā)病豬4頭，撲殺豬47頭。 波蘭：6月-7月在波德拉謝省發(fā)生4非洲起豬瘟疫情，發(fā)病野豬12頭，病死野豬12頭。立 陶宛：2014年7月底，在立陶宛伊格納利納區(qū)一家大型農(nóng)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)大規(guī)模非洲豬瘟疫情，該農(nóng) 場(chǎng)約2萬頭豬都被宰殺，以防止疫情擴(kuò)散。8月，立陶宛又在烏泰納區(qū)一家私人農(nóng)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)非 洲豬瘟疫情。
[0006] 隨著非洲豬瘟流行的區(qū)域在逐漸擴(kuò)大并有蔓延至我國的風(fēng)險(xiǎn)，已經(jīng)引起我國的獸 醫(yī)工作者們的高度重視并開展相關(guān)儲(chǔ)備性研究，針對(duì)ASFV相關(guān)基因的多克隆抗體的制備 已有相關(guān)報(bào)道，多是采用將抗原免疫兔或大鼠收獲抗血清，如李洪利等（2012)利用原核表 達(dá)的VP73蛋白免疫新西蘭大白兔獲得抗VP73蛋白多克隆抗體的高免血清；如何提供一種 快速、經(jīng)濟(jì)、特異性良好的多克隆抗體制備方法無疑會(huì)加速我國對(duì)非洲豬瘟免疫學(xué)研究以 及及早的建立非洲豬瘟血清學(xué)檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。
[0007] 目前，實(shí)驗(yàn)室制備多克隆抗體一般采用將提純的病毒核芯顆?；虮磉_(dá)抗原免疫大 白兔或大鼠后獲得相應(yīng)的兔源、鼠源的抗血清多克隆抗體，但未見利用腹水制備多克隆抗 體的制備方法。本發(fā)明首次提出了抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗體的制備，制備的腹水多 克隆抗體特異性效果等同于常規(guī)抗血清制備方法獲得的多克隆抗體，但與常規(guī)方法相比， 腹水多克隆抗體的制備有著抗原用量少、經(jīng)濟(jì)、易操作、腹水可反復(fù)抽取等優(yōu)點(diǎn)，制備的腹 水多克隆抗體已通過本實(shí)驗(yàn)在Western blot、ELISA等檢測(cè)技術(shù)上成功應(yīng)用。制備的ASFV VP73蛋白腹水多抗能與VP73原核表達(dá)蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而對(duì)照無蛋白帶出現(xiàn)，說明所 獲得的多抗對(duì)VP73原核表達(dá)蛋白具有良好的特異性。因此，腹水多克隆抗體的制備方法可 以代替常規(guī)抗血清制備多克隆抗體方法，不僅對(duì)研究ASFV VP73蛋白的功能有重大意義，而 且對(duì)建立特異、敏感、快速的ASFV免疫學(xué)檢測(cè)方法（如ELISA)也有重要的意義。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0008] 本發(fā)明的目的在于，提供一種經(jīng)濟(jì)、易操作、抗體特性好的抗ASFV VP73蛋白腹水 多克隆抗體的制備方法。腹水多克隆抗體的制備方法可以代替常規(guī)抗血清制備多克隆抗體 方法。
[0009] 本發(fā)明的內(nèi)容涉及一種非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性多克隆抗體的制備方 法，包括如下步驟：
[0010] a)制備VP73蛋白重組抗原：將VP73基因序列擴(kuò)增至原核表達(dá)載體GEX-KG中，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白抗原；
[0011] b)動(dòng)物免疫：取步驟a)獲得的重組蛋白抗原30 μ g與等體積的弗氏完全佐劑充 分乳化制成免疫原，選擇8周齡雌性Balb/c小鼠，分別在第1、15、30天對(duì)小鼠進(jìn)行第一、 二、三次免疫；
[0012] c)加強(qiáng)免疫：取步驟a)獲得的重組蛋白抗原30 μ g作為免疫原，在步驟b)中第 三次免疫后45天,對(duì)小鼠進(jìn)行免疫；
[0013] d)對(duì)步驟c)加強(qiáng)免疫7天后的小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7天后，接種IXlO5 個(gè)SP2/0細(xì)胞；
[0014] e)步驟d)接種P2/0細(xì)胞7?10天后采集腹水，腹水中含有所述非洲豬瘟病毒 VP73蛋白的特異性多克隆抗體。
[0015] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括根據(jù)方法制備獲得的非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性多克 隆抗體。
