Ngal光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、其制備及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，包括如下步驟：活化發(fā)光微球：將發(fā)光微球通過配制的碳二亞胺及Sulfo-NHS溶液在PBS緩沖液中活化，發(fā)光微球?yàn)轸然揎棸l(fā)光微球，發(fā)光微球中包被有二甲基噻吩、蒽、紅熒烯且?guī)в袖B螯合物；抗NGAL抗體偶聯(lián)發(fā)光微球：選取羧基修飾發(fā)光微球，將抗NGAL單克隆抗體與活化的羧基修飾發(fā)光微球混合反應(yīng)以偶聯(lián)抗體到微球上，并且在混合抗體和活化微球的同時(shí)加入了新鮮配置的碳二亞胺；生物素標(biāo)記抗NGAL抗體；親和素標(biāo)記感光微球。還涉及其制備及使用方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)方法靈敏度低、檢測(cè)容易受環(huán)境干擾的問題。
【專利說明】NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、其制備及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及脂質(zhì)運(yùn)載蛋白含量檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種人體內(nèi)中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、其制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前最常用的NGAL檢測(cè)方法是膠體金免疫檢測(cè)分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)；
[0003]但本 申請(qǐng)人:在使用膠體金、CLIA方法時(shí)發(fā)現(xiàn)這些方法存在著一些缺陷:膠體金檢測(cè)靈敏度不高，且無法準(zhǔn)確定量；CLIA影響因素較多，例如易受環(huán)境干擾，發(fā)光時(shí)間短，并且為非開放性試劑，試劑價(jià)格高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、其制備及使用方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)方法靈敏度低、檢測(cè)容易受環(huán)境干擾的問題。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，包括如下步驟:
[0007](I)活化發(fā)光微球；
[0008](2)抗NGAL抗體偶聯(lián)發(fā)光微球；
[0009](3)生物素標(biāo)記抗NGAL抗體；
[0010](4)親和素標(biāo)記感光微球。
[0011]在上述技術(shù)方案中，步驟(I)中，將發(fā)光微球通過配制的碳二亞胺及Sulfo-NHS溶液在PBS緩沖液中活化,所述發(fā)光微球?yàn)轸然揎棸l(fā)光微球，所述發(fā)光微球中包被有二甲基噻吩、蒽、紅熒烯且?guī)в袖B螯合物。
[0012]在上述技術(shù)方案中，步驟(2)中，將抗NGAL單克隆抗體與活化的發(fā)光微球混合反應(yīng)以偶聯(lián)抗體到微球上，并且在混合抗體和活化微球的同時(shí)加入了新鮮配置的碳二亞胺
[0013]在上述技術(shù)方案中，步驟(3)中，所述新鮮配置的碳二亞胺為50mg/mL，偶聯(lián)方法為室溫震蕩2小時(shí)。
[0014]在上述技術(shù)方案中，所述抗NGAL抗體偶聯(lián)發(fā)光微球步驟中，發(fā)光微球與NGAL抗體的質(zhì)量比例為10-50:1。
[0015]在上述技術(shù)方案中，所述生物素標(biāo)記抗NGAL抗體步驟中，生物素與抗體的分子比例為 10-50:lo
[0016]在上述技術(shù)方案中，所述生物素與抗體的分子比例為為30:1。
[0017]在上述技術(shù)方案中,所述感光微球帶有酞菁染料。
[0018]根據(jù)以上任一技術(shù)方案所述方法制備的NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
[0019]以上任一技術(shù)方案所述的試劑盒的使用方法，其特征在于:包括如下步驟:
[0020]I)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、用于NGAL的檢測(cè)微球和生物素標(biāo)記的抗NGAL抗體，混合反應(yīng)；
[0021]2)再加入親和素包被的感光微球進(jìn)行第二步反應(yīng)；
[0022]3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。
[0023]本發(fā)明利用光激化學(xué)發(fā)光的方式，即利用感光微球和發(fā)光微球之間的單線態(tài)氧傳遞作用來發(fā)光，實(shí)現(xiàn)兩種微球的結(jié)合即發(fā)光，使檢測(cè)特異性提高；發(fā)光材料包裹在發(fā)光微球的顆粒中，不容易受環(huán)境干擾，有更高的特異性和穩(wěn)定性；本發(fā)明制備試劑盒過程中，采用羧基化發(fā)光微球和單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，反應(yīng)時(shí)間比現(xiàn)有的醛基化發(fā)光微球偶聯(lián)時(shí)間短，且反應(yīng)效率高，有利于提高試劑的檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明在抗NGAL抗體偶聯(lián)發(fā)光微球步驟中同時(shí)加入新鮮配置的EDC，使偶聯(lián)抗體效率更高，在測(cè)試時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性更好，測(cè)試準(zhǔn)確性更高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理示意圖。
