檢測(cè)風(fēng)疹病毒的方法及量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫檢測(cè)方法，特別是涉及使用量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，以免疫學(xué)的方法檢測(cè)風(fēng)疹病毒的方法。一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，在塑料板上從下到上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；其中，所述硝酸纖維素膜一端有風(fēng)疹病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C；所述量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C相對(duì)應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。該方法的檢測(cè)靈敏度比常用的檢測(cè)靈敏度高1000倍左右。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)風(fēng)疹病毒的方法及量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫檢測(cè)方法，特別是涉及使用量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，以免疫學(xué)的方法檢測(cè)風(fēng)疹病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]風(fēng)疹病毒為RNA病毒，屬于披蓋病毒屬。風(fēng)疹病毒多克隆抗體結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，只有一種多克隆抗體型，無(wú)亞型。只感染人類，能在兔腎、乳田鼠腎及綠猴腎細(xì)胞生長(zhǎng)。外形呈粗糙球狀，直徑50?70nm，由一單股RNA基因組及脂質(zhì)外殼組成，內(nèi)含一個(gè)電子致密核心，覆蓋兩層疏松外衣。病毒不耐熱，在37°C和室溫中很快失去活力，耐寒，_20°C可短期保存，-60°C可相對(duì)穩(wěn)定保存幾個(gè)月。在人體外生活力較弱，對(duì)消毒劑敏感。出疹前及疹退后5天，在患兒的鼻咽部分泌物中可發(fā)現(xiàn)病毒。
[0003]目前，常用的檢測(cè)方法是膠體金法，此法雖然檢測(cè)快速簡(jiǎn)便，容易操作，但是準(zhǔn)確率較低，靈敏度也較低。因此尋求一種價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)便、靈敏度和特異性都較高的檢測(cè)方法是迫切需要解決的問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]針對(duì)上述技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)便、靈敏度和特異性都較高的檢測(cè)試紙以及用該試紙檢測(cè)風(fēng)疹病毒的方法。
[0005]一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，設(shè)有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙；
[0006]其中，所述塑料板上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0007]其中，所述硝酸纖維素膜一端有風(fēng)疹病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C ；
[0008]其中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C相對(duì)應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。
[0009]優(yōu)選的,所述量子點(diǎn)為CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)。
[0010]優(yōu)選的，所述塑料板為粘性PVC底板。
[0011]優(yōu)選的，所述風(fēng)疹病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
[0012]優(yōu)選的，所述兔抗鼠二抗的濃度為l.0g/L。
[0013]優(yōu)選的，所述檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5_。
[0014]如上所述的試紙的制備方法，包括如下步驟:
[0015](I)量子點(diǎn)與風(fēng)疫病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián):
[0016]取0.0lM的PBS緩沖液100?200uL與5?20uL表面連有羧基的量子點(diǎn)；[0017]選取偶聯(lián)試劑，偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)_3乙基碳二胺鹽酸鹽；
[0018]加入風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體150?200uL ；
[0019]搖床反應(yīng)I?4小時(shí)；
[0020]層析柱過(guò)濾，離心純化；
[0021 ] 用1%?5%的牛血清白蛋白封閉；
[0022]4°C 保存；
[0023](2)試紙的制備:
[0024]用0.05?0.15M的PBS緩沖液稀釋風(fēng)疹病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L風(fēng)疹病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端，形成檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存；
[0025]將量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B —端，與形成的T帶和C帶相對(duì)應(yīng)，室溫干燥，4°C保存；
[0026]在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0027]用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
[0028]用所述的試紙檢測(cè)風(fēng)疹病毒，包括如下步驟:與檢將樣品點(diǎn)樣在組裝好的試紙上接近風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的一端，反應(yīng)5min后，在紫外分析儀中觀察結(jié)果。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):由于在所制備的試紙中加入了核殼量子點(diǎn)，特別是采用了 CdTe/ZnSe水溶性核殼量子點(diǎn)，將水溶性的量子點(diǎn)與特異性的通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，然后利用雙抗夾心原理結(jié)合量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)檢測(cè)樣品中是否含有目標(biāo)物。在紫外燈的照射下，通過(guò)觀察免疫層析試紙條上檢測(cè)帶和質(zhì)控帶的熒光線，判斷檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明將免疫反應(yīng)的高特異性和量子點(diǎn)的熒光特性相結(jié)合，利用量子點(diǎn)多波長(zhǎng)激發(fā)，高強(qiáng)度熒光發(fā)射，發(fā)射峰窄，峰形對(duì)稱，發(fā)光穩(wěn)定性好的熒光特性，建立了快速，特異，簡(jiǎn)便，靈敏的免疫層析檢測(cè)方法。通過(guò)觀察熒光信號(hào)達(dá)到了定量檢測(cè)的目的。該方法的檢測(cè)靈敏度比目前常用的一種快速檢測(cè)方法-膠體金的檢測(cè)靈敏度高約1000倍左右。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為試紙制備的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0032]實(shí)施例1:一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，設(shè)有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙，所述玻璃纖維素膜A為沒(méi)有點(diǎn)樣的市場(chǎng)上購(gòu)買的玻璃纖維素膜；
[0033]其中，所述塑料板上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0034]其中，所述硝酸纖維素膜一端有風(fēng)疹病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C ；
[0035]其中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C相對(duì)應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。
[0036]優(yōu)選的,所述量子點(diǎn)為CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)。