[0016] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括所述的非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性多克隆抗體在制備 非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0017] 具體的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0018] 1.抗原的制備和純化：對(duì)ASFV VP73基因序列PCR擴(kuò)增，并插入BamHI/XhoI酶切 位點(diǎn)，將擴(kuò)增的片段克隆至原核表達(dá)載體PGEX-KG中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì) 胞，挑取經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定后的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；將提取的表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE分 析，Western blot檢測(cè)免疫原性，6Xhis標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化表達(dá)的VP73蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度作為抗原備用。
[0019] 2.動(dòng)物免疫和多克隆抗體制備：以純化的原核表達(dá)可溶性重組VP73蛋白為免疫 抗原，其制備方法包括如下步驟：
[0020] (1)選擇8周齡雌性Balb/c小鼠，取30 μ g重組蛋白抗原與等體積的弗氏完全佐 劑充分乳化后第一次免疫，皮下3?4點(diǎn)注射；
[0021] (2)在第一次免疫后的第15天和第30天，分別進(jìn)行第二次、第三次免疫，均取 30 μ g重組蛋白抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化做皮下3?4點(diǎn)注射；
[0022] (3)第三次免疫后45天，第四次加強(qiáng)免疫注射抗原溶液，不加佐劑；
[0023] (4)加強(qiáng)免疫7天后，腹腔注射0. 5mL降植烷，7天后，腹腔注射I X IO5個(gè)SP2/0細(xì) 胞；
[0024] (5)接種SP2/0細(xì)胞7?10天后采集腹水，腹水中含有非洲豬瘟病毒VP73蛋白的 特異性多克隆抗體。
[0025] 3.多克隆抗體的應(yīng)用：制備的多克隆抗體可用于ELISA、Western blot、間接免疫 熒光等檢測(cè)。
[0026] 本發(fā)明的抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白腹水多克隆抗體特異性強(qiáng)、腹水效價(jià)高，得到 的腹水多克隆抗體效價(jià)可以達(dá)到I :50000以上。本發(fā)明提供的非洲豬瘟病毒VP73蛋白多克 隆抗體，與常規(guī)兔源、鼠源抗血清的制備方式相比，該制備方式具有抗原用量少、操作簡(jiǎn)便， 非洲豬瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗體可以用于非洲豬瘟病毒VP73抗體和抗原的檢 測(cè)方法，為我國非洲豬瘟病的防控提供重要的技術(shù)手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1為重組原核表達(dá)質(zhì)粒pKG-VP73的酶切鑒定；圖中：M為DNA Marker，1為陽性 克隆酶切鑒定；
[0028] 圖2為原核表達(dá)重組蛋白pKG-VP73的SDS-PAGE及Western blot分析；
[0029] 圖3為ASFV VP73融合表達(dá)蛋白的SDS-PAGE純化分析；
[0030] 圖4為抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定；
[0031] 圖5為抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗體與VP73原核表達(dá)蛋白Western blot結(jié) 果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合實(shí)施對(duì)本發(fā)明的腹水多克隆抗體的制備方法作進(jìn)一步描述。
[0033] 實(shí)施例1、非洲豬瘟病毒VP73抗原的制備和純化
