人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒及其制備方法

人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫診斷【技術領域】，具體涉及一種微粒子化學發(fā)光法人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒及其制備方法。試劑盒由測HIV抗體磁微粒、測HIV抗體示蹤結合物、陰性對照、Ⅰ型陽性對照、Ⅱ型陽性對照、分析緩沖液組成，本發(fā)明還公開了該檢測試劑盒的制備方法，其采用的是微粒子化學發(fā)光免疫分析技術，比ELISA具有更高的靈敏度和特異性，適合于臨床艾滋病毒的輔助診斷。
【專利說明】人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種免疫診斷技術，具體地說是一種磁微粒作為載體的人類免疫缺陷 病毒抗體檢測試劑盒及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV)是一種感染人類免疫 系統(tǒng)細胞的慢病毒，屬反轉錄病毒的一種。普遍認為，人類免疫缺陷病毒的感染導致艾滋病 (AIDS, Acquired Immune Deficiency Syndrome,后天免疫缺乏綜合癥，或譯作"愛滋病")， 艾滋病是后天性細胞免疫功能出現(xiàn)缺陷而導致嚴重隨機感染及/或繼發(fā)腫瘤并致命的一 種疾病。艾滋病自1981年在美國被識別并發(fā)展為全球大流行，至2003年底，已累計導致兩 千余萬人死亡。人類免疫缺陷病毒通常也俗稱為"艾滋病病毒"或"艾滋病毒"。
[0003] HIV病毒呈球形或卵圓形顆粒，直徑100-140nm，是帶有包膜的RNA逆轉錄病毒，在 分類上屬于逆轉錄病毒科中的慢病毒亞科。HIV病毒單拷貝基因組RNA長約9. 2-9. 7Kb。 目前發(fā)現(xiàn)有HIV-1和HIV-2兩型，這兩種類型在生物學特性上很相似，它們的基因組有 40%-50%的同源性，其中兩種病毒的核心蛋白具有高度的交叉反應。HIV有三個主要的結構 基因：env、gag、pol，他們分別編碼產生不同功能的蛋白質即抗原，抗原會引起機體免疫應 答從而產生相應的抗體。
[0004] HIV侵入機體后，一般在6周左右產生免疫應答，產生抗體。血清中首先出現(xiàn)HIV 前體p55抗體和核心蛋白p24 ;然后出現(xiàn)外膜蛋白gpl20抗體，跨膜糖蛋白gp41抗體，其他 的如P66和p32的抗體也陸續(xù)出現(xiàn)。經過幾個月至幾年后，當病毒再次出現(xiàn)在血液中，血清 中的p24、p55抗體水平下降，而其他抗體持續(xù)存在或水平上升。通過檢測這些不同抗體來 診斷是否感染HIV。在我國流行的主要是HIV-1型。
[0005] 愛滋病毒是透過交換體液來傳播的，特別是精液和血液。最常見的傳染途徑是：進 行陰道或肛門性交，共用沾污了的針筒，受病毒感染的母親傳播給嬰兒。另外，亦有越來越 多個案顯示，感染了病毒的母親可經喂母乳而把病毒傳給嬰兒。
[0006] 如果不進行治療，根據(jù)HIV不同亞型，感染艾滋病毒后的的凈存活時間平均為9至 11年，而診斷為AIDS之后，如果在資源受限導致無法治療的情況下，根據(jù)不同的研究表明， 平均存活時間在6至19個月之間。而在醫(yī)療資源充足的地區(qū)，用高效抗逆轉錄藥物（HAART) 的作為有效治療手段治療HIV感染者和AIDS患者，可以讓死亡率減少80%，并能將新診斷出 的HIV感染者的壽命延長最少30年。
[0007] 至今還沒有研制成功可以預防艾滋的疫苗，防治艾滋只有早期進行診斷，才能在 早期進行治療并防治病情的進一步惡化，否則將會傳染給他人和使自身病情加重、影響身 體健康和傳給后代。因此有必要開發(fā)出一種性能較好的診斷方法，能有效地在早期就將該 疾病診斷出來，及時治療，減少因艾滋帶來的健康和財產的損失。
