一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器，該納米傳感器既具有對溶氧量敏感的熒光壽命，又能特異性靶向細(xì)胞內(nèi)的線粒體。細(xì)胞吞噬氧氣納米傳感器后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及線粒體內(nèi)的溶氧量的變化均可通過納米傳感器的熒光壽命的變化進行檢測。本發(fā)明具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器擁有如下特性：（一）PLL殼層使得傳感器擁有很好的生物體相容性，同時封裝也使得探針對外部的干擾具有抗性；（二）線粒體靶向性良好；（三）熒光壽命的氧氣靈敏度高；（四）可實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)不同位置的溶氧量的檢測。
【專利說明】一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物溶氧量熒光檢測的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，在維持生理功能的穩(wěn)態(tài)方面起重要作用。線粒體功能的失調(diào)和一系列的病理疾病直接有關(guān)，如肥胖癥、糖尿病、腫瘤、和心血管疾病等，因此，對細(xì)胞線粒體功能的檢測具有十分重要的意義。眾所周知，線粒體是細(xì)胞內(nèi)有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場所，細(xì)胞內(nèi)大部分的氧被線粒體利用。如能對線粒體內(nèi)的溶氧量水平進行實時監(jiān)測，則可以間接反映出線粒體的活性以及其代謝功能。
[0003]近年來利用氧氣探針分子摻雜的熒光納米傳感器來檢測細(xì)胞內(nèi)溶氧量已為科研人員認(rèn)可。熒光氧氣探針一般采用過渡金屬配合物，其金屬配體電荷轉(zhuǎn)移的熒光性質(zhì)對氧含量非常敏感。一般而言，隨著氧含量水平的升高，其熒光強度和壽命均降低。將氧氣探針分子包覆于對氧氣具有通透性的納米粒子內(nèi)制備成納米傳感器，并通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進入細(xì)胞質(zhì)中，則可以實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)溶氧量的檢測。但目前特異性對線粒體內(nèi)溶氧量的熒光檢測仍是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。要使納米載體靶向線粒體，需要在納米載體上修飾能特異識別并且進入線粒體的功能結(jié)構(gòu)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器，該納米傳感器既具有對溶氧量敏感的熒光壽命，又能特異性靶向細(xì)胞內(nèi)的線粒體。細(xì)胞吞噬氧氣納米傳感器后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及線粒體內(nèi)的溶氧量的變化均可通過納米傳感器的熒光壽命的變化進行檢測。
[0005]為解決第一個技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0006]一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器，所述熒光氧氣納米傳感器為具有線粒體靶向性的核殼結(jié)構(gòu)的熒光氧氣納米顆粒；所述熒光氧氣納米顆粒是以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅為核(DTS-PS)，以多聚賴氨酸(PLL)為殼的核殼結(jié)構(gòu)，其中，鉬(II )MES0-四(五氟苯)卟吩(PtTFPP)分子分散于核層中作為氧氣探針，殼層表面偶聯(lián)三苯基膦(TPP)。
[0007]優(yōu)選地,所述突光納米氧氣傳感顆粒粒徑為100_150nm。
[0008]本發(fā)明還提供一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器的制備方法，包括以下制備步驟:
[0009]I)將鉬(II ) MESO-四(五氟苯)卟吩分子PtTFPP，聚苯乙烯PS和十二烷基三甲氧基硅烷DTS按照1-3%:47-49%: 50%的質(zhì)量比溶解于四氫呋喃；
[0010]2)將上述溶液在超聲震蕩條件下注入到pH值為9的含有0.01-0.02mg/ml的多聚賴氨酸PLL的去離子水中，得到懸浮液；