[0034] L通過檢索Genebank上發(fā)表的ASFV VP73基因序列（Genebank登錄號(hào)： S89966. 1)，優(yōu)化設(shè)計(jì)VP73基因全長(zhǎng)序列，氨基端加入起始密碼子ATG，羧基端加入6XHis 標(biāo)簽及終止密碼子。合成含有VP73基因全長(zhǎng)序列的質(zhì)粒，合成的VP73基因長(zhǎng)度為1188bp。 利用Primer Premier5. 0設(shè)ii^一對(duì)特異性引物（分別在上下游引物引入BamHI和XhoI酶 切位點(diǎn)），通過PCR擴(kuò)增得到1188bp的非洲豬瘟病毒VP73基因片段。
[0035] 2.對(duì)ASFV VP73基因序列PCR擴(kuò)增，并插入BamHI/XhoI酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增片段克 隆至原核表達(dá)載體PGEX-KG中，連接克隆至大腸桿菌感受態(tài)BL21 (DE3)菌株，提取質(zhì)粒后， 經(jīng)測(cè)序、PCR和雙酶切鑒定，選取VP73基因讀碼框正確的陽性克?。ê?jiǎn)稱pKG-VP73);
[0036] 3.無堿基突變的重組質(zhì)粒pKG-VP73轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21 (DE3)后，將所得 陽性菌液接種到含相應(yīng)抗生素（1:1000)的LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為l.Ommol/L的 IPTG，37°C誘導(dǎo)3h。以1:100的接種量接入到含相應(yīng)抗生素（Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，置于 37°C搖床上，180r/min振蕩培養(yǎng)12h，第二天以相同的處理方式，振蕩培養(yǎng)使培養(yǎng)基0D600 值達(dá)到0. 6?0. 8之間，加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為I. Ommol/L，繼續(xù)振蕩誘導(dǎo)3h。BL21 菌液和空載體菌液同時(shí)以I. Ommol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h。
[0037] 4. 6Xhis標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化表達(dá)的VP73蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度作為 抗原備用。按照 Thermo 公司 B_PERTM6XHis Fusion Protein Purification Kit 說明書對(duì) 誘導(dǎo)表達(dá)的VP73蛋白純化，加入適量的Protein Stabilizing Cocktail,使用分光光度儀 或Pierce BCA Protein Assay kit測(cè)定蛋白濃度，適量分裝后置于-80°C保存?zhèn)溆?。使?Pierce BCA Protein Assay kit測(cè)定純化后VP73蛋白的蛋白質(zhì)濃度，讀取562納米處的吸 光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出VP73純化蛋白的濃度為2. 24mg/mL。
[0038] 5.試驗(yàn)結(jié)果
[0039] (1)VP73重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0040] 圖1所示PKG-VP73陽性克隆酶切鑒定結(jié)果，經(jīng)測(cè)序鑒定分析后，全長(zhǎng)1188bp的 VP73基因連同基因末端His標(biāo)簽與載體上的GST標(biāo)簽融合，且閱讀框正確。
[0041] (2) VP73重組蛋白的表達(dá)及純化
[0042] 將PKG-VP73陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果（圖 2)，融合蛋白的相對(duì)分子量為71KDa，與預(yù)期結(jié)果相符，Western blot結(jié)果顯示，在VP73 融合表達(dá)的蛋白帶處出現(xiàn)特異性反應(yīng)，而空載體蛋白對(duì)照沒有反應(yīng)，表明融合表達(dá)產(chǎn)物對(duì) ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清具有良好的免疫反應(yīng)性（圖2)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)6Xhis標(biāo)簽蛋白純化試劑 盒純化（圖3)，BCA法測(cè)定蛋白濃度為2. 24mg/mL，置于-80°C保存作為抗原備用。
[0043] 實(shí)施例2、非洲豬瘟病毒VP73蛋白特異性小鼠腹水多克隆抗體的制備；
