含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，是將體內(nèi)不含喹諾酮類藥物殘留的鰻魚經(jīng)5種藥物同時(shí)藥浴7h后捕撈，獲得含5種喹諾酮類殘留的陽性鰻魚，將陽性鰻魚冷凍處死，經(jīng)處理得到鰻魚糜均勻陽性材料，分裝、輻照滅菌后，經(jīng)均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、協(xié)同定值，得到含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品，其所含喹諾酮類殘留量范圍為5μg/kg~30μg/kg。本發(fā)明制備的多殘留鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品外在形態(tài)及內(nèi)在目標(biāo)物結(jié)合情形都與真實(shí)檢測(cè)樣品完全一致，避免了凍干粉和加料基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的缺陷，產(chǎn)品均勻穩(wěn)定，使用可靠，可在常溫下傳遞，適用于水產(chǎn)品中相關(guān)藥物殘留檢測(cè)分析的質(zhì)量控制。
【專利說明】含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，該標(biāo)準(zhǔn)樣品適用于水產(chǎn)品中相關(guān)藥物殘留量分析檢測(cè)的質(zhì)量控制。
【背景技術(shù)】
[0002]食品分析用標(biāo)準(zhǔn)樣品作為食品化學(xué)測(cè)定量值溯源的實(shí)物載體，直接影響到食品安全。動(dòng)物組織如肌肉、內(nèi)臟、血液、尿液等新鮮或需冷凍保存的樣品由于運(yùn)輸、保存及均勻過程較困難，通常將其真空干燥制得凍干粉。以凍干粉的方式制作標(biāo)準(zhǔn)樣品，在保存、運(yùn)輸、包裝和均勻性、穩(wěn)定性等方面有其相對(duì)優(yōu)越性，但由于凍干粉同實(shí)驗(yàn)室日常分析檢測(cè)的真實(shí)樣品形態(tài)不同，雖然可采用復(fù)水或其它手段使凍干粉盡可能與日常的分析基體類似，但使用凍干粉進(jìn)行方法驗(yàn)證與質(zhì)量控制時(shí)常遇到取樣量及提取、凈化方法等與日常分析樣品有所不同的問題。用加料(加標(biāo))法制備的基體標(biāo)準(zhǔn)樣品方法簡(jiǎn)便，但基體和目標(biāo)物的結(jié)合情形與真實(shí)檢測(cè)樣品不完全一致，可能導(dǎo)致提取行為與日常分析樣品有所不同。而常見鮮糜基體樣品因易腐敗變質(zhì)在傳遞過程中需采取低溫等保護(hù)措施。
[0003]喹諾酮類(quinolones, QNs)是一類人工合成的廣譜殺菌性抗菌藥物，因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其它抗菌藥物無交叉耐藥性等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類的多種感染性疾病的預(yù)防和治療。由于該類藥物在臨床上容易導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，因此歐盟、美國(guó)、日本等已將其列為動(dòng)物性食品中殘留檢測(cè)的重點(diǎn)監(jiān)控藥物。喹諾酮類藥物在美國(guó)屬水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的禁用藥；歐盟、日本等都已制定了多種喹諾酮類藥物在動(dòng)物組織中的最高殘留限量；我國(guó)也規(guī)定了環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹等7種QNs藥物在動(dòng)物肌肉組織中的最高殘留限量為10?500 μ g/kg。
[0004]自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品通常是指標(biāo)準(zhǔn)樣品的候選材料獲取于天然基體，不包括獲取于“在基體材料中加入已知量的化合物或元素”。本發(fā)明建立了一種含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，所獲得的含5種喹諾酮類殘留的自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻穩(wěn)定，可在常溫下傳遞，適用于水產(chǎn)品中相關(guān)藥物殘留檢測(cè)分析的質(zhì)量控制。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，制得的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星，其含量在5 μ g/kg?30 Ug/kg范圍內(nèi)不等。其形態(tài)及目標(biāo)物與基體結(jié)合的情形都與真實(shí)檢測(cè)樣品完全一致，產(chǎn)品均勻穩(wěn)定，使用可靠，可在常溫下傳遞，適用于水產(chǎn)品中相關(guān)藥物殘留檢測(cè)分析的質(zhì)量控制。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法包括以下步驟:
1)選取體內(nèi)不含喹諾酮類藥物的鰻魚；