[0037]優(yōu)選的，所述塑料板為粘性PVC底板。
[0038]優(yōu)選的，所述風(fēng)疹病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
[0039]優(yōu)選的，所述兔抗鼠二抗的濃度為1.0g/L。
[0040]優(yōu)選的，所述檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5mm。
[0041]實(shí)施例2:如上所述的試紙的制備方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0042](I)量子點(diǎn)與風(fēng)疫病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián):
[0043]取0.0lM的PBS緩沖液100?200uL與5?20uL表面連有羧基的量子點(diǎn)；
[0044]選取偶聯(lián)試劑，偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)_3乙基
碳二胺鹽酸鹽；
[0045]加入風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體150?200uL ；
[0046]搖床反應(yīng)I?4小時(shí)；
[0047]層析柱過(guò)濾，離心純化；
[0048]用1%?5%的牛血清白蛋白封閉；
[0049]4°C 保存；
[0050](2)試紙的制備:
[0051]用0.05?0.15M的PBS緩沖液稀釋風(fēng)疹病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L風(fēng)疹病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端，形成檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存；
[0052]將量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疫病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B —端,與T帶和C帶相對(duì)應(yīng)，室溫干燥，4°C保存；
[0053]在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0054]用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
[0055]其中，步驟(I)中偶聯(lián)效果的檢測(cè)方法如下:
[0056]凝膠電泳法:采用0.8瓊脂糖凝膠，電壓為80V，電泳15min后，在紫外分析儀中觀察電泳結(jié)果。
[0057]斑點(diǎn)印跡法:將0.3g/L風(fēng)疹病毒-BSA液點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，晾干后浸泡于含5%BSA 的 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，10nmol/L, PH=7.4，含 NaC18.5g/L)中，封閉膜上剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，于37°C孵育lh，封閉后取出，PBS洗滌。制備三個(gè)完全相同的風(fēng)疹病毒印跡膜，晾干后分別放入量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疫病毒IgG單克隆抗體,量子點(diǎn)-BSA及量子點(diǎn)溶液，于37°C搖床反應(yīng)30min，PBS洗滌。紫外分析儀中觀察結(jié)果。
[0058]實(shí)施例3:用所述的試紙檢測(cè)風(fēng)疹病毒，包括如下步驟:與檢將樣品點(diǎn)樣在組裝好的試紙上接近風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的一端，反應(yīng)5min后，在紫外分析儀中觀察結(jié)果。用PBS緩沖液及正常人的血液設(shè)為空白對(duì)照。
[0059]結(jié)果判定:在C帶顯現(xiàn)紅色熒光帶的前提下，目視T帶的熒光帶強(qiáng)度，與空白對(duì)照，熒光越弱，代表待測(cè)液中含被檢物的濃度越低。
[0060]實(shí)施例4:試紙檢測(cè)有效性驗(yàn)證，配制四種濃度的風(fēng)疹病毒溶液，濃度分別為0.5，1.0,2.0,5.0ug/L。利用檢測(cè)試紙和化學(xué)發(fā)光試紙盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度檢測(cè)6次，測(cè)定試紙檢出結(jié)果的有效性。如表一所示，結(jié)果表明用本發(fā)明制備的試紙檢測(cè)出來(lái)的呈現(xiàn)陽(yáng)性，并且溶液濃度越大熒光強(qiáng)度越大。
[0061]表一:各種濃度風(fēng)疹病毒的試紙條檢測(cè)結(jié)果
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，設(shè)有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙； 其中，所述塑料板上從下到上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙； 其中，所述硝酸纖維素膜一端有風(fēng)疹病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C ； 其中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的一端，與檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C相對(duì)應(yīng)，并且量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體位于進(jìn)樣點(diǎn)一端。
2.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述量子點(diǎn)為CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述塑料板為粘性PVC底板。
4.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述風(fēng)疹病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
5.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述兔抗鼠二抗的濃度為 1.0g/Lo
6.如權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn) 標(biāo)記免疫層析試紙，其特征在于，所述檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5mm。
7.如上任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)量子點(diǎn)與風(fēng)疫病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián): 取0.01M的PBS緩沖液100~200uL與5~20uL表面連有羧基的量子點(diǎn)； 選取偶聯(lián)試劑； 加入風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體150~200uL ； 搖床反應(yīng)I~4小時(shí)； 層析柱過(guò)濾，離心純化； 用1%~5%的牛血清白蛋白封閉； 4°C保存； (2)試紙的制備: 用0.05~0.15M的PBS緩沖液稀釋風(fēng)疹病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L風(fēng)疹病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4 C保存； 將量子點(diǎn)標(biāo)記的風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B上，室溫干燥，4°C保存； 在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點(diǎn)標(biāo)記風(fēng)疫病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙； 用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
8.如權(quán)利要求7所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)-3乙基碳二胺鹽酸鹽。
9.用權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的試紙檢測(cè)風(fēng)疹病毒，其特征在于，包括如下步驟：與檢將樣品點(diǎn)樣在組裝好的試紙上接近風(fēng)疹病毒IgG單克隆抗體的一端，反應(yīng)5min后，在紫外分析儀 中觀察結(jié)果。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103529211SQ201310484759
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】文德敏, 申有長(zhǎng), 于曉永 申請(qǐng)人:北京華衛(wèi)天和生物科技有限公司