一種用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)甾體生物堿的堿含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)甾體生物堿的堿含量測定方法，包括以下步驟：(1)配置培養(yǎng)基；(2)愈傷組織培養(yǎng)；(3)生根培養(yǎng)；(4)生物堿的提取與制備；(5)精密稱取步驟(4)中制備的樣品，減壓蒸餾濃縮揮發(fā)回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱靜置一定的時(shí)間備用；(6)高效液相色譜分析測定峰面值；(7)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；(8)甾體生物堿含量的測定：根據(jù)步驟(6)中測得的峰面值和步驟(7)中的回歸方程計(jì)算出樣品的甾體生物堿含量。本發(fā)明利用超聲技術(shù)，溶劑使用量相對較少，降低成本，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾溶劑，借助于真空泵降低系統(tǒng)內(nèi)壓力，降低液體的沸點(diǎn)，較低溫度下得到生物堿濃縮液。
【專利說明】一種用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)留體生物堿的堿含量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)留體生物堿的堿含量測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)提取生物堿的方法有煎煮法、浸潰法、回流法和滲漉法操作簡單易行，能夠提取較多的有效成分，但提取過程中存在著能耗大、有效成分損耗大、雜質(zhì)較多、效率較低等問題。隨著物理科學(xué)的發(fā)展，針對傳統(tǒng)提取過程中存在的問題，一些新技術(shù)應(yīng)用于生物堿提取工藝中，新技術(shù)的強(qiáng)化作用或流體在超臨界狀態(tài)下進(jìn)行萃取，大大提高了提取效率，降低了過程能耗，因其顯著優(yōu)勢而成為研究熱點(diǎn)。孫志良等探索出提取白毛藤生物堿比較合適的方法:生物堿及其生物堿鹽都能溶于甲醇或乙醇，但甲醇毒性很大，應(yīng)采用95%乙醇回流提取，然后減壓回收溶劑得生物堿粗品，將生物堿粗品溶于酸水，用親脂性有機(jī)溶劑除去不溶于水的脂溶性雜質(zhì)，再酸水堿化使生物堿游離，用氯仿萃取，回收氯仿得到脂溶性生物堿。剩下的堿性水母液需用極性較大的有機(jī)溶劑正丁醇萃取，回收正丁醇得到水溶性生物堿。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)留體生物堿的堿含量測定 方法，利用超聲技術(shù)，溶劑使用量相對較少，降低成本，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾溶劑，借助于真空泵降低系統(tǒng)內(nèi)壓力，降低液體的沸點(diǎn)，較低溫度下得到生物堿濃縮液。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0005]一種用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)留體生物堿的堿含量測定方法，包括以下步驟:
[0006](I)配置培養(yǎng)基:
[0007]&、愈傷組織培養(yǎng)基？1、？2、？3、？4、？8或卩10，
[0008]13、生根培養(yǎng)基？1、？2、？3、？4或卩10，
[0009]所述的Pl 為 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖，P2 為 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L蔗糖，P3 為 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖，P4 為 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖，P8 為MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖，PlO 為 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖；
[0010]上述各培養(yǎng)基在滅菌前調(diào)pH值均為5.8，加入10g/L瓊脂，且在1.1kg/cm2,121°C飽和蒸氣下滅菌20min ；
[0011](2)愈傷組織培養(yǎng):超凈工作臺(tái)上取出白英組培種子苗，把子葉切成0.3*0.3cm的見方小片或?qū)⑾屡咻S切成Icm長的小段接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度22±2攝氏度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行暗培養(yǎng)，在接種后第30天統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況；
[0012](3)生根培養(yǎng):把芽從基部切下，接種到生根培養(yǎng)基中，到接種后第30天時(shí)，對生根情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；
