一種帶有熒光素酶基因的jev感染性克隆及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法

一種帶有熒光素酶基因的jev感染性克隆及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆及構(gòu)建方法和應(yīng)用。一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆，其制備步驟是：（1）JEV病毒SA14株基因序列的分段合成；（2）JEV病毒感染性克隆的組裝與構(gòu)建；（3）帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆的構(gòu)建。本發(fā)明通過免疫熒光、Rluc活性的檢測、病毒噬斑、藥物抑制、活體動(dòng)物成像及疫苗評價(jià)等實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明所構(gòu)建的帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆可以拯救出具有與JEV病毒生長趨勢相同的Rluc-JEV報(bào)告病毒，并且在動(dòng)物模型、病毒復(fù)制與致病機(jī)理、藥物篩選和藥物作用機(jī)制、活體動(dòng)物成像及疫苗評價(jià)等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆及構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆，還涉及一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆的制備方法，以及該克隆拯救出的Rluc-JEV報(bào)告病毒在抗病毒藥物篩選、動(dòng)物活體成像以及乙型腦炎疫苗評價(jià)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是流行性乙型腦炎(簡稱乙腦)的病原體，病毒通過蚊蟲叮咬傳播,病毒隨著蚊蟲唾液進(jìn)入人體,引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，病死率和致殘率高，作為一種以兒童為高發(fā)人群的傳染病，乙腦嚴(yán)重危害兒童的身心健康。乙腦主要流行于亞洲地區(qū)，1995年開始傳播至澳大利亞，近年來流行區(qū)覆蓋至亞洲和太平洋地區(qū)的24個(gè)國家，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。我國是乙腦流行最嚴(yán)重的國家之一，乙腦疫苗的大規(guī)模使用明顯降低了我國乙腦發(fā)病率。盡管如此，2012年WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球每年約有20，000例流行性乙腦病例發(fā)生，其中60000人死亡，約有30%-50%的患者存有終生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，我國大陸的發(fā)病人數(shù)仍占全球病例的50%左右。目前為止，尚無特效抗病毒藥物治療JEV感染引發(fā)的乙型腦炎，主要采用對癥及支持療法。為了降低乙型腦炎的病死率和后遺癥的發(fā)生，科學(xué)工作者針對JEV展開了深入研究，包括病毒復(fù)制機(jī)制和致病機(jī)理等，以期為研制針對乙腦的抗病毒藥物，研發(fā)新型疫苗和改良治療方法提供理論依據(jù)。
[0003]JEV病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員，同屬的其它病毒包括登革病毒(DENV)、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、黃熱病毒(YFV)和西尼羅河病毒(WN V)等，均是引起人類致病的重要病原體。黃病毒屬病毒為包膜病毒，基因組為單正鏈RN A，大約長10~llkb，5’端具有有細(xì)胞mRNA類似的7-甲基鳥苷帽(Cap)結(jié)構(gòu)，但3’端缺少多聚腺苷尾Poly A.病毒基因組含有一個(gè)大的閱讀框，在進(jìn)入細(xì)胞后即可以自身為信使RN A，翻譯出一條多聚蛋白，在細(xì)胞和病毒蛋白酶的作用下切割成三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白有多種酶活性，主要參與病毒的復(fù)制，包括NS1，NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B和NS5.結(jié)構(gòu)蛋白主要與病毒的包裝有關(guān)，分別是衣殼蛋白(Capsid，C)、P rM蛋白和包膜E蛋白。