[0008] 人類免疫缺陷病毒抗體的傳統(tǒng)檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、膠體金法及化學發(fā)光檢 測法，這些方法雖然具有很多優(yōu)點，但在檢測的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等方面還有待進一 步提高。全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析是在酶免疫分析基礎上結合了高靈敏度的化學發(fā) 光測定技術和磁性微粒分離技術，與其他方法相比，這種方法有許多獨特的優(yōu)點，首先它用 順磁性微粒作為固相載體，由于顆粒體積小，表面積大，擴大了反應面積，大大提高了檢測 靈敏度；其次由于使用全自動儀器及配套試劑，使人為因素減至最低，提高了方法的穩(wěn)定性 和結果的重復性，同時也使得批內差異與批間差異都較小。與放射免疫法相比，微粒子化 學發(fā)光法除具有高靈敏度、高精確度、高可靠性等優(yōu)點外，還具有如下優(yōu)點：a.無放射性污 染，穩(wěn)定性好；b.特異性高；c.試劑可隨用隨取，測定方便迅速，可作為急診檢測項目。根據(jù) 大量的實驗結果以及臨床應用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及其發(fā)展前景來看，該方法 逐漸成為取代放射性免疫分析和酶免疫分析的首選。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種具有高靈敏度 和特異性，適合于臨床人類免疫缺陷病毒的輔助診斷的微粒子化學發(fā)光法HIV抗體檢測試 劑盒及其制備方法。
[0010] 本發(fā)明解決上述技術問題采用的技術方案是：一種人類免疫缺陷病毒抗體檢測試 劑盒，其包括測HIV抗體磁微粒、測HIV抗體示蹤結合物、陰性對照、I型陽性對照、II型陽 性對照、分析緩沖液，所述測HIV抗體磁微粒為標記有HIV抗原（gp41、gp36)的磁性微粒子； 測HIV抗體示蹤結合物為標記有HIV抗原（gp41、gp36)的異魯米諾；I型陽性對照為含有 HIV-1抗體的人血清/血漿；II型陽性對照為含有HIV-2抗體的兔血清/血漿；分析緩沖液 為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
[0011] 本發(fā)明還提供了上述人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征是： 具體步驟如下： (1)制備測HIV抗體磁微粒將帶羧基磁微粒與EDC按質量比1 : 2,磁微粒與gp41 的比例為每毫克磁微粒標記2(^g的gp41，磁微粒與gp36的比例為每毫克磁微粒標記25Pg 的gp36,在22~26°C條件下進行混勻標記，標記時間1小時；標記后采用甘氨酸封閉多余的 位點，使之濃度達到25mM，反應0. 5小時，洗滌三次，加入磁微粒保存液(含1%牛血清白蛋白 的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng))，使之終濃度達到每20 μ L測HIV抗體磁微粒中分別含有6(^g的 磁微粒標記gp41抗原和5〇μ〖的磁微粒標記gp36抗原，2~8°C保存。
[0012] (2)制備測HIV抗體示蹤結合物 HIV抗原（gp41、gp36)與異魯米諾的標記，反 應體系為：戊二醛使用濃度為1. 〇%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，gp41與異魯米諾的質 量比為1 : 5,在22?26°C反應1.5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01MPBS進行透析，透析后加入 等體積甘油-20°C存放；戊二醛使用濃度為1. 0%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，，gp36與 異魯米諾的質量比為1 : 5,在22?26°C反應1.5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進行透 析，透析后加入等體積甘油_20°C存放；將異魯米諾標記HIV抗原用示蹤結合物稀釋液(含 20%小牛血清的0. 01MPBS緩沖系統(tǒng))分別按稀釋比例為異魯米諾標記gp41抗原1 : 4000 稀釋，異魯米諾標記gp36抗原1 : 3000稀釋，最終組成測HIV抗體示蹤結合物。
[0013] (3)制備陰、陽性對照 選用5份以上HIV抗體檢測為陰性的人血清或血漿混 合，經60°C、1小時處理后，除菌過濾，于2?8°C保存，作為陰性對照；選用5份以上HIV-1 抗體檢測為陽性的人血清或血漿混合，經60°C、1小時處理后，除菌過濾，于2?8°C保存，作 為I型陽性對照；選用HIV-2抗體檢測為陽性的兔血清或血漿稀釋后，經60°C、1小時處理 后，除菌過濾，于2?8°C保存，作為II型陽性對照。
