專利名稱：一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種用于乙肝檢測(cè)的試劑盒，尤其是涉及一種采用酶標(biāo)記生物素-鏈霉親和素技術(shù)的乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染引起的一種嚴(yán)重危害人們身體健康的傳染病，據(jù)WHO報(bào)告，全世界HBV攜帶者約3.5億人。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)人群乙肝表面抗原(HBsAg)的檢出率達(dá)10.09%，HBsAg攜帶者達(dá)1.2億，男性高于女性(10.3%對(duì)7.29%)，農(nóng)村高于城市(10.2%對(duì)7.9%)，總感染率高達(dá)35.5% 61.1%，其中慢性肝炎占56%。全球每年有一百萬人死于肝衰或肝癌，乙肝已經(jīng)成為全球第9位死亡原因。對(duì)于乙肝病毒的檢測(cè)與預(yù)防是我國(guó)目前首要任務(wù)之一。乙肝5項(xiàng)，包括乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)、乙肝病毒表面抗體(Hepatitis B surface antibody,抗HBs)、乙肝病毒 e 抗原(Hepatitis B eAntigen, HBeAg)、乙肝病毒e抗體(Hepatitis B e Antibody,抗HBe)以及乙肝病毒核心抗體(Hepatitis B core antibody,抗HBc)是目前最常用的乙肝檢測(cè)手段。常用的方法檢測(cè)出HBsAg陰性的人群中，有11.0%HBV-DNA呈陽(yáng)性反應(yīng)，也就是說，常規(guī)的檢測(cè)方法可能有
11.0%的漏檢率，究其原因主要是由于抗原含量低于現(xiàn)行方法的可檢出水平。另外，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法只能提供定性結(jié)果，最高也只能進(jìn)行滴度的分析，在臨床使用上有一定的局限性，特別是在療效觀察和疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上存在著明顯的不足，故需要一種新的既靈敏快捷準(zhǔn)確又不太昂貴的方法來填補(bǔ)這一缺陷。因此對(duì)于乙肝5項(xiàng)的定量研究變得尤為重要。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)乙肝5項(xiàng)的定量檢測(cè)大多采用國(guó)外進(jìn)口試劑盒，價(jià)格昂貴，成本花費(fèi)巨大，而我國(guó)人口 眾多，對(duì)于乙肝5項(xiàng)檢測(cè)的需求量很多，長(zhǎng)期使用進(jìn)口試劑盒不僅在經(jīng)濟(jì)上是高額的負(fù)擔(dān)，也不利于大量的使用。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供采用酶標(biāo)記生物素-鏈霉親和素技術(shù)的一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。本實(shí)用新型包括包被的微孔反應(yīng)板、生物素標(biāo)記物、堿性磷酸酶標(biāo)記物、中和試劑、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物液和濃縮清洗液。所述微孔反應(yīng)板為包被有鏈霉親和素的微孔板，所述微孔反應(yīng)板的材料為聚苯乙烯；所述生物素標(biāo)記物共有5種生物素標(biāo)記物，分別為生物素標(biāo)記的乙肝表面抗體、生物素標(biāo)記的乙肝表面體原、生物素標(biāo)記的乙肝e抗體1、生物素標(biāo)記的乙肝e抗體2和生物素標(biāo)記的乙肝核心抗原，所述生物素標(biāo)記的乙肝e抗體I和生物素標(biāo)記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述生物素標(biāo)記的乙肝e抗體I用于乙肝e抗原檢測(cè)，生物素標(biāo)記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測(cè)；所述堿性磷酸酶標(biāo)記物共有5種堿性磷酸酶標(biāo)記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物，乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物I，乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物，所述堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體I用乙肝e抗原檢測(cè)，堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測(cè)；所述堿性磷酸酶標(biāo)記物共有5種堿性磷酸酶標(biāo)記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物1、乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物，所述堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體2的分子成份相同，工作濃度不同，所述堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體I用于乙肝e抗原檢測(cè)，堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體2用于乙肝e抗體檢測(cè)；所述中和試劑為中和試劑乙肝e抗原；所述校準(zhǔn)品包括乙肝病毒表面抗原校準(zhǔn)品、乙肝病毒表面抗體校準(zhǔn)品、乙肝病毒e抗原校準(zhǔn)品、乙肝病毒e抗體校準(zhǔn)品和乙肝病毒核心抗體校準(zhǔn)品共5種校準(zhǔn)品，其中乙肝病毒表面抗原校準(zhǔn)品的濃度包括 