[0011]3)將上述懸浮液靜置2小時后，將其在二次蒸餾水中透析24小時，然后加入相當(dāng)于多聚賴氨酸PLL摩爾濃度30倍的三苯基膦TPP及1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽EDC，震蕩兩小時，再透析24小時即得具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
[0013]本發(fā)明中PtTFPP的應(yīng)用是基于它具有較長的發(fā)光壽命、大的stokes位移和易于被氧氣猝滅等特點。當(dāng)受光激發(fā)后，電子從單線態(tài)基態(tài)躍遷到單線態(tài)MLCT激發(fā)態(tài)，并以非輻射的形式躍遷到三線態(tài)MLCT激發(fā)態(tài)，電子再回到基態(tài)時就會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。氧分子與處于激發(fā)態(tài)的發(fā)光分子通過碰撞發(fā)生能量傳遞，進而使發(fā)光分子的發(fā)光猝滅，氧分子變?yōu)閱尉€態(tài)氧。PLL的應(yīng)用提高了熒光氧氣納米傳感器的生物兼容性，并為進一步偶聯(lián)線粒體靶向序列TPP提供靶點一伯胺基團。通過偶聯(lián)TPP，使熒光氧氣納米顆粒成功靶向細(xì)胞內(nèi)線粒體。納米粒子中，PS和DTS分別作為基質(zhì)和封裝劑。在超聲注入過程中，由于水相對于四氫呋喃的比例的突然增加，疏水性化合物聚合以形成顆粒。同時，DTS水解和縮聚導(dǎo)致二氧化硅基顆粒的封裝。隨后，由于PLL的氨基和硅烷醇基團之間的靜電引力，PLL分子吸附到顆粒表面上，而形成核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子。氧氣探針PtTFPP隨機分布在疏水性的DTS-PS核心部位，被帶負(fù)電荷的二氧化硅層封裝，表面進一步吸附PLL分子，從而使聚合物雜化納米粒子表面修飾伯胺基團，然后基于胺基偶聯(lián)化學(xué)連接親脂性陽離子物質(zhì)(TPP)，依賴線粒體膜高電位能的推動，將與之結(jié)合的納米載體轉(zhuǎn)運至線粒體基質(zhì)。氧氣探針的熒光壽命有較強的氧氣敏感性，PLL對納米顆粒包覆使其具有較好的生物相容性，偶聯(lián)TPP使納米粒子具有線粒體靶向性。上述特性使得這種核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒在生物氧氣傳感方面具有極大的應(yīng)用價值。
[0014]本發(fā)明具有線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器擁有如下特性:(一)PLL殼層使得傳感器擁有很好的生物體相容性，同時封裝也使得探針對外部的干擾具有抗性；(二)線粒體靶向性良好；(三)熒光壽命的氧氣靈敏度高；(四)可實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)不同位置的溶氧量的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細(xì)的說明
[0016]圖1為具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米顆粒的截面示意圖。
[0017]圖2為具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米顆粒的掃描電鏡照片。
[0018]圖3為熒光氧氣納米傳感器壽命與溶氧量的關(guān)系的標(biāo)定曲線示意圖。
[0019]圖4為MTT比色法檢測熒光納米氧氣傳感顆對HepG2細(xì)胞的毒性的示意圖。
[0020]圖5為對比分析偶聯(lián)TPP納米顆粒、未偶聯(lián)TPP納米顆粒及未包覆PLL的納米顆粒對細(xì)胞新陳代謝刺激的反應(yīng)示意圖。曲線指線粒體靶向納米傳感器的發(fā)光壽命變化趨勢，一紅色對應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧氣納米傳感器的發(fā)光壽命變化趨勢,—對應(yīng)細(xì)胞外氧氣納米傳感器的發(fā)光壽命變化趨勢。
【具體實施方式】[0021]為更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的方案，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)包括權(quán)利要求的全部內(nèi)容，但不限于此。
[0022]實施例1
[0023](I)將PtTFPP，PS和DTS按照2:48:50的質(zhì)量比溶解于四氫呋喃中，并且使它們在溶液中的總濃度為0.2 %。然后，使用微量調(diào)節(jié)注射器，取上述溶液500 μ L，在超聲震蕩條件下迅速注入到pH值為9 (用氨水調(diào)整pH值)的去離子水中，由此產(chǎn)生的懸浮液經(jīng)超聲震蕩2小時后，隨后在二次水中透析24小時，即得到用于細(xì)胞外部氧含量測量的納米顆粒。