[0014] (4)制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉0.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉 8. 50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳萊1.0g/L,按上述配方配制稀釋液。
[0015] 本發(fā)明的原理是利用微粒子化學發(fā)光免疫分析技術，采用雙抗原夾心法，在磁微 粒固相標記上HIV抗原（gp41、gp36)，加入待測樣本，反應形成磁微粒標記抗原-抗體結合 物，溫育后加入異魯米諾標記的HIV抗原，反應后形成磁微粒標記抗原-抗體-異魯米諾標 記抗原復合物，建立免疫反應與化學發(fā)光的聯(lián)系。加入激發(fā)液催化標記抗原的異魯米諾發(fā) 出425nm的光，樣本中HIV抗體的含量與發(fā)光值（RLU)呈正相關，根據(jù)S/C0值對樣本檢測 結果進行判斷。
[0016] 本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點是采用了微粒子化學發(fā)光免疫分析技術，比ELISA具有更高 的靈敏度和更好的特異性。

【具體實施方式】
[0017] 本發(fā)明試劑盒采用微粒子化學發(fā)光免疫分析技術，檢測血清或血漿中是否存在 HIV抗體。下面具體描述HIV抗體檢測試劑盒及其制備方法。
[0018] 一種人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒，其包括測HIV抗體磁微粒、測HIV抗體示 蹤結合物、陰性對照、I型陽性對照、II型陽性對照、分析緩沖液。所述測HIV抗體磁微粒 為標記有HIV抗原（gp41、gp36)的磁性微粒子；測HIV抗體示蹤結合物為標記有HIV抗原 (gp41、gp36)的異魯米諾；I型陽性對照為含有HIV-1抗體的人血清/血漿；II型陽性對照 為含有HIV-2抗體的兔血清/血漿；分析緩沖液為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
[0019] 本發(fā)明上述HIV抗體檢測試劑盒的制備方法，其具體步驟如下： (1)制備測HIV抗體磁微粒將帶羧基磁微粒與EDC按質量比1 : 2,磁微粒與gp41 的比例為每毫克磁微粒標記2(^g的gp41，磁微粒與gp36的比例為每毫克磁微粒標記25Pg 的gp36,在22~26°C條件下進行混勻標記，標記時間1小時；標記后采用甘氨酸封閉多余的 位點，使之濃度達到25mM，反應0. 5小時，洗滌三次，加入磁微粒保存液(含1%牛血清白蛋白 的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng))，使之終濃度達到每20 μ L測HIV抗體磁微粒中分別含有6(^g的 磁微粒標記gp41抗原和5〇μ〖的磁微粒標記gp36抗原，2~8°C保存。
[0020] (2)制備測HIV抗體示蹤結合物 HIV抗原（gp41、gp36)與異魯米諾的標記，反 應體系為：戊二醛使用濃度為1. 〇%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，gp41與異魯米諾的質 量比為1 : 5,在22?26°C反應1.5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01MPBS進行透析，透析后加入 等體積甘油-20°C存放；戊二醛使用濃度為1. 0%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，，gp36與 異魯米諾的質量比為1 : 5,在22?26°C反應1.5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進行透 析，透析后加入等體積甘油_20°C存放；將異魯米諾標記HIV抗原用示蹤結合物稀釋液(含 20%小牛血清的0. 01MPBS緩沖系統(tǒng))分別按稀釋比例為異魯米諾標記gp41抗原1 : 4000 稀釋，異魯米諾標記gp36抗原1 : 3000稀釋，最終組成測HIV抗體示蹤結合物。