[0004]RNA病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù)，也稱為“病毒拯救”技術(shù)，一般是在質(zhì)粒中構(gòu)建含有整個(gè)病毒基因組的cDNA拷貝，通過體外轉(zhuǎn)錄過程再次得到病毒基因組RNA，將此RNA轉(zhuǎn)染病毒敏感細(xì)胞中可以拯救出活病毒，這種cDNA質(zhì)粒稱為感染性克隆。通過感染性cDN A克隆，科學(xué)工作者可以在DNA水平上對病毒基因組進(jìn)行各種修飾和改造，通過病毒的表型來判斷這些操作對病毒的影響，從而研究病毒復(fù)制機(jī)制和致病機(jī)理，甚至得到減毒株，研發(fā)新型疫苗。因此，感染性克隆的構(gòu)建解決了 RNA病毒基因組難以操作的困擾，為RNA病毒的研究提供有效的工具。目前已有許多RNA病毒的全長感染性克隆構(gòu)建成功，如腸道病毒屬的EV71病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒， 黃病毒屬的登革病毒、黃熱病毒等，在RNA病毒研究領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。報(bào)告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因，如熒光蛋白或熒光素酶等。在感染性克隆的基礎(chǔ)上，將報(bào)告基因與病毒基因組融合，構(gòu)建含有報(bào)告基因的病毒cDNA感染性克隆，拯救出具有感染性的穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因的病毒，通過測定報(bào)告基因所表達(dá)蛋白的活性即可直觀判斷病毒生長情況。與傳統(tǒng)的病毒滴度檢測方法相比，報(bào)告基因的表達(dá)檢測靈敏度更高、檢測時(shí)間極大縮短，可以大大提高病毒檢測的效率和靈敏度。這種含有含有報(bào)告基因和病毒基因組的克隆稱為報(bào)告病毒感染性克隆，其拯救出的病毒稱為報(bào)告病毒。與感染性克隆相比，報(bào)告病毒感染性克隆顯然有著更加便捷的優(yōu)勢。
[0005]活體動(dòng)物體內(nèi)成像是近年來新興的檢測活體動(dòng)物體內(nèi)基因表達(dá)及細(xì)胞活動(dòng)的光學(xué)成像技術(shù)，具有操作簡便，直觀性強(qiáng)的特點(diǎn)?；铙w動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光技術(shù)和熒光技術(shù)。其中生物發(fā)光是用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，利用報(bào)告基因產(chǎn)生的生物發(fā)光就可以形成體內(nèi)的生物光源。雖然哺乳動(dòng)物組織是不透光的，但是利用靈敏的光子成像技術(shù)可以從動(dòng)物體表檢測到組織內(nèi)部的生物光源,使研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為，操作簡單、結(jié)果直觀、靈敏度高，是一種十分有效的研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理過程的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。因此，將熒光素酶與病毒基因組進(jìn)行融合而構(gòu)建的報(bào)告病毒感染性克隆，是將反向遺傳學(xué)技術(shù)與活體動(dòng)物成像技術(shù)結(jié)合起來，對病毒在體內(nèi)進(jìn)行追蹤，觀察病毒在體內(nèi)的發(fā)展過程，可為研究者提供廣闊的應(yīng)用空間。
[0006]本發(fā)明提供一種帶有海腎熒光素酶(Renilla luciferase，Rluc)基因的JEV病毒的感染性克隆的構(gòu)建方法，以及該感染性克隆所拯救出的報(bào)告病毒Rluc-JEV在藥物篩選和動(dòng)物活體成像、疫苗 評價(jià)等方面的應(yīng)用。本發(fā)明所構(gòu)建的帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆將為深入展開JEV病毒的復(fù)制、包裝機(jī)制等基礎(chǔ)理論研究以及藥物研發(fā)、疫苗評價(jià)等應(yīng)用研究提供有效的技術(shù)平臺，可有效地服務(wù)于人類的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供了一種帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆pACYC-Rluc-JEV-FL，其序列為 SEQ ID N0.1 所示，其中，I ~95:JEV_5’UTR序列;96 ~197:JEV-Capsid蛋白N端34位氨基酸序列；198~1130:海腎熒光素酶序列;1131~1190: 口蹄疫病毒FMDV2A自切割肽序列；1191~12071 JEV病毒結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白以及3’UTR序列;12071~12268:丁型肝炎病毒核酶(HDVR)序列；12269~14692:pACYC177序列；14693~14710:T7啟動(dòng)子序列。
[0008]本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的構(gòu)建方法，根據(jù)本發(fā)明提供的方法，構(gòu)建帶有海腎熒光素酶Rluc報(bào)告基因的JEV SA14病毒株感染性克隆