[0024](2)同等濃度PtTFPP，PS和DTS的混合溶液在超聲震蕩條件下迅速注入到pH值為9的PLL濃度為0.02mg/ml的去離子水中，由此產(chǎn)生的懸浮液經(jīng)超聲震蕩2小時后，隨后在二次水中透析24小時(除去有機溶劑和多余的PLL)，即得到PLL包覆的核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒，用于檢測細(xì)胞內(nèi)的氧含量。
[0025](3)在上述包覆PLL的納米顆粒中，加入相當(dāng)于PLL摩爾濃度30倍的TPP和EDC溶液后，震蕩兩小時，實現(xiàn)TPP與納米顆粒的偶聯(lián)，即得到線粒體靶向的納米粒子，用于檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體的氧含量。
[0026]細(xì)胞的吞噬效率的探究
[0027]用線粒體示蹤劑(Mitotracker)對吞曬了偶聯(lián)TPP的納米粒子的腫瘤細(xì)胞的線粒體進行染色，HepG2細(xì)胞無血清培養(yǎng)至匯合率大約50%時，加入熒光納米顆粒，使其濃度達(dá)到10mg/ml，與細(xì)胞孵育24小時，隨后使用PBS沖洗3遍，通過共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的納米顆粒吞噬效率。利用共聚焦熒光顯微鏡對示蹤劑和納米顆粒雙通道成像。通過二者成像位置的復(fù)合證實本發(fā)明中的氧氣納米傳感器對細(xì)胞內(nèi)的線粒體具有靶向性。
[0028]細(xì)胞內(nèi)氧氣探針壽命與溶氧量的關(guān)系
[0029]細(xì)胞內(nèi)突光氧氣納米顆粒的壽命的表征，是通過Victor4(Perkin_Elmer LifeSciences)多標(biāo)記分析儀的時間分辨突光檢測功能計算得到。340nm光激發(fā)，642nm處檢測熒光強度，間隔一定時間周期性測量每個微孔，延遲時間分別為30us和70us，gate time為lOOuso標(biāo)定細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)、線粒體內(nèi)探針壽命與溶氧量的校準(zhǔn)曲線的方法是,將細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，分別加入三種熒光探針，共培養(yǎng)24小時后，替換無酚紅培養(yǎng)基，使用PBS沖洗三遍，加入4uM的Rotenone抑制細(xì)胞呼吸，隨后分別通入0，0.86，1.72，2.58，4.3和8.6ppm的氧氣，測試其壽命變化，進而標(biāo)定壽命與氧氣含量的關(guān)系。
[0030]本發(fā)明中的核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒的衰減時間對氧氣極為敏感。圖3給出了氧氣敏感納米顆粒的發(fā)光壽命隨氧氣濃度的變化曲線，可以觀察到，壽命隨著氧氣濃度的上升而迅速縮短，氧氣濃度的變化趨勢可以通過單指數(shù)函數(shù)進行擬合。
[0031]毒性檢測
[0032]熒光氧氣納米傳感器對細(xì)胞毒性的測試是通過MTT比色法進行的，首先，以每孔5000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積0.2mL,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。然后更換培養(yǎng)基，加入不同濃度梯度的熒光氧氣傳感納米顆粒。培養(yǎng)24小時后，每孔加0.02mL的MTT溶液(5mg/mL，使用PBS配致)。在培養(yǎng)箱中孵育4小時后，終止培養(yǎng)，清除孔內(nèi)的廢液。在孔板的每孔中加入0.15mL的DMS0，遮光振蕩約10分鐘，使結(jié)晶物得到充分的溶解。然后利用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其在波長為490nm的光吸收值，從而可以間接反映細(xì)胞的成活數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。[0033]細(xì)胞新陳代謝功能分析
[0034]細(xì)胞新陳代謝功能分析是通過熒光氧氣納米傳感顆粒的壽命變化來表征的，通過氧氣傳感器探針壽命標(biāo)定細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)氧含量與細(xì)胞新陳代謝的關(guān)系。加入線粒體解耦聯(lián)劑FCCP，使線粒體膜通透性增加，減少細(xì)胞內(nèi)ATP的生成，增加產(chǎn)熱，促進細(xì)胞呼吸，降低細(xì)胞內(nèi)氧含量。基于熒光氧氣納米傳感器對線粒體內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外溶氧量進行熒光壽命檢測，氧氣納米傳感器的熒光壽命即溶氧量水平與細(xì)胞新陳代謝的關(guān)系見圖