[0044] 1.用提純的重組蛋白抗原免疫Balb/c小鼠：選擇8周齡的雌性Balb/c小鼠，初 次免疫取30 μ g重組蛋白抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化做皮下3?4點(diǎn)注射，免 疫劑量0.2mL。第二次免疫、第三次免疫時(shí)用等量的表達(dá)抗原與等體積的弗氏不完全佐劑乳 化，作皮下多點(diǎn)注射。每次免疫間隔兩周。免疫后45天，每只小鼠用30yg提純的表達(dá)抗 原作腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。每次免疫期結(jié)束后對(duì)免疫小鼠和對(duì)照小鼠（未免疫）斷尾采 血，以5ug/mL的純化蛋白VP73作包被抗原包被酶標(biāo)板,檢測(cè)血清效價(jià)。
[0045] 2. SP2/0細(xì)胞注射入Balb/c小鼠腹腔制備多抗腹水：小鼠加強(qiáng)免疫7天后，腹腔 注射0. 5mL Pristane (降植烷），7天后，腹腔注射I X IO5個(gè)SP2/0細(xì)胞，接種細(xì)胞7?10 天左右后可產(chǎn)生腹水，而小鼠瀕于死亡之前，采集腹水，處死小鼠。用滴管將腹水吸入試管 中，腹水可反復(fù)收集數(shù)次。一般一只小鼠可獲5?IOmL腹水。
[0046] 3. Western blot檢測(cè)：將VP73原核表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè) 空載體蛋白為陰性對(duì)照，電泳結(jié)束后，采用濕法轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜（NC膜），以待檢的腹水 為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的 DAB底物顯色液顯色后并拍照。結(jié)果如圖5所示，VP73腹水多抗能與VP73原核表達(dá)蛋白發(fā) 生特異性結(jié)合，而對(duì)照無蛋白帶出現(xiàn)，說明所獲得的多抗對(duì)VP73原核表達(dá)蛋白具有良好的 特異性。蛋白大小分別約為71KDa，VP73原核表達(dá)蛋白與該多抗具有良好的免疫反應(yīng)性，
[0047] 4.腹水多克隆抗體的提取及效價(jià)測(cè)定：待免疫小鼠腹水征象明顯時(shí)采集腹水，將 所得的腹水做倍比稀釋，純化蛋白作包被抗原，采用間接ELISA方法檢測(cè)多抗的效價(jià)，結(jié)果 顯示，該多抗經(jīng)1:50000稀釋后的0D450值仍可達(dá)到1. 392,說明制備的鼠源ASFV VP73腹 水多克隆抗體效價(jià)可以達(dá)到I :50000以上（圖4)。
[0048] 表IASFV VP73多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
[0049]
【權(quán)利要求】
1. 一種非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟： a) 制備VP73蛋白重組抗原：將VP73基因序列擴(kuò)增至原核表達(dá)載體GEX-KG中，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白抗原； b) 動(dòng)物免疫：取步驟a)獲得的重組蛋白抗原30 yg與等體積的弗氏完全佐劑充分乳 化制成免疫原，選擇8周齡雌性Balb/c小鼠，分別在第1、15、30天對(duì)小鼠進(jìn)行第一、二、三 次免疫； c) 加強(qiáng)免疫：取步驟a)獲得的重組蛋白抗原30 iig作為免疫原，在步驟b)中第三次 免疫后45天,對(duì)小鼠進(jìn)行免疫； d) 對(duì)步驟c)加強(qiáng)免疫7天后的小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7天后，接種IXlO5個(gè) SP2/0細(xì)胞； e) 步驟d)接種SP2/0細(xì)胞7?10天后采集腹水，腹水中含有所述非洲豬瘟病毒VP73 蛋白的特異性多克隆抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備獲得的非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性多克隆抗 體。
3. 權(quán)利要求2所述的非洲豬瘟病毒VP73蛋白的特異性多克隆抗體在制備非洲豬瘟病 毒抗體檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104311660SQ201410554643
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】陶虹, 花群義, 呂建強(qiáng), 曹琛福, 劉建利, 靳雯雯, 楊俊興, 張彩虹, 孫潔, 唐金明, 廖立珊 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心