2)配制含氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的藥浴液，將藥浴液均分至兩個(gè)長(zhǎng)寬均為0.67 mX0.47 m，藥浴液深0.20 m的小實(shí)驗(yàn)池中，此時(shí)實(shí)驗(yàn)池藥浴液中5種藥物的初始濃度分別為:氟甲喹0.0056 mg/L，噁喹酸0.0183 mg/L，氧氟沙星999 mg/L，諾氟沙星2902 mg/L，環(huán)丙沙星2405 mg/L。；
3)每個(gè)小實(shí)驗(yàn)池中入浴30尾所選取的鰻魚，4尾/kg，連續(xù)供氧，藥浴7h后捕撈以獲取陽性鰻魚；
4)將陽性鰻魚冷凍處死，宰殺，去內(nèi)臟、頭、尾，去骨，切段，再經(jīng)攪碎勻漿，拍擊均質(zhì)，擠壓過10目篩，制備得到鰻魚糜均勻陽性材料；
5)將均勻陽性材料分裝、輻照滅菌；
6)經(jīng)均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、協(xié)同定值，得到含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0007]所述制備方法制得的自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品中5種喹諾酮類的特性值不等，范圍為:
5μ g/kg ~30 μ g/kg。
[0008]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明所制得的自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品中同時(shí)含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星，其含量范圍在5 μ g/kg~30 μ g/kg。目標(biāo)物與基體結(jié)合的情形和外觀形態(tài)都與真實(shí)檢測(cè)樣品完全一致，產(chǎn)品均勻穩(wěn)定，使用可靠，可在常溫下傳遞，適用于水產(chǎn)品中相關(guān)藥物殘留檢測(cè)分析的質(zhì)量控制?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0009]圖1為鰻魚中5種喹諾酮類藥物殘留量隨藥后時(shí)間變化的趨勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0010]1材料與方法
1.1材料
鰻魚:福建省長(zhǎng)樂聚泉食品有限公司提供(約4尾/kg)，經(jīng)HPLC-MS/MS檢測(cè)，均未檢出含氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星(檢測(cè)限為0.10μ g/kg)，人工轉(zhuǎn)移至給藥池；
藥浴實(shí)驗(yàn)用藥為:氟甲喹:使用前實(shí)測(cè)含量58.4% ;噁喹酸:使用前實(shí)測(cè)含量70.7% ；鹽酸左旋氧氟沙星:使用前測(cè)定以氧氟沙星計(jì)含量70.5% ;煙酸諾氟沙星:使用前實(shí)測(cè)以諾氟沙星計(jì)含量24.4% ;乳酸環(huán)丙沙星:使用前實(shí)測(cè)以環(huán)丙沙星計(jì)含量62.2%。
[0011]包裝材料為:尼龍/聚丙烯(PA/CPP)耐蒸煮復(fù)合膜袋:120 mmXllO mm，膜厚0.06臟，為外包裝袋；4號(hào)聚乙烯(PE)膜自封袋:120 mmX85臟，膜厚0.04 mm，剪去自封口用作內(nèi)袋。
[0012]I.2 試劑
以下試劑中未標(biāo)明純度或級(jí)別的均為分析純。水:GB 6682規(guī)定的一級(jí)水；正己烷、乙腈、甲醇、甲酸:HPLC級(jí)；中性氧化鋁:100-200目；無水硫酸鈉:650°C灼燒4h，冷卻后儲(chǔ)于密封容器中備用；0.2%甲酸溶液:移取2 mL甲酸，加水混勻并定容至1 L ；2%甲酸乙腈:將乙腈、甲酸按2:98的體積比混合；乙腈-甲酸-水(10:0.1:90, v/v):將乙腈、甲酸、水按10:0.1:90的體積比混合；5 mmol/L乙酸銨-0.2%甲酸溶液:稱取0.35 g乙酸銨，溶于約700 mL水中，加入2.0 mL甲酸，以水定容至1 L ;磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，PH=7.0):稱取0.52 g磷酸二氫鉀和21.92 g磷酸氫二鉀，加水溶解并稀釋至500 mL，用10%的磷酸調(diào)pH值至7.0 ;標(biāo)準(zhǔn)品氟甲喹(98.3%)、噁喹酸(98.0%)、氧氟沙星(99.0%)、諾氟沙星(99.5%)、環(huán)丙沙星(95.0%)及其同位素內(nèi)標(biāo)噁喹酸_05(99.8%)、氧氟沙星_D5(99.0%)、諾氟沙星_D5 (99.0%)、環(huán)丙沙星_D8 (99.5%):Dr.Ehrenstorfer GmbH ;標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并稀釋，分別配制成100.0 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18°c保存；混合工作液:從冰箱中取出標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，恢復(fù)至室溫后取根據(jù)需要移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液并用乙腈稀釋，配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0013]1.3儀器設(shè)備