200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL、0ng/mL共6個(gè)濃度，乙肝病 毒表面抗體校準(zhǔn)品的濃度包括1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6個(gè)濃度，乙肝病毒e抗原校準(zhǔn)品的濃度包括40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.lNCU/mL、0NCU/mL 共 6 個(gè)濃度，乙肝病毒 e 抗體校準(zhǔn)品的濃度包括 0.4NCU/mL、lNCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL 共 6 個(gè)濃度，乙肝病毒 c 抗體校準(zhǔn)品的濃度包括 4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL共6個(gè)濃度；所述發(fā)光底物液為金剛烷胺衍生物csro。本實(shí)用新型可采用以下方法制備:I)制備鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板鏈霉親和素用包被緩沖液稀釋,取反應(yīng)板,將稀釋的鏈霉親和素加入反應(yīng)板中，預(yù)包被后，甩去包被緩沖液，再加入封板緩沖液，置37°c恒溫放置2h，去掉封板緩沖液，烘干后，加干燥劑密封，得鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板；所述包被緩沖液為pH9.6、50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3沖溶液，所述鏈霉親和素稀釋濃度為8 μ g/mL ;所述稀釋的鏈霉親和素的加入量可為每反應(yīng)板150 μ L ;所述預(yù)包被的條件可置37°C恒溫放置2h進(jìn)行預(yù)包被；所述封板緩沖液的加入量可為每反應(yīng)板加入150 μ L封板緩沖液；所述烘干的條件可于37°C干燥室烘干2h ;所述封板緩沖液為0.01mol/L TBS-T再加上1%BSA、0.2%明膠；所述干燥室的相對(duì)濕度度小于30% ；2)制備校準(zhǔn)品系列(I)配制乙肝表面抗原校準(zhǔn)品將高值乙肝表面抗原用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)重復(fù)標(biāo)定3次，3次標(biāo)定值，取均值作為標(biāo)定的表面抗原乙肝表面抗原濃度，所述校準(zhǔn)品稀釋液由0.05mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.01mmol/L的氯化鈉的1%的牛血清白蛋白及10%新生牛血清組成，pH值7.4，乙肝表面抗原作標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL、0ng/mL,分裝成 0.5mL/ 瓶，2 8°C或一20°C存放備用；(2)配制乙肝表面抗體校準(zhǔn)品同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL ；(3)配制乙肝e抗原校準(zhǔn)品同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.lNCU/mL、ONCU/mL ；(4)配制乙肝e抗體校準(zhǔn)品同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL ；( 5 )配制乙肝c抗體校準(zhǔn)品同乙肝表面抗 原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL ；3)制備生物素標(biāo)記物( I)制備乙肝表面抗體生物素標(biāo)記物將Img乙肝表面抗體溶于0.lmol/L, pH8.8的硼酸鹽緩沖液0.5ml配成濃度為2mg/ml乙肝表面抗體溶液中，將生物素用二甲亞砜配制成濃度為lmg/ml生物素溶液，按照30 80μ g/mg的比率，將生物素加入到乙肝表面抗體溶液中，避光振蕩反應(yīng)4h，10°C，按照每250 μ g生物素加20 μ L的量，加入新鮮配制lmol/L的NH4C1溶液，避光震蕩反應(yīng)IOmin后，用PBS避光透析過夜，根據(jù)終體積計(jì)算抗體的濃度，加入甘油制備乙肝表面抗體生物素標(biāo)記物；(2)制備乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物、乙肝e抗體生物素標(biāo)記物和乙肝核心抗原生物素標(biāo)記物方法同步驟(I)乙肝表面抗體生物素標(biāo)記物的制備，所不同的是乙肝表面抗原的濃度為4mg/ml,乙肝e抗體的濃度為lmg/ml,乙肝核心抗原的濃度為0.5mg/ml ；4)制備堿性磷酸酶標(biāo)記物( I)制備乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物采用改良過碘酸鈉-乙二醇法進(jìn)行乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記，將獲得的乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS緩沖液按I: 1000稀釋成工作液，保存于一 20°C ;(2)制備乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標(biāo)記物和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物方法同步驟(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備；5)制備中和試劑將乙肝e抗原配制成lmg/ml濃度作為中和試劑乙肝e抗原；6)制備發(fā)光底物液取底物稀釋緩沖液450mL，增強(qiáng)劑(10 