一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，包括以下步驟：（1）將T4與HRP分別溶于二甲基亞砜溶液和碳酸鹽緩沖液中，分別制備A溶液和B溶液，然后在A溶液中加入正三丁胺溶液，冰浴持續(xù)攪拌一定時間，得溶液C，溶液C再加入氯甲酸異丁酯溶液，室溫攪拌一定時間后，得溶液D，將B溶液加入溶液D進行偶聯(lián)反應，得到反應混合液E。（2）反應混合液E通過透析處理除去反應混合物中未參與偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。本發(fā)明的優(yōu)點是提供一種制備方法簡單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于甲狀腺素免疫學檢測的甲狀腺素標記辣根過氧化物酶。
【專利說明】一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的是一種T4-HRP的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲狀腺素即3，5，3’，5’-四碘甲狀腺原氨酸，簡稱T4 (Thyroxine，T4)，是由甲狀腺 濾泡上皮細胞合成和分泌的甲狀腺激素。甲狀腺素的基本結(jié)構(gòu)是由一個酪氨酸殘基和一個 酚環(huán)構(gòu)成。正常人平均每日的T4分泌量為(90±9)iig，約為甲狀腺內(nèi)貯存量的1%。T4進 入血液循環(huán)后約99.96%與結(jié)合蛋白結(jié)合，其中約60%與甲狀腺素結(jié)合球蛋白(TBG)結(jié)合， 30%與甲狀腺素結(jié)合前白蛋白(TBPA)結(jié)合，其余與白蛋白結(jié)合。
[0003]T4具有生物活性，促進糖，脂肪，蛋白質(zhì)代謝，產(chǎn)生能量和熱，促進生長發(fā)育。甲狀 腺機能亢進時，甲狀腺合成和分泌T4增多，血清T4增高。亞急性甲狀腺炎，慢性淋巴細胞 性甲狀腺炎的早期，因甲狀腺濾泡受破壞，T4溢出，使血中T4升高產(chǎn)生暫時性的輕度甲亢。 甲狀腺機能減退時，無論是原發(fā)，繼發(fā)或其它原因，T4均減低，甲狀腺缺乏或先天性發(fā)育不 良，及甲狀腺全切除后，血清T4降低。
[0004]臨床上血清T4的檢測主要采用免疫法，而且固相包被T4抗體是T4檢測試劑盒的 常用方式，這就需要對T4抗原進行標記以達到檢測血清T4的目的。而目前市場上的T4標 記抗原多要先偶聯(lián)一個載體蛋白才能有效進行標記，此種方法在空間上對針對T4的抗原 抗體反應必然會產(chǎn)生較大影響，從而導致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種制備方法簡單、生產(chǎn)周期短，生 產(chǎn)成本低的用于T4免疫學檢測的T4-HRP。
[0006]技術(shù)方案包括下述步驟:
[0007]一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將T4與HRP分別溶于二甲基亞砜溶液和碳酸鹽緩沖液中，分別制備A溶液和 B溶液，然后在A溶液中加入正三丁胺溶液，冰浴持續(xù)攪拌一定時間，得溶液C，溶液C再加 入氯甲酸異丁酯溶液，室溫攪拌一定時間后，得溶液D，將B溶液加入溶液D進行偶聯(lián)反應， 得到反應混合液E。
[0009](2)反應混合液E通過透析處理除去反應混合物中未參與偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩 沖液采用PH7.4的0.0lM磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物，未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)包括T4及DMS0、正
三丁胺、氯甲酸異丁酯等。
[0010]進一步，步驟(I)中制備的A溶液和B溶液的濃度分別為lmg/ml和5mg/ml。
[0011]進一步，所述溶液C中T4與HRP摩爾比5-10:1。
[0012]進一步，步驟(I)中正三丁胺加入T4溶液需冰浴。
[0013]進一步，氯甲酸異丁酯加入量大于T4的物質(zhì)的量。
[0014]進一步,步驟(I)中B溶液緩慢滴加到溶液D中,邊滴邊震蕩,滴加完成后4°C持續(xù)震蕩，反應20小時以上,得到反應混合液E。
[0015]偶聯(lián)完成的檢測采用如下方法:
[0016]按照上述步驟(I)和步驟(2)的方法，反應體系缺失T4，維持其他各反應條件不 變，制備實驗對照組樣品。
[0017]采用紫外分光光度計對T4、T4-HRP、實驗對照在200_400nm之間進行掃描，在同坐 標下進行圖形比對，在T4-HRP、實驗對照和T4對照濃度相同的情況下，如果T4-HRP的特征 峰與T4特征峰及實驗對照組特征峰相比多出特征吸收峰，說明偶聯(lián)成功。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點是提供一種制備方法簡單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于去甲腎 上腺素抗體制備和免疫學檢測的完全抗原，直接應用于免疫檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0019]圖1是偶聯(lián)物通過分光光度計掃描鑒定圖 【具體實施方式】:
[0020]實施例1:T4標記HRP
[0021](1)T4 (甲狀腺素)5mg溶于ImlDMSO中得A溶液，HRP5mg溶于lmlpH9.6碳酸鹽 緩沖液中得B溶液；
[0022](2)將體積為5ul的正三丁胺滴入A溶液中，冰浴震蕩反應20分鐘，得溶液C。
[0023](3)將體積為5ul的氯甲酸異丁酯滴入溶液C中，室溫震蕩反應30分鐘，得溶液 D0
[0024](4)將溶液D緩慢滴入B溶液中，4°C震蕩反應24小時以上，得反應混合物E。
[0025](5)反應混合物E通過透析處理除去反應混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液 采用PH7.4的0.0lM磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物F。
[0026](6)按照步驟(I) (2) (3) (4) (5)的方法，反應體系缺失T4，維持其他各反應條 件不變，制備實驗對照樣品。
[0027](7)采用紫外分光光度計對載體、小分子、偶聯(lián)物在200-500nm之間進行掃描，在 同坐標下進行圖形比對，在偶聯(lián)物和載體對照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與 載體特征峰及實驗對照組特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說明偶聯(lián)成功。
【權(quán)利要求】
1.一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)將T4溶于二甲基亞砜溶液制備A溶液，HRP溶于碳酸鹽緩沖液中制備B溶液，然后 在A溶液中加入正三丁胺溶液，冰浴持續(xù)攪拌一定時間，得溶液C，溶液C再加入氯甲酸異丁 酯溶液，室溫攪拌一定時間后，得溶液D，將B溶液加入溶液D進行偶聯(lián)反應，得到反應混合 液E ；(2)反應混合液E通過透析處理除去反應混合物中未參與偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液 采用pH7.4的0.0lM磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，其特征在于， 步驟(I)中制備的A溶液和B溶液的濃度分別為lmg/ml和5mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，其特征在于， 所述溶液C中T4與HRP摩爾比5-10:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，其特征在于， 步驟(I)中正三丁胺加入T4溶液需冰浴。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，其特征在于， 氯甲酸異丁酯加入量大于T4的物質(zhì)的量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，其特征在于， 步驟(I)中HRP溶液緩慢滴加到溶液D中，邊滴邊震蕩，滴加完成后4°C持續(xù)震蕩，反應20 小時以上，得到反應混合液E。
【文檔編號】G01N33/531GK103575876SQ201310606411
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】張振斌, 辛志勇, 汪艷培, 李克錦, 劉萍, 欒大偉 申請人:博奧賽斯（天津）生物科技有限公司