[0021] (3)制備陰、陽性對照 選用5份以上HIV抗體檢測為陰性的人血清或血漿混 合，經60°C、1小時處理后，除菌過濾，于2?8°C保存，作為陰性對照；選用5份以上HIV-1 抗體檢測為陽性的人血清或血漿混合，經60°C、1小時處理后，除菌過濾，于2?8°C保存，作 為I型陽性對照；選用HIV-2抗體檢測為陽性的兔血清或血漿稀釋后，經60°C、1小時處理 后，除菌過濾，于2?8°C保存，作為II型陽性對照。
[0022] (4)制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉0.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉 8. 50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫柳萊1.0g/L,按上述配方配制稀釋液。
[0023] 本發(fā)明上述各種原材料的選擇要求如下： 1、標記用HIV抗原的選擇 首先就抗原的外觀、濃度、純度和效價進行研究，抗原 應為澄清透明的液體，不含異物，無搖不散的沉淀；用紫外吸收法檢測其蛋白含量應不低 于lmg/mL ;SDS-PAGE檢測純度應主帶清晰，無明顯雜帶；效價應不低于標示效價且不低于 1 : 10000,研究結果表明HIV抗原完全可用于本發(fā)明試劑盒的制備。
[0024] 2、磁微粒的選擇通過對磁微粒的外觀，標記蛋白的比率，磁響應性，磁微粒吸附 一致性等方面進行分析，經過多次分析研究，將磁微?；靹?，在燈光下觀察，易分散，無聚 集，無異物；將蛋白采用不同的方法進行標記，標記率應大于90% ;將磁微粒置370-380特斯 拉的磁鐵上，觀察磁微粒的聚集速度，分散均勻的磁微粒在10秒鐘內完全聚集；磁微粒吸 附一致性CV < 10%。研究結果表明直徑為0. 90-1. 10 μ m的磁微粒，含有羧基基團，標記率 最高，可用于本發(fā)明診斷試劑盒的制備。
[0025] 3、異魯米諾的選擇將異魯米諾用DMS0(二甲基亞砜）進行溶解，用純化水進行 稀釋至1. 2 X 1(Γ5Μ的量，加入10 μ L異魯米諾液體，各加入200 μ L激發(fā)液，測定其發(fā)光值， 發(fā)光值應> 160000,經過研究，符合要求的異魯米諾可作為發(fā)光的原料。
[0026] 本發(fā)明HIV抗體檢測試劑盒檢測樣品中HIV抗體的檢測方法是：首先取出濃縮洗 液，用純化水按照倍數(shù)進行稀釋。而后取出激發(fā)Α液和Β液，放置全自動化學發(fā)光測定儀合 適的位置。激發(fā)A液為含有4%NaOH的緩沖液，激發(fā)B液為含有0. 12%H202的緩沖液。接著 將試劑盒從冰箱中取出后，放于儀器試劑區(qū)至少混勻30分鐘后方可使用，并嚴格按照設定 的程序進行加樣和溫育。
[0027] 具體加樣方法如下：50 μ L血清/血漿樣本、100 μ L分析緩沖液以及20 μ L測HIV 抗體磁微粒在37°C的條件下反應20分鐘，加入150 μ L測HIV抗體示蹤結合物，37°C反應 20分鐘，再用稀釋后的洗液洗滌3次，最終分別加入200 μ L激發(fā)A液和激發(fā)B液，測定發(fā)光 值，根據(jù)S/C0值對樣本檢測結果進行判斷。
[0028] 本發(fā)明質量控制要求是：試劑盒中的陰、陽性對照用于試驗過程控制。陰性對照檢 測結果（S/C0)不得高于0. 8,陽性對照檢測結果（S/C0)不得低于10。
[0029] 本發(fā)明試劑盒檢測HIV抗體國家參考品，檢測的結果顯示：該試劑盒的陰、陽性參 考品符合率、最低檢出限、精密度、穩(wěn)定性等各項質量指標均符合國家要求。陰性符合率： 20份陰性參考品符合率20/20 ;陽性符合率：20份陽性參考品符合率20/20,且P12 > P11 ; 最低檢出限檢測：SI、S2均為陰性，S3、S4、S5和S6均為陽性；精密度：10孔檢測變異系數(shù) (CV)彡15% ;穩(wěn)定性：試劑各組分于37°C放置6天，檢定結果達到標準。
[0030] 本發(fā)明試劑盒由河南中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院、河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院、中國 人民解放軍第一五三中心醫(yī)院、中國人民解放軍艾滋病檢測確認實驗室、北京市疾病預防 控制中心五家臨床檢測機構進行臨床考核，結果： (1)河南中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院考核307例陰性樣本和3例陽性樣本，本發(fā)明試劑盒陰 性樣本307例全部檢出，陽性樣本3例全部檢出。該試劑盒陰性檢出率為100%，陽性檢出率