X) 50mL，lmol/L MgCl2500 μ L，加發(fā)光底物金剛烷胺衍生物csro8000 μ L于滅活容器中，振蕩混勻，避光，密封2 8°C保存，得發(fā)光底物液508.5mL ;所述底物稀釋緩沖液為0.05mol/L Tris-HCl，pH9.5 ；7)制備濃縮清洗液配制0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) lOOOmL，加20mL的吐溫-20作為濃縮清洗液；8)組裝乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒將包被微孔反應(yīng)板、生物素標(biāo)記物、堿性磷酸酶標(biāo)記物、中和試劑、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物液、濃縮清洗液組裝成乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒。本實(shí)用新型應(yīng)用生物素-鏈霉親和素檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)乙肝5項(xiàng)不同項(xiàng)目使用同樣的包被反應(yīng)板，根據(jù)待測(cè)樣品選擇相應(yīng)的抗原或抗體，抗原或抗體用生物素標(biāo)記，在檢測(cè)的過程中，只要將生物素標(biāo)記的抗原或抗體加入含有鏈霉親和素的微孔板中，就將相應(yīng)的抗原或抗體固相到了微孔板上，之后再加入待測(cè)樣品，就可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程。通過生物素標(biāo)記抗原或抗體的方法，使得針對(duì)不同樣品的檢測(cè)過程都可以使用同樣的含有鏈霉親和素的微孔板，而不需要分別制備含有不同抗原或抗體的預(yù)包被板。這樣不僅使得后期檢測(cè)過程變得簡(jiǎn)便易行，更加節(jié)省了預(yù)包被板過程中人力的花費(fèi)，更加經(jīng)濟(jì)，大大降低了成本，也縮短了檢測(cè)的時(shí)間。本實(shí)用新型特有的堿性磷酸酶-金剛烷胺發(fā)光系統(tǒng)，具有靈敏度高，線性范圍寬，檢測(cè)平臺(tái)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，無需進(jìn)行繁瑣的底物使用前的混合操作。且項(xiàng)目利用的手段比其它自動(dòng)化微孔檢測(cè)方式操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，檢測(cè)周期短、全自動(dòng)程度更高，降低了檢測(cè)成本與人力花費(fèi)，提高了檢測(cè)靈敏度，使得檢測(cè)過程更加人性化。項(xiàng)目開發(fā)的產(chǎn)品市場(chǎng)前景廣闊，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)與傳統(tǒng)方法比較，本實(shí)用新型簡(jiǎn)化了操作步驟，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間；效益顯著，意義重大。
通過本實(shí)用新型的應(yīng)用，得到的鏈霉親和素包被板不僅可以用于多種樣品的檢測(cè)，一定程度上減少了預(yù)包被板制備過程中抗原或抗體的使用量，而且得到的乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒可以取代國(guó)外試劑盒來進(jìn)行乙肝5項(xiàng)的檢測(cè)。與國(guó)外試劑盒相比，本實(shí)用新型不僅價(jià)格低廉，而且操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可以長(zhǎng)期大量的使用，在經(jīng)濟(jì)上減少開支。且本實(shí)用新型不僅可以靈敏檢測(cè)出乙肝5項(xiàng)，并且可以對(duì)其進(jìn)行精確的定量鑒定，價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，環(huán)保無污染，具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的好處。
圖1為本實(shí)用新型實(shí)施例組裝示意圖。I為鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板；2 6為生物素標(biāo)記物，其中2為乙肝表面抗體生物素標(biāo)記物、3為乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物、4為乙肝e抗體I生物素標(biāo)記物、5為乙肝e抗體2生物素標(biāo)記物、6為乙肝核心抗原生物素標(biāo)記物；7 11為堿性磷酸酶標(biāo)記物，其中7為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、8為乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物、9為乙肝e抗體I堿性磷酸酶標(biāo)記物、10為乙肝e抗體2堿性磷酸酶標(biāo)記物、11為乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物；12為中和試劑乙肝e抗原、13為試劑外包裝盒；14 19 為乙肝表面抗原 200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL 和0ng/mL6個(gè)濃度的校準(zhǔn)品，20 25為乙肝表面抗體1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL 和 0mIU/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品，26 31 為乙肝 e 抗原 40NCU/mL、IONCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL 和 0NCU/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品；32 37 為乙肝 e 抗體0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL 和 0NCU/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品；38 43為乙肝 c 抗體 4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL 和 0NCU/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品；44為濃縮清洗液；45為發(fā)光底物液。