[0013](4)生物堿的提取與制備:將步驟(2)和(3)中的待測組織洗凈37°C下烘干，并粉碎至40目，準(zhǔn)確稱取1.0g，置于超聲波清洗器中用50ml95%乙醇水溶液超聲提取30min，以同樣的方法超聲提取第二次，經(jīng)過濾渣棄去，合并二次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾濃縮，揮發(fā)回收乙醇，得濃縮液，濃縮液溶于稀酸溶液至PH值為3，過濾，濾液加氨水至pH值為10，過濾，得清夜，置冰箱中備用；
[0014](5)精密稱取步驟(4)中制備的樣品，減壓蒸餾濃縮揮發(fā)回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱靜置一定的時(shí)間備用；
[0015](6)高效液相色譜分析測定峰面值:所述的液相色譜條件如下:
[0016]色譜柱:Cosmosil5C18AR-1I(250X4.6mm);
[0017]流動(dòng)相:乙腈一磷酸二氫鉀(75:25)；
[0018]檢測波長:205nm;流速:1.0mL/min ；
[0019]進(jìn)樣量IOyL,柱溫:25°C ; [0020](7)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密吸取對照品0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg用冰乙酸定容至5mL，在20°C靜置一定的時(shí)間備用，以步驟(6)中的液相條件，高效液相色譜分析法測定各濃度對照品的吸光度，對所測得的數(shù)據(jù)采用直線回歸法計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:y =1185050.6095x-37397.6623，其中y為峰面值，x為樣品堿含量，其中相關(guān)系數(shù)r = 0.9960，r為樣品含量與吸光度二組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，與朗伯.比爾定律相符；
[0021](8)甾體生物堿含量的測定:根據(jù)步驟(6)中測得的峰面值和步驟(7)中的回歸方程y = 1185050.6095χ-37397.6623，其中y為峰面值，x為樣品堿含量，計(jì)算出樣品的甾體生物堿含量。
[0022]本發(fā)明的有益效果如下:
[0023]本發(fā)明用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)甾體生物堿的堿含量測定方法，利用超聲技術(shù)縮短提取時(shí)間、提聞提取率，并且無需加熱，提聞了熱敏性生物喊的提取率且對其生理活性基本沒有影響，溶劑使用量相對較少，降低成本。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾溶劑，借助于真空泵降低系統(tǒng)內(nèi)壓力，降低液體的沸點(diǎn)，較低溫度下得到生物堿濃縮液。高效液相色譜分析法具有高、靈敏度高、分離速度快，適用范圍廣、重現(xiàn)性好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0025]本發(fā)明用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)留體生物堿的堿含量測定方法，包括以下步驟:
[0026](I)配置培養(yǎng)基:
[0027]&、愈傷組織培養(yǎng)基？1、？2、？3、？4、？8或卩10，
[0028]13、生根培養(yǎng)基？1、？2、？3、？4或卩10，
[0029]其中Pl 為 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖，P2 為 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L 蔗糖，P3 為 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖，P4 為 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖，P8 為MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖，PlO 為 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖；
[0030]上述各培養(yǎng)基在滅菌前調(diào)pH值均為5.8，加入10g/L瓊脂，且在1.1kg/cm2,121°C飽和蒸氣下滅菌20min ；
[0031](2)愈傷組織培養(yǎng):超凈工作臺(tái)上取出白英組培種子苗，把子葉切成0.3*0.3cm的見方小片或?qū)⑾屡咻S切成Icm長的小段接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度22±2攝氏度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行暗培養(yǎng)，在接種后第30天統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況；