[0025]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線性范圍圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0027]實(shí)施例1.[0028]1.發(fā)光微球與抗體連接: [0029](I)抗體、微球準(zhǔn)備:將0.1mg抗體加入到超濾管中，離心8min，用緩沖液(ρΗ8.0)PBS緩沖液重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。微球用PBS (pH8.0)重懸為20mg/ml。
[0030](2)活化發(fā)光微球(所有試劑使用前回復(fù)到室溫)
[0031]量取Img發(fā)光微球，加入ImLPBS(pH7.4)后渦旋，懸液加入到1.5mL離心管中，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入IOOyL的清洗緩沖液PBS(P H7.4),0.05%Tween-20懸浮，震蕩并超聲后12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入ImL的PBS緩沖液(ρΗ6.2)，接著先加入10μL新鮮配置的EDC(50mg/mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后，在室溫震搖20分鐘。12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入Im L的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)或者硼酸鹽緩沖液(pH7.8)懸浮發(fā)光微球。
[0032](3)抗體偶聯(lián)發(fā)光微球
[0033]取NGAL單克隆抗體1_50 μ g加入到ImL上述活化后的發(fā)光微球中，室溫震蕩2小時(shí)。12000g離心，小心吸出并棄去上清液。用500yL的PBS緩沖液洗一次，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的PBS緩沖液(1% BSA, P H 7.4)懸浮發(fā)光微球，在室溫震搖30分鐘，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L的PBS緩沖液(0.1%BSA, 0.02% Tween-20, P H 7.4)洗滌發(fā)光微球，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。最后用 150yL 的PBS 緩沖液(0.1 % BSA, 0.02% Tween-20, # 0.05% Proclin-300, p H 7.4)懸浮發(fā)光微球，于4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>
[0034]2.生物素與抗體連接:
[0035](I)抗體準(zhǔn)備:將另一株Img抗NGAL抗體加入到超濾管中，離心8min。用緩沖液(pH8.0) PBS或碳酸緩沖液重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到5mg/ml備用。[0036](2)生物素化:將20 μ L上述抗體溶液中加入7.6 μ L2mg/mL生物素中(用DMSO配
制)，室溫振動(dòng)鮮育4h。
[0037](3)抗體洗滌:超濾管超濾去除多余的生物素。
[0038]3.親和素標(biāo)記感光微球
[0039]在離心管中加入Img感光微球，加入1.25μ L質(zhì)量濃度10%的Tween_20、0.1mg親和素、10μ L硼氫化氰鈉(0.4Μ)，用0.1Μ、ρΗ6.0的2_(Ν_嗎啉)乙磺酸MES緩沖液或者0.1MHepes緩沖液將體積補(bǔ)充到200 μ L，37°C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)；加入10 μ L0.3Μ、ρΗ5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37°C避光孵育I小時(shí)后離心，分離得到已連接親和素的感光微球，稀釋后備用。
[0040]實(shí)施例2
[0041]1.發(fā)光微球與抗體連接:
[0042](I)抗體、微球準(zhǔn)備:將0.1mg抗體加入到超濾管中，離心8min，用緩沖液(ρΗ8.0)PBS緩沖液重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。微球用PBS (pH8.0)重懸為20mg/ml。
[0043](2)活化發(fā)光微球(所有試劑使用前回復(fù)到室溫)