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步的說明。參見圖1，本實(shí)用新型實(shí)施例由鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板I ;乙肝表面抗體生物素標(biāo)記物2、乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物3、乙肝e抗體I生物素標(biāo)記物4、乙肝e抗體2生物素標(biāo)記物5、乙肝核心抗原生物素標(biāo)記物6 ；乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物7、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物8、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標(biāo)記物9、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標(biāo)記物10、乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物11 ;中和試劑乙肝e抗原12、試劑外包裝盒13 ;乙肝表面抗原 200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL 和 0ng/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品 14 19，乙肝表面抗體 1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL 和 0mIU/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品 20 25，乙肝 e 抗原 40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL 和0NCU/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品 26 31 ;乙肝 e 抗體 0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL 和 0NCU/mL6 個(gè)濃度的校準(zhǔn)品 32 37 ;乙肝 c 抗體 4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL和0NCU/mL6個(gè)濃度的校準(zhǔn)品38 43 ;濃縮清洗液44 ;發(fā)光底物液45共同組成。其中所述發(fā)光底物液為金剛烷胺衍生物csro。
本實(shí)用新型的制備方法，包括以下步驟:1.鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板制備鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板制備鏈霉親和素用包被緩沖液稀釋。取反應(yīng)板,將稀釋的鏈霉親和素加入相應(yīng)反應(yīng)板中，每反應(yīng)板150 μ L。置37°C恒溫放置2h進(jìn)行預(yù)包被。甩去包被液，在干凈的吸水紙上拍干，每反應(yīng)板再加入150 μ L封板緩沖液，置37°C恒溫放置2h。去掉封板液，于37°C干燥室烘干2h，加干燥劑密封。所述包被緩沖液為pH9.6、50mmol/L的Na2C03_NaHC03緩沖溶液，所述鏈霉親和素稀釋濃度為8 μ g/mL。所述封板緩沖液為0.01mol/L TBS-T+(1%BSA、0.2%明膠)。所述干燥室的相對(duì)濕度度小于30%。2.校準(zhǔn)品系列的制備(I)乙肝表面抗原校準(zhǔn)品的配制將高值乙肝表面抗原用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)重復(fù)標(biāo)定3次。3次標(biāo)定值，取均值作為標(biāo)定的表面抗原乙肝表面抗原濃度。所述校準(zhǔn)品稀釋液由0.05mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.01mmol/L的氯化鈉的1%牛血清白蛋白與10%的新生牛血清組成，pH值7.4。乙肝表面抗原作標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分裝成0.5mL/瓶，2 8°C (12個(gè)月)或一20°C (4年)存放備用。(2)乙肝表面抗體校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL。[0062](3)乙肝e抗原校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.lNCU/mL、ONCU/mL。(4)乙肝e抗體校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL。(5)乙肝核心抗體校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、ONCU/mL。3.