5?；诰€粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器，通過時間分辨熒光檢測，探究線粒體內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外氧含量對細(xì)胞新陳代謝變化的反應(yīng)，在96孔板中，培養(yǎng)濃度為3*104的H印g2細(xì)胞，與探針共培養(yǎng)24小時后，加入FCCP，使用礦物油密封，觀察納米粒子壽命隨時間的變化情況。加入FCCP后，細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)，及線粒體內(nèi)探針壽命都逐漸增加，因為加入FCCP后，線粒體呼吸作用得到促進，使氧氣濃度降低，壽命變長。但是相比較而言，細(xì)胞外氧氣含量變化較少，線粒體內(nèi)變化率最明顯，因為FCCP首先作用于線粒體，線粒體呼吸加強，使線粒體附近氧氣含量迅速減少，進而使細(xì)胞內(nèi)氧含量減少，最終使細(xì)胞外培養(yǎng)基中的氧氣逐漸被消耗。
[0035]實施例2
[0036]重復(fù)實施例1，其不同之處僅在于鉬(II )MES0_四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷質(zhì)量比為按照1:49:50，多聚賴氨酸的去離子水濃度為0.0lmg/ml ο
[0037]實施例3
[0038]重復(fù)實施例1，其不同之處僅在于鉬(II )MES0_四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷質(zhì)量比為按照3:47:50。
[0039]實施例4
[0040]重復(fù)實施例1，其不同之處僅在于步驟3)是將懸浮液靜置I小時后，將其在二次蒸餾水中透析20小時，然后加入相當(dāng)于多聚賴氨酸PLL摩爾濃度20倍的三苯基膦及1- (3- 二甲氨基丙基)-3_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽，震蕩I小時，再透析40小時得到具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器。
[0041]實施例5
[0042]重復(fù)實施例1，其不同之處僅在于步驟3)是將懸浮液靜置3小時后，將其在二次蒸餾水中透析40小時，然后加入相當(dāng)于多聚賴氨酸PLL摩爾濃度40倍的三苯基膦及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽，震蕩2小時，再透析20小時得到具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器。
[0043]顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【權(quán)利要求】
1.一種具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器，其特征在于，所述熒光氧氣納米傳感器為具有線粒體靶向性的核殼結(jié)構(gòu)的熒光氧氣納米顆粒；所述熒光氧氣納米顆粒是以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅為核，以多聚賴氨酸為殼的核殼結(jié)構(gòu)，其中，鉬(II )MESO-四(五氟苯)卟吩分子分散于核層中作為氧氣探針，殼層表面吸附三苯基勝基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器，其特征在于:所述突光納米氧氣傳感顆粒粒徑為100-150nm。
3.如權(quán)利要求1-2所述的具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下制備步驟: 1)將鉬(II)MESO-四(五氟苯)卟吩分子，聚苯乙烯和十二烷基三甲氧基硅烷按照1-3:47-49:50的質(zhì)量比溶解于四氫呋喃； 2)將上述溶液在超聲震蕩條件下注入到pH值為9的含有濃度為0.01-0.02mg/ml的多聚賴氨酸的去離子水中，得到懸浮液； 3)將上述懸浮液靜置1-3小時后，將其在二次蒸餾水中透析20-40小時，然后加入相當(dāng)于多聚賴氨酸PLL摩爾濃度20-40倍的三苯基膦及1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽，震蕩1-2小時，再透析20-40小時即得具有細(xì)胞線粒體靶向性的熒光氧氣納米傳感器。
【文檔編號】G01N21/64GK103575717SQ201310571954
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】彭洪尚, 王小卉 申請人:北京交通大學(xué)