API5500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源):美國(guó)AB SIEX ；ANKE TDL-5離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠；渦旋混合器:上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；MilliQ純水系統(tǒng):Millipore公司；超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司；2094型攪拌型勻漿器:丹麥FOSS ；stomacher3500型拍擊均質(zhì)器:英國(guó)Seward ；SC-300A型真空包裝機(jī):安溪縣三和茶葉機(jī)械廠；KB720型培養(yǎng)箱:德國(guó)Binder ；Co60-y射線輻照裝置:福建省康普頓輻照技術(shù)有限公司；BC/BD-718A冰柜:青島海爾特種電冰柜有限公司；AC0_002型空氣泵:浙江森森實(shí)業(yè)有限公司；10目不銹鋼網(wǎng)篩。
[0014]1.4鰻魚中喹諾酮類殘留量測(cè)定采用HPLC-MS/MS測(cè)定。
[0015]1.4.1提取與凈化
稱取5.00 g樣品，加入lOOyL 100 ng/mL同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入3.0mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)，于渦旋振蕩器振蕩2min分散樣品；再加入15 mL的2%甲酸乙腈，于渦旋振蕩器振蕩提取1 min后常溫超聲提取10 min,加入3g無水硫酸納和2g中性氧化招于潤(rùn)旋振蕩器上振蕩5 min, 4500 r/min離心5 min,取上清液；下層殘余再用10 mL乙腈按上述振蕩、超聲、離心步驟操作后，取上清液；合并兩次提取的上清液混勻，分取10 mL混合上清液，40 °C氮吹至近干，加入2 mL乙腈-水-甲酸(體積比:10:90:0.1)溶液和3mL正己烷溶解殘?jiān)?，渦旋振蕩2 min, 3500 r/min離心5 min,過0.22 μ m濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上機(jī)測(cè)定分析。
[0016]1.4.2儀器參數(shù)及測(cè)定條件
a)液相色譜:ACQUITY UPLC BHE C18 柱(2.1 mm X 100 mm, 1.7 μ m);流動(dòng)相 A:5mmol/L乙酸銨-0.2%甲酸溶液；流動(dòng)相B:乙腈；梯度洗脫程序:0?2 min, 10% B，2?4min, 10% ?50% B，4 ?6 min, 50% ?90% B，6 ?10 min, 10 % B ;流速 0.4 mL/min ;柱溫 30
V;進(jìn)樣量2 μ L。
[0017]b)質(zhì)譜:電噴霧電離正離子模式(ESI+)，MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓(IS):5500
V;氣簾氣壓力(⑶R):0.241 MPa (氮?dú)?;離子源溫度(TEM):500 °C;霧化氣壓力0.379 MPa ；輔助氣壓力0.379 MPa ;其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。
[0018]表1 UPLC-MS/MS檢測(cè)條件參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于:選取體內(nèi)不含喹諾酮類藥物的鰻魚，置于含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的藥浴液中藥浴7 h后捕撈以獲取陽性鰻魚，將陽性鰻魚冷凍處死，宰殺，去內(nèi)臟、頭、尾，去骨，切段，再經(jīng)攪碎勻漿，拍擊均質(zhì)，擠壓過10目篩，得到鰻魚糜均勻陽性材料，將均勻陽性材料分裝、輻照滅菌后，經(jīng)均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、協(xié)同定值，得到含有氟甲喹、噁喹酸、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于:所述制備方法制得的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品中5種喹諾酮類的特性值范圍為:5 μ g/kg ?30 μ g/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于:藥浴液中5種喹諾酮類的初始濃度分別為氟甲喹0.0056 mg/L、噁喹酸0.0183 mg/L、氧氟沙星999 mg/L、諾氟沙星2902 mg/L和環(huán)丙沙星2405 mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于:在每個(gè)長(zhǎng)寬為0.67 mX0.47 m、藥液深0.20 m的藥浴實(shí)驗(yàn)池中入浴30尾活的成鰻，4尾/kg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含5種喹諾酮類殘留的鰻魚糜自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于:所述陽性鰻魚是將鰻魚藥浴7 h后直接捕撈、處死獲得的。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103675162SQ201310693779
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】余孔捷 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心