生物素標(biāo)記物的制備(I)乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物的制備將Img乙肝表面抗原溶于0.lmol/L, pH8.8的硼酸鹽緩沖液0.5ml配成濃度為2mg/ml乙肝表面抗原溶液中，將生物素用二甲亞砜配制成濃度為lmg/ml生物素溶液，按照30 80 μ g/mg的比率，將生物素加入到乙肝表面抗原溶液中，避光振蕩反應(yīng)4h，IO0C，按照每250 μ g生物素加20 μ L的量，加入新鮮配制lmol/L的NH4C1溶液，常溫避光震蕩反應(yīng)IOmin0 IOmin后，用PBS避光透析過夜。根據(jù)終體積計(jì)算抗體的濃度,加入甘油制備乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物。(2)乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物、乙肝e抗體生物素標(biāo)記物、乙肝核心抗原生物素標(biāo)記物的制備方 法同步驟(I)乙肝表面抗體生物素標(biāo)記物的制備。所不同的是乙肝表面抗原的濃度為4mg/ml,乙肝e抗體的濃度為lmg/ml,,乙肝核心抗原的濃度為0.5mg/ml。4.堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備( I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備采用改良過碘酸鈉-乙二醇法進(jìn)行乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記，將獲得的乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS緩沖液按I: 1000稀釋成工作液，保存于一 20°C。(2)乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備方法同步驟(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備。5.制備中和試劑將乙肝e抗原配制成lmg/ml濃度作為中和試劑乙肝e抗原。6.制備發(fā)光底物液取底物稀釋緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl (ρΗ9.5) ) 450mL，增強(qiáng)劑(10X)50mL,lmol/L MgCl2 500 μ L，加發(fā)光底物金剛烷胺衍生物CSro8000 μ L于滅活容器中，振蕩混勻，避光，密封2 8°C保存。得底物工作液508.5mL。7.制備濃縮清洗液配制0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) lOOOmL，加吐溫20mL作為濃縮清洗液。8.制備乙肝5項(xiàng)(或乙肝兩對(duì)半)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒包被微孔反應(yīng)板、生物素標(biāo)記物、堿性磷酸酶標(biāo)記物、中和試劑、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物液、濃縮清洗液共同組成乙肝5項(xiàng)(或乙肝兩對(duì)半)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒。[0084]以下給出采用乙肝5項(xiàng)(或乙肝兩對(duì)半)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者的臨床標(biāo)本中的乙肝表面抗原:1.標(biāo)本處理:血清:靜脈血5mL，置37°C水浴30min，3000g離心lOmin，上清為檢測(cè)
樣品備用。2.標(biāo)本檢測(cè):將樣品、生物素標(biāo)記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝表面抗體加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應(yīng)60min后，乙肝表面抗原分子與生物素標(biāo)記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記分別特異性結(jié)合，洗掉游離成分。加入發(fā)光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發(fā)出463nm的可見光。于第15min測(cè)定各樣品孔的發(fā)光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝表面抗原濃度呈正相相關(guān)。樣品結(jié)果根據(jù)其RLU值可進(jìn)行定量計(jì)算[0087]以下給出乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的性能檢定:1、精密度試驗(yàn):對(duì)同一樣本每天進(jìn)行I批次檢測(cè)，每批重復(fù)檢測(cè)2次，共進(jìn)行20天。收集20天的有效數(shù)據(jù)，進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)。2、分析靈敏度:以乙肝表面抗原100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.lng/mL4個(gè)濃度樣品每天重復(fù)8次檢測(cè)，連續(xù)做3次，95%檢出陽(yáng)性的最低濃度值為乙肝表面抗原分析靈敏度；乙肝表面抗體的分析靈敏度同乙肝表面抗原，所不同的其檢測(cè)的樣品濃度為500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL ;乙肝e抗原的分析靈敏度同乙肝表面抗原,所不同的其檢測(cè)的樣品濃度為10NCU/ mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL ;乙肝e抗體的分析靈敏度同乙肝表面抗原，所不同的其檢測(cè)的樣品濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL ；乙肝c抗體的分析靈敏度同乙肝表面抗原，所不同的其檢測(cè)的樣品濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL ；3、特異性:臨床常見肝炎患者標(biāo)本150例，其中丙肝患者標(biāo)本50例、戊肝患者標(biāo)本50例、甲肝患者標(biāo)本50例，評(píng)價(jià)方法的特異性。