【權利要求】
1. 一種人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒，其包括測HIV抗體磁微粒、測HIV抗體示蹤 結合物、陰性對照、I型陽性對照、II型陽性對照、分析緩沖液，其特征是：所述測HIV抗體 磁微粒為分別標記有HIV抗原gp41和HIV抗原gp36的磁性微粒子混合物；測HIV抗體示 蹤結合物為分別標記有HIV抗原gp41和HIV抗原gp36的異魯米諾混合物；I型陽性對照 為含有HIV-1抗體的人血清/血漿；II型陽性對照為含有HIV-2抗體的兔血清/血漿；分析 緩沖液為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
2. -種制備權利要求1所述人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征是 具體步驟如下： (1) 制備測HIV抗體磁微粒 將帶羧基磁微粒與EDC按質量比1 : 2,磁微粒與HIV 抗原gp41的比例為每毫克磁微粒標記2(^g的HIV抗原gp41，磁微粒與HIV抗原gp36的 比例為每毫克磁微粒標記25Pg的HIV抗原gp36,在22~26°C條件下進行混勻標記，標記時 間1小時；標記后采用甘氨酸封閉多余的位點，使之濃度達到25禮，反應0. 5小時，洗滌三 次，加入磁微粒保存液，所述磁微粒保存液為含1%牛血清白蛋白的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng)，使 之終濃度達到每20 μ L測HIV抗體磁微粒中分別含有6(^g的磁微粒標記HIV抗原gp41和 5(^g的磁微粒標記HIV抗原gp36, 2?8°C保存； (2) 制備測HIV抗體示蹤結合物 HIV抗原gp41、HIV抗原gp36與異魯米諾的標 記，反應體系為：戊二醛濃度為1. 0-2. 0%，HIV抗原gp41與異魯米諾的質量比為1 : 5,在 22?26°C反應1. 5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進行透析，透析后加入等體積甘油-20°C 存放；戊二醛濃度為1. 0-2. 0%，HIV抗原gp36與異魯米諾的質量比為1 : 5,在22?26°C反 應1. 5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進行透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放；將 異魯米諾標記HIV抗原用示蹤結合物稀釋液，所述示蹤結合物稀釋液為含20%小牛血清的 0.01MPBS緩沖系統(tǒng)，分別按稀釋比例為異魯米諾標記gp41抗原1 : 4000稀釋，異魯米諾 標記gp36抗原1 : 3000稀釋，最終組成測HIV抗體示蹤結合物； (3 )制備陰、陽性對照 選用5份以上HIV抗體檢測為陰性的人血清或血漿混合，經 60°C、1小時處理后，除菌過濾，于2?8°C保存，作為陰性對照；選用5份以上HIV-1抗體檢 測為陽性的人血清或血漿混合，經60°C、1小時處理后，除菌過濾，于2?8°C保存，作為I型 陽性對照；選用HIV-2抗體檢測為陽性的兔血清或血漿稀釋后，經60°C、1小時處理后，除菌 過濾，于2?8°C保存，作為II型陽性對照； (4)制備分析緩沖液磷酸二氫鈉0.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、 牛血清白蛋白l〇g/L、硫柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液。
3. 根據(jù)權利要求2所述人類免疫缺陷病毒抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于： 步驟（2)中戊二醛使用濃度為1. 25%。
【文檔編號】G01N33/543GK104090101SQ201410346920
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權日:2014年7月21日
【發(fā)明者】姚繼承, 李曉燕, 饒志明, 聞雯, 劉海光 申請人:威海威高生物科技有限公司