一種脂蛋白(a)檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，由試劑1、試劑2和工作校準(zhǔn)液組成。試劑1由緩沖液、BSA、表面活性劑、羊IgG和NaN3組成，試劑2由緩沖液、脂蛋白(a)單抗膠乳微球、BSA、表面活性劑、羊IgG、穩(wěn)定劑和NaN3組成?？蓱?yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀上，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性強(qiáng)，與不同人群不同大小的脂蛋白(a)絕對(duì)濃度有良好的可比性；與纖溶酶原沒有交叉反應(yīng)、不受類風(fēng)濕因子干擾、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣，而且僅需要脂蛋白(a)的一株單抗，節(jié)省了試劑盒制備的成本和時(shí)間。
【專利說明】一種脂蛋白(a)檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種脂蛋白(a)檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]脂蛋白(a)是一種與LDL(低密度脂蛋白)結(jié)構(gòu)相近的人體血清中的蛋白，密度介于HDL(高密度脂蛋白)與LDL之間。脂蛋白(a)核心部分為中性脂質(zhì)和apoB-100分子，其外圍包繞著親水性的apo (a)，二者以二硫鍵共價(jià)連接；其中apo(a)是高度糖化的親水性蛋白質(zhì)，肽鏈長度很不一致，分子大小呈明顯多態(tài)性。對(duì)apo (a) cDNA的分析發(fā)現(xiàn)，apo (a)屬于纖溶酶原基因超家族，與纖溶酶原有高度同源性。與纖溶酶原類似，apo (a)含有一個(gè)羧基端蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域,盡管apo (a)的蛋白酶結(jié)構(gòu)域與纖溶酶原85%同源，卻沒有催化活性，所以脂蛋白(a)可以競爭性干擾纖溶酶原的生理功能。纖溶酶原分子中有5種Kringle (分別命名為Kl、K2、K3、K4、K5，各一個(gè))，apo (a)中只有一個(gè)K5 (與纖溶酶原的K5同源85%)和若干個(gè)K4 (與纖溶酶原K4同源78%-88%)，所以apo (a)的多克隆抗體難免與纖溶酶原有交叉反應(yīng)。
[0003]由于apo(a)大小不均一'丨生,脂蛋白(a)含十幾個(gè)至50多個(gè)的K4,使apo (a)占脂蛋白(a)分子的百分比從27%到51%不等。目前臨床實(shí)驗(yàn)室常用的免疫比濁法所用的單抗或多抗主要作用于K4，導(dǎo)致對(duì)不同大小脂蛋白(a)的檢測產(chǎn)生較大的偏差。
[0004]大量的流行病學(xué)和臨床研究表明，脂蛋白(a)在不同人群的血液中差異很大，不同個(gè)體間脂蛋白(a)的水平可相差100倍。但在同一個(gè)體血清中濃度相對(duì)穩(wěn)定，除遺傳因素外，幾乎不受年齡、性別、吸煙、飲食、脂代謝、藥物、環(huán)境等因素的影響。因此脂蛋白(a)是一種比較穩(wěn)定的生物標(biāo)記物。血清中高濃度的Lpa是動(dòng)脈硬化和心臟疾病危險(xiǎn)程度的指標(biāo)。血衆(zhòng)脂蛋白(a)升聞與多種心血管疾病,包括外周血管病、腦血管病、早發(fā)冠心病和糖尿病血管并發(fā)癥等有關(guān)。脂蛋白(a)濃度超過30mg/dL時(shí)，通?；夹呐K疾病的危險(xiǎn)性比正常人高2倍。