4、線性范圍:根據(jù)較準(zhǔn)曲線的線性，維持相關(guān)系數(shù)在0.97以上，判斷方法的線性范圍。5、試劑穩(wěn)定性:用兩個(gè)濃度水平臨床樣本，每個(gè)濃度水平樣本重復(fù)測(cè)定至少6次，計(jì)算平均值。新配制及穩(wěn)定期末工作液應(yīng)在同次運(yùn)行中測(cè)定，將儀器帶來的不精密度減到最小。測(cè)定新配制的試劑工作液和穩(wěn)定期末試劑工作液兩組平均值之間的一致性。以下給出具體實(shí)施例。實(shí)施例11.鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板制備鏈霉親和素用包被緩沖液稀釋。取反應(yīng)板,將稀釋的鏈霉親和素加入相應(yīng)反應(yīng)板中，每反應(yīng)板150 μ L。置37°C恒溫放置2h進(jìn)行預(yù)包被。甩去包被液，在干凈的吸水紙上拍干，每反應(yīng)板再加入150 μ L封板緩沖液，置37°C恒溫放置2h。去掉封板液，于37°C干燥室烘干2h，加干燥劑密封。所述包被緩沖液為pH9.6、50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，所述鏈霉親和素稀釋濃度為8 μ g/mL。所述封板緩沖液為0.0lmol/L TBS-T+(1%BSA、0.2%明膠)。所述干燥室的相對(duì)濕度度小于30%。2.校準(zhǔn)品系列的制備(I)乙肝表面抗原校準(zhǔn)品的配制[0099]將高值乙肝表面抗原用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)重復(fù)標(biāo)定3次。3次標(biāo)定值，取均值作為標(biāo)定的表面抗原乙肝表面抗原濃度。所述校準(zhǔn)品稀釋液由0.05mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.01mmol/L的氯化鈉的1%牛血清白蛋白和10%牛血清組成，pH值7.4。乙肝表面抗原作標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分裝成0.5mL/瓶，2 8°C (12個(gè)月)或一20°C (4年)存放備用。(2)乙肝表面抗體校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL。(3)乙肝e抗原校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為40NCU/mL、I ONCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、ONCU/mL。(4)乙肝e抗體校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為0.4NCU/mL、INCU/mL、
2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、ONCU/mL。(5)乙肝核心抗體校準(zhǔn)品的配制同乙肝表面抗原的配制，其中校準(zhǔn)品系列工作濃度為4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、ONCU/mL。3.生物素標(biāo) 記物的制備(I)乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物的制備將Img乙肝表面抗原溶于0.lmol/L, pH8.8的硼酸鹽緩沖液0.5ml配成濃度為2mg/ml乙肝表面抗原溶液中，將生物素用二甲亞砜配制成濃度為lmg/ml生物素溶液，按照30 80 μ g/mg的比率，將生物素加入到乙肝表面抗原溶液中，避光振蕩反應(yīng)4h，IO0C，按照每250 μ g生物素加20 μ L的量，加入新鮮配制lmol/L的NH4C1溶液，常溫避光震蕩反應(yīng)IOmin0 IOmin后，用PBS避光透析過夜。根據(jù)終體積計(jì)算抗體的濃度,加入甘油制備乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物。(2)乙肝表面抗原生物素標(biāo)記物、乙肝e抗體生物素標(biāo)記物、乙肝核心抗原生物素標(biāo)記物的制備方法同步驟(I)乙肝表面抗體生物素標(biāo)記物的制備。所不同的是乙肝表面抗原的濃度為4mg/ml,乙肝e抗體的濃度為lmg/ml,,乙肝核心抗原的濃度為0.5mg/ml。4.堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備采用改良過碘酸鈉-乙二醇法進(jìn)行乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記，將獲得的乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS緩沖液按I: 1000稀釋成工作液，保存于一 20°C。(2)乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體I堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體2堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備方法同步驟(I)乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備。5.