[0044]量取Img發(fā)光微球，加入ImLPBS(pH7.4)后渦旋，懸液加入到1.5mL離心管中，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入IOOyL的清洗緩沖液PBS(P H7.4),0.05%Tween-20懸浮，震蕩并超聲后12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入ImL的PBS緩沖液(ρΗ6.2)，接著先加入10μL新鮮配置的EDC(50mg/mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后，在室溫震搖20分鐘。12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入ImL的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)或者硼酸鹽緩沖液(pH7.8)懸浮發(fā)光微球。
[0045](3)抗體偶聯(lián)發(fā)光微球
[0046]取NGAL單克隆抗體1_50 μ g加入到ImL以上步驟(2)活化后的發(fā)光微球中，接著加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/mL)，室溫震蕩2小時(shí)。12000g離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L的PBS緩沖液洗一次，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的PBS緩沖液(I % BSA, P H 7.4)懸浮發(fā)光微球，在室溫震搖30分鐘，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入500μ L的PBS緩沖液(0.1% BSA，0.02% Tween-20，P H 7.4。)洗滌發(fā)光微球，12000g離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150yL的PBS緩沖液(0.1%BSA,0.02% Tween-20,含0.05% Proclin-300, pH7.4)懸浮發(fā)光微球，于4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>
[0047]2.生物素與抗體連接:
[0048](I)抗體準(zhǔn)備:將另一株Img抗NGAL抗體加入到超濾管中，離心8min。用緩沖液(pH8.0) PBS或碳酸緩沖液重復(fù)洗滌6次后，抗體稀釋到5mg/ml備用。
[0049](2)生物素化:將20 μ L上述抗體溶液中加入7.6 μ L2mg/mL生物素中(用DMSO配制)，室溫振動(dòng)鮮育4h。
[0050](3)抗體洗滌:超濾管超濾去除多余的生物素。
[0051]3.親和素標(biāo)記感光微球
[0052]在離心管中加入Img感光微球，加入1.25μ L質(zhì)量濃度10%的Tween_20、0.1mg親和素、10μ L硼氫化氰鈉(0.4Μ)，用0.1Μ、ρΗ6.0的2_(Ν_嗎啉)乙磺酸MES緩沖液或者0.1MHepes緩沖液將體積補(bǔ)充到200 μ L，37°C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)；加入10 μ L0.3Μ、ρΗ5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37°C避光孵育I小時(shí)后離心，分離得到已連接親和素的感光微球，稀釋后備用。
[0053]實(shí)施例3
[0054]試劑盒的制備
[0055]按所述用量取各組分:
[0056]
HEPES0.6g
TritonX-100I4JmL
CaseinO, I g
Dextran 50010Omg
[0057]加入90mL水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4，水補(bǔ)足到lOOmL，制成分析緩沖液。
[0058](I)使用分析緩沖液稀釋偶聯(lián)NGAL抗體的發(fā)光微球(實(shí)施例1或2中制備)濃度到 50 μ g/mL ；
[0059](2)使用分析緩沖液稀釋生物素化抗體，抗體濃度調(diào)整為0.5mg/mL ；
[0060](3)使用分析緩沖液稀釋偶聯(lián)親和素標(biāo)記感光微球?yàn)?0 μ g/mL。
[0061]實(shí)施例4
[0062]檢測(cè)實(shí)施例1試劑盒線性:
[0063]配制濃度為Ong/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL、5000ng/mL 的NGAL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在96孔板中每孔分別加入20 μ L標(biāo)準(zhǔn)品(終濃度Ong/mL - 5000ng/mL)每孔分別加入40 μ L生物素化抗NGAL抗體，終濃度4ηΜ。每孔加入40 μ L偶聯(lián)抗NGAL抗體的發(fā)光微球(濃度50 μ g/mL)。室溫暗處溫育0.5-1小時(shí)加入100 μ L親和素偶聯(lián)的感光微球，終濃度40 μ g/mL,室溫暗處溫育0.5-1小時(shí)后上機(jī)讀數(shù)。
[0064]如上用本發(fā)明實(shí)施例1所制備的NGAL含量檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，繪制各檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見附圖2)。
[0065]檢測(cè)實(shí)施例2試劑盒線性:
[0066]配制濃度為Ong/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL,、5000ng/mL的NGAL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在96孔板中每孔分別加入20 μ L標(biāo)準(zhǔn)品(終濃度Ong/mL - 5000ng/mL)每孔分別加入40 μ L生物素化抗NGAL抗體，終濃度4ηΜ。每孔加入40 μ L偶聯(lián)抗NGAL抗體的發(fā)光微球(濃度50 μ g/mL)。室溫暗處溫育0.5-1小時(shí)加入100 μ L親和素偶聯(lián)的感光微球，終濃度40 μ g/mL,室溫暗處溫育0.5-1小時(shí)后上機(jī)讀數(shù)。
[0067]如上用本發(fā)明實(shí)施例2所制備的NGAL含量檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，繪制各檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見附圖2)。從附圖2可以看出本發(fā)明實(shí)施例1所制備的檢測(cè)試劑盒能保持良好的線性，NGAL濃度為5000ng/mL時(shí)方法無Hook效應(yīng).與丹麥BioportoDiagnostics公司NGAL檢測(cè)試劑盒具有較好的相關(guān)性(R2 = 0.9988)，實(shí)施例2的結(jié)果表明在混合蛋白和活化微球的同時(shí)加入新鮮配置的EDC后，偶聯(lián)的抗體效率更高。測(cè)試的時(shí)候，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性更好，測(cè)試準(zhǔn)確性更高。
[0068]實(shí)施例5
[0069]本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)確度及精確性檢測(cè)試驗(yàn)
[0070]分別測(cè)定3組低值(200ng/mL)、中值(600ng/mL)、高值(800ng/mL),對(duì)各血清質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定，各設(shè)20個(gè)復(fù)孔，計(jì)算各質(zhì)控品檢測(cè)值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值。批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為4.89%~5.93%和6.76%~8.96%。
[0071]表1檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)確度及精確性檢測(cè)
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)活化發(fā)光微球； (2)抗NGAL抗體偶聯(lián)發(fā)光微球； (3)生物素標(biāo)記抗NGAL抗體； (4)親和素標(biāo)記感光微球。
2.如權(quán)利要求1所述的制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:步驟(I)中，將發(fā)光微球通過配制的碳二亞胺及Sulfo-NHS溶液在PBS緩沖液中活化，所述發(fā)光微球?yàn)轸然揎棸l(fā)光微球，所述發(fā)光微球中包被有二甲基噻吩、蒽、紅熒烯且?guī)в袖B螯合物。
3.如權(quán)利要求1所述的制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:步驟(2)中，將抗NGAL單克隆抗體與活化的發(fā)光微球混合反應(yīng)以偶聯(lián)抗體到微球上，并且在混合抗體和活化微球的同時(shí)加入了新鮮配置的碳二亞胺
4.如權(quán)利要求1所述的制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述新鮮配置的碳二亞胺為50mg/mL，偶聯(lián)方法為室溫震蕩2小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:所述抗NGAL抗體偶聯(lián)發(fā)光微球步驟中，發(fā)光微球與NGAL抗體的質(zhì)量比例為10-50: I。
6.如權(quán)利要求1所述的制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:所述生物素標(biāo)記抗NGAL抗體步驟中，生物素與抗體的分子比例為10-50:1。
7.如權(quán)利要求4所述的制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:所述生物素與抗體的分子比例為為30:1。
8.如權(quán)利要求1所述的制備NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的方法，其特征在于:所述感光微球帶有酞菁染料。
9.根據(jù)以上任一權(quán)利要求所述方法制備的NGAL光激發(fā)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
10.如權(quán)利要求7所述的試劑盒的使用方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、用于NGAL的檢測(cè)微球和生物素標(biāo)記的抗NGAL抗體，混合反應(yīng)； 2)再加入親和素包被的感光微球進(jìn)行第二步反應(yīng)； 3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103954776SQ201410197672
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】華權(quán)高, 來祥兵, 徐春雷, 沈鶴霄, 許可 申請(qǐng)人:華權(quán)高