[0005]目前，脂蛋白(a)的檢測方法有:放射免疫法、ELISA法、免疫比濁法和脂蛋白(a)_膽固醇法等，其中放射免疫法因其存在放射性污染而已漸被市場淘汰；酶聯(lián)免疫法自動(dòng)化程度不高，且受人為因素影響較大；脂蛋白(a)_膽固醇法是近年來興起的一種方法，優(yōu)點(diǎn)在于可避免免疫測定法中因apo (a)多態(tài)性給Lp (a)測定帶來的難題，缺點(diǎn)是方法操作復(fù)雜，需要用超速離心或其它方法從血漿中分離出脂蛋白(a)，然后再用膽固醇酶法檢測脂蛋白(a)，因此難以得到廣泛應(yīng)用；免疫比濁法與其它方法相比，優(yōu)點(diǎn)是簡便快速、靈敏可靠，不需要從血漿中分離出脂蛋白(a)，可直接用于自動(dòng)或半自動(dòng)生化分析儀，有較大應(yīng)用范圍，市場前景良好，缺點(diǎn)是對(duì)不同大小的apo(a)分子檢測偏差較大，與纖溶酶原有交叉反應(yīng)，易受類風(fēng)濕因子干擾。因此，找到一種既能夠避免檢測偏差又操作簡便的檢測方法是本領(lǐng)域亟需解決的技術(shù)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種應(yīng)用于免疫比濁法的脂蛋白(a)檢測試劑盒，解決免疫比濁法對(duì)不同大小的apo(a)分子檢測偏差較大、與纖溶酶原有交叉反應(yīng)以及易受類風(fēng)濕因子干擾的問題。
[0007]基于上述目的本發(fā)明提供的脂蛋白(a)檢測試劑盒由試劑1、試劑2和工作校準(zhǔn)液組成:
[0008]其中試劑I的組分為(各組分的百分比為質(zhì)量濃度百分比):
【權(quán)利要求】
1.一種脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒由試劑1、試劑2和工作校準(zhǔn)液組成，其中: 所述試劑I由緩沖液、BSA、表面活性劑、IgG和NaN3組成；所述緩沖液選自PBS緩沖液、GOOD’ S緩沖液、Tris-HCl緩沖液及甘氨酸緩沖液中的一種；所述表面活性劑選自TWeen20和Triton X-100非離子型表面活性劑中的一種；所述IgG選自羊IgG、兔IgG和鼠IgG中的一種；所述緩沖液的PH值為6.0-9.0 ;所述BSA的質(zhì)量百分比為0.1%_2.0% ;所述表面活性劑的質(zhì)量百分比為0.1%-2.0% ;所述IgG的質(zhì)量百分比為1% ;所述NaN3的質(zhì)量百分比為0.1% ； 所述試劑2由緩沖液、脂蛋白(a)單抗膠乳微球、BSA、表面活性劑、IgG、穩(wěn)定劑和NaN3組成；所述緩沖液選自PBS緩沖液、GOOD’ S緩沖液、Tris-HCl緩沖液及硼酸緩沖液中的一種；所述表面活性劑選自Tween20和Triton X-100非離子型表面活性劑中的一種；所述穩(wěn)定劑選自蔗糖、甘油、乙二醇、PEG20000中的一種；所述IgG選自羊IgG、兔IgG和鼠IgG中的一種；所述緩沖液的pH值為7.0-9.0;所述脂蛋白(a)單抗膠乳微球的質(zhì)量百分比為0.15%-0.3% ;所述BSA的質(zhì)量百分比為0.1%-2.0% ;所述表面活性劑的質(zhì)量百分比為0.1%-2.0% ;所述IgG的質(zhì)量百分比為1% ;所述穩(wěn)定劑的質(zhì)量百分比為0.5%-5.0% ;所述NaN3的質(zhì)量百分比為0.1% ； 所述工作校準(zhǔn)液由緩沖液、脂蛋白(a)、NaCl、穩(wěn)定劑、BSA、EDTA和NaN3組成；所述緩沖液選自PBS緩沖液、GOOD’ S緩沖液、Tris-HCl緩沖液中的一種；所述穩(wěn)定劑選自蔗糖、甘油、乙二醇、PEG20000中的一種；所述緩沖液的pH值為7.0-9.0 ;所述脂蛋白(a)濃度為90-130mg/dl ;所述NaCl的量為150mM ;所述穩(wěn)定劑的質(zhì)量百分比為0.5%_5.0% ;所述BSA的質(zhì)量百分比為0.1%-2.0% ;所述EDTA的量為IOmM ;所述NaN3的質(zhì)量濃度百分比為0.1%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑I中緩沖液為pH值6.5-8.0的PBS緩沖液；所述BSA的質(zhì)量百分比為0.5%_1.0% ;所述表面活性劑為吐溫-20，所述吐溫-20的質(zhì)量百分比為0.1%-0.5% ;所述IgG為羊IgG，質(zhì)量百分比為1% ；所述NaN3的質(zhì)量百分比為0.1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑I中PBS緩沖液的PH值為7.0 ;所述BSA的質(zhì)量百分比為0.5% ;所述表面活性劑吐溫-20的質(zhì)量百分比為0.1% ;所述IgG為羊IgG，質(zhì)量百分比為1% ;所述NaN3的質(zhì)量濃百分比為0.1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑2中緩沖液為PH值為7.0-8.5的PBS緩沖液；所述脂蛋白(a)單抗膠乳微球的質(zhì)量百分比為0.15%-0.2% ;所述BSA的質(zhì)量百分比為0.2%-1.0% ;所述表面活性劑為吐溫_20，所述吐溫-20的質(zhì)量百分比為0.1-0.5% ;所述IgG為羊IgG，質(zhì)量百分比為1% ;所述穩(wěn)定劑為蔗糖，質(zhì)量百分比為2.0%-5.0% ;所述NaN3的質(zhì)量百分比為0.1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑2中的緩沖液為pH值7.0的PBS緩沖液；所述脂蛋白(a)單抗膠乳微球的質(zhì)量百分比為0.2% ;所述BSA的質(zhì)量百分比為0.2% ;所述表面活性劑為吐溫-20，質(zhì)量百分比為0.1% ;所述IgG為羊IgG，質(zhì)量百分比為1% ;所述穩(wěn)定劑為蔗糖，質(zhì)量百分比為2.0% ;所述NaN3的質(zhì)量百分比為0.1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述工作校準(zhǔn)液中緩沖液為PH值8.0-8.5的Tris-HCl緩沖液；所述NaCl的量為150mM ;所述穩(wěn)定劑為蔗糖，質(zhì)量百分比為2.0%-5.0%的質(zhì)量百分比為0.2%-1.0%的量為IOmM ;所述NaN3的質(zhì)量百分比為0.1% ;所述脂蛋白(a)的濃度為100mg/dL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述工作校準(zhǔn)液中為pH值8.0的Tris-HCl緩沖液；所述NaCl的量為150mM ;所述穩(wěn)定劑為蔗糖，質(zhì)量百分比為.5.0% ;所述BSA的質(zhì)量百分比為1.0% ;所述EDTA的量為IOmM ;所述NaN3的質(zhì)量百分比為.0.1% ;所述脂蛋白(a)的濃度為100mg/dL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述脂蛋白(a)單抗膠乳微球的制備方法為: 1)用50mMHEPES緩沖液(ρΗ7.5)稀釋單抗至lmg/ml ； 2)用MES緩沖液(IOmMpH5.0)稀釋IOOnm膠乳微球至質(zhì)量濃度為2%，共400 μ I ；
3)用MES 緩沖液(IOmM ρΗ5.0)分別配制 EDC (2mg/ml) 400 μ l，NHS(2mg/ml)400 μ I ； 4)向膠乳微球溶液中逐滴加入300μ I EDC溶液，然后逐滴加入300 μ INHS溶液，室溫?cái)嚢?5min ； 5)將活化的微球和單抗混合，室溫?cái)嚢?小時(shí)； 6)反應(yīng)后離心，去上清，沉淀用6ml試劑2緩沖液重懸，超聲分散。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒在檢測脂蛋白(a)方面的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蛋白(a)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒采用的測定方法為兩點(diǎn)終點(diǎn)法，測定溫度為37°C，反應(yīng)方向向上，樣本、試劑I和試劑2的比例為.2:180:60，測定主/副波長為600/none，取180 μ I試劑I加入2 μ I樣本或校準(zhǔn)后37°C穩(wěn)定孵育250秒，然后加入60 μ I試劑2繼續(xù)孵育50秒，記錄吸光度值A(chǔ)l，再繼續(xù)反應(yīng)300秒后記錄吸光度值Α2 ； 計(jì)算方法為ΔΑ=Α2_Α1 脂蛋白(a)濃度=(ΛΑ_/ΛΑ.) X校準(zhǔn)液濃度。
【文檔編號(hào)】G01N15/06GK103604930SQ201310549649
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:北京利德曼生化股份有限公司