中和試劑制備將乙肝e抗原配制成lmg/ml濃度作為中和試劑乙肝e抗。[0119]6.發(fā)光底物液制備取底物稀釋緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl (ρΗ9.5) ) 450mL，增強(qiáng)劑(10X)50mL,lmol/L MgCl2 500 μ L，加發(fā)光底物金剛烷胺衍生物CSro8000 μ L于滅活容器中。振蕩混勻，避光，密封2 8°C保存。得底物工作液508.5mL。7.濃縮清洗液制備配制0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)1000mL，加20mL吐溫-20作為濃縮清洗液。8.制備乙肝5項(xiàng)(或乙肝兩對(duì)半)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒包被微孔反應(yīng)板、生物素標(biāo)記物、堿性磷酸酶標(biāo)記物、中和試劑、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物液、濃縮清洗液共同組成乙肝5項(xiàng)(或乙肝兩對(duì)半)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒。9.標(biāo)本處理:血清:靜脈血5mL,置37°C水浴30min, 3000g離心IOmin,上清為檢測(cè)樣品備用。10.標(biāo)本檢測(cè):將樣品、生物素標(biāo)記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝表面抗體加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應(yīng)60min后，乙肝表面抗原分子與生物素標(biāo)記的乙肝表面抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記乙肝表面抗體分別特異性結(jié)合，洗掉游離成分。加入發(fā)光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發(fā)出463nm的可見光。于第15min測(cè)定各樣品孔的發(fā)光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝表面抗原濃度呈正相相關(guān)。樣品結(jié)果根據(jù)其RLU值可進(jìn)行定量計(jì)算。實(shí)施例2與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本中的乙肝表面抗體，將樣品、生物素標(biāo)記的乙肝表面抗原和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝表面抗原加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應(yīng)60min后，乙肝表面抗體分子與生物素標(biāo)記的乙肝表面抗原和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝表面抗原分別特異性結(jié)合，洗掉游離成分。加入發(fā)光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發(fā)出463nm的可見光。于第15min測(cè)定各樣品孔的發(fā)光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝表面抗體濃度呈正相相關(guān)。樣品結(jié)果根據(jù)其RLU值可進(jìn)行定量計(jì)算。實(shí)施例3與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本中的乙肝e抗原，將樣品、生物素標(biāo)記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體I加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應(yīng)60min后，乙肝e抗原分子與生物素標(biāo)記的乙肝e抗體I和堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體I分別特異性結(jié)合，洗掉游離成分。加入發(fā)光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發(fā)出463nm的可見光。于第15min測(cè)定各樣品孔的發(fā)光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝e抗原濃度呈正相相關(guān)。樣品結(jié)果根據(jù)其RLU值可進(jìn)行定量計(jì)算。實(shí)施例4與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本中的乙肝e抗體，將樣品、生物素標(biāo)記的乙肝e抗體2、堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體2和中和抗原乙肝e抗原加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應(yīng)60min后，生物素標(biāo)記的乙肝e抗體2與固相的親和素結(jié)合后與中和抗原乙肝e抗原結(jié)合，標(biāo)本中的乙肝e抗體分子與堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝e抗體2競(jìng)爭(zhēng)與結(jié)合了生物素標(biāo)記的乙肝e抗體2的中和抗原乙肝e抗原結(jié)合，洗掉游離成分。加入發(fā)光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發(fā)出463nm的可見光。于第15min測(cè)定各樣品孔的發(fā)光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝e抗體的濃度呈負(fù)相相關(guān)。