[0032](3)生根培養(yǎng):把芽從基部切下，接種到生根培養(yǎng)基中，到接種后第30天時(shí)，對生根情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；
[0033](4)生物堿的提取與制備:將待測器官洗凈37°C下烘干，并粉碎至40目，準(zhǔn)確稱取1.0g，置于超聲波清洗器中用50ml95%乙醇水溶液超聲提取30min，以同樣的方法超聲提取第二次，經(jīng)過濾渣棄去，合并二次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾濃縮，揮發(fā)回收乙醇，得濃縮液，濃縮液溶于稀酸溶液至PH值為3，過濾，濾液加氨水至pH值為10，過濾，得清夜，直冰箱中備用；
[0034](5)精密稱取步驟⑷中制備的樣品，減壓蒸餾濃縮揮發(fā)回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱靜置一定的時(shí)間備用；
[0035](6)高效液相色譜分析測定樣品的峰面值，見表1:
[0036]表1
【權(quán)利要求】
1.一種用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)留體生物堿的堿含量測定方法，其特征在于包括以下步驟: (1)配置培養(yǎng)基: a、愈傷組織培養(yǎng)基PUP2、P3、P4、P8或P10， b、生根培養(yǎng)基P1、P2、P3、P4或P10，
所述的 Pl 為 MS+NAA0.2+6-BA0.2+30g/L 蔗糖，P2 為 MS+NAA0.2+6-BA0.5+30g/L 蔗糖，P3 為 MS+NAA0.2+6-BA0.8+30g/L 蔗糖，P4 為 MS+NAA0.2+6-BA1.0+30g/L 蔗糖，P8 為MS+NAA1.5+6-BA2.0+30g/L 蔗糖，PlO 為 MS+NAA1.0+6-BA2.0+30g/L 蔗糖； 上述各培養(yǎng)基在滅菌前調(diào)PH值均為5.8，加入10g/L瓊脂，且在1.1kg/cm2,121°C飽和蒸氣下滅菌20min ； (2)愈傷組織培養(yǎng):超凈工作臺(tái)上取出白英組培種子苗，把子葉切成0.3*0.3cm的見方小片或?qū)⑾屡咻S切成Icm長的小段接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度22±2攝氏度的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行暗培養(yǎng)，在接種后第30天統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況； (3)生根培養(yǎng):把芽從基部切下，接種到生根培養(yǎng)基中，到接種后第30天時(shí)，對生根情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； (4)生物堿的提取與制備:將步驟(2)和(3)中的待測組織洗凈37°C下烘干，并粉碎至40目，準(zhǔn)確稱 取1.0g，置于超聲波清洗器中用50ml95%乙醇水溶液超聲提取30min，以同樣的方法超聲提取第二次，經(jīng)過濾渣棄去，合并二次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾濃縮，揮發(fā)回收乙醇，得濃縮液，濃縮液溶于稀酸溶液至pH值為3，過濾，濾液加氨水至pH值為10，過濾，得清夜，置冰箱中備用； (5)精密稱取步驟(4)中制備的樣品，減壓蒸餾濃縮揮發(fā)回收乙醇，用5mL冰醋酸配制成溶液，在冰箱靜置一定的時(shí)間備用； (6)高效液相色譜分析測定峰面值:所述的液相色譜條件如下: 色譜柱:Cosmosil5C18AR-1I(250X4.6mm)； 流動(dòng)相:乙腈一磷酸二氫鉀(75:25)； 檢測波長:205nm ;流速:1.0mL/min ； 進(jìn)樣量10 μ L，柱溫:25°C ; (7)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密吸取對照品0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mg用冰乙酸定容至5mL,在20°C靜置一定的時(shí)間備用，以步驟(6)中的液相條件，高效液相色譜分析法測定各濃度對照品的吸光度，對所測得的數(shù)據(jù)采用直線回歸法計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:y =.1185050.6095x-37397.6623，其中y為峰面值，x為樣品堿含量，其中相關(guān)系數(shù)r = 0.9960，r為樣品含量與吸光度二組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，與朗伯.比爾定律相符； (8)甾體生物堿含量的測定:根據(jù)步驟(6)中測得的峰面值和步驟(7)中的回歸方程y=1185050.6095X-37397.6623，其中y為峰面值，x為樣品堿含量，計(jì)算出樣品的留體生物堿含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104020227SQ201410216205
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】呂洪飛, 姜波, 梁宗鎖, 祁哲晨, 楊東風(fēng), 陳紹寧, 皮二旭, 李華磊 申請人:浙江理工大學(xué)