樣品結(jié)果根據(jù)其RLU值可進(jìn)行定量計(jì)算。實(shí)施例5與實(shí)施例1相似，其區(qū)別在于待檢標(biāo)本中的乙肝核心抗體，將樣品、生物素標(biāo)記的乙肝核心抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝核心抗體和中和抗原乙肝核心抗原加到固相有鏈霉親和素的微孔板中，反應(yīng)60min后，生物素標(biāo)記的乙肝核心抗原與固相的親和素結(jié)合的乙肝核心抗原結(jié)合，標(biāo)本中的乙肝核心抗體分子與堿性磷酸酶標(biāo)記的乙肝核心抗體競(jìng)爭(zhēng)與結(jié)合了生物素標(biāo)記的乙肝核心抗體的中和抗原乙肝核心抗原結(jié)合，洗掉游離成分。加入發(fā)光底物工作液，堿性磷酸酶底物脫磷酸基，并發(fā)出463nm的可見光。于第15min測(cè)定各樣品孔的發(fā)光值RLU。樣品的RLU與其中的乙肝核心抗體的濃度呈負(fù)相相關(guān)。樣品結(jié)果根據(jù)其RLU值可進(jìn)行定量 計(jì)算。
權(quán)利要求1.一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括包被的微孔反應(yīng)板、生物素標(biāo)記物、堿性磷酸酶標(biāo)記物、中和試劑、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物液和濃縮清洗液。
2.如權(quán)利要求1所述一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述微孔反應(yīng)板為包被有鏈霉親和素的微孔板。
3.如權(quán)利要求1所述一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述生物素標(biāo)記物共有5種生物素標(biāo)記物，分別為生物素標(biāo)記的乙肝表面抗體、生物素標(biāo)記的乙肝表面體原、生物素標(biāo)記的乙肝e抗體1、生物素標(biāo)記的乙肝e抗體2和生物素標(biāo)記的乙肝核心抗原。
4.如權(quán)利要求1所述一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標(biāo)記物共有5種堿性磷酸酶標(biāo)記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物，乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物1，乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物。
5.如權(quán)利要求1所述一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標(biāo)記物共有5種堿性磷酸酶標(biāo)記物，分別為乙肝表面抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝表面抗原堿性磷酸酶標(biāo)記物、乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物1、乙肝e抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物2和乙肝核心抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物。
6.如權(quán)利要求1所述一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述中和試劑為中和試劑乙肝e抗原。
7.如權(quán)利要求1所述一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述校準(zhǔn)品包括乙肝病毒表面抗原校準(zhǔn)品、乙肝病毒表面抗體校準(zhǔn)品、乙肝病毒e抗原校準(zhǔn)品、乙肝病毒e抗體校準(zhǔn)品和乙肝病毒核心抗體校準(zhǔn)品共5種校準(zhǔn)品。
8.如權(quán)利要求1所述一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述發(fā)光底物液為金剛烷胺衍生物csro。`
專利摘要一種乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，涉及一種用于乙肝檢測(cè)的試劑盒。試劑盒，包括包被的微孔反應(yīng)板、生物素標(biāo)記物、堿性磷酸酶標(biāo)記物、中和試劑、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物液和濃縮清洗液。分別制備鏈霉親和素預(yù)包被反應(yīng)板、校準(zhǔn)品系列、生物素標(biāo)記物、堿性磷酸酶標(biāo)記物、中和試劑、發(fā)光底物液、濃縮清洗液，組裝乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒。制備的乙肝5項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒不僅可以靈敏檢測(cè)出乙肝5項(xiàng)，并且可以對(duì)其進(jìn)行精確的定量鑒定，價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，環(huán)保無污染，具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的好處。
文檔編號(hào)G01N33/532GK203133088SQ201320130190
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者陳巧欽, 嚴(yán)小莉, 蔡雅銓, 徐鏡波, 楊家麗, 張長(zhǎng)弓 申請(qǐng)人:廈門市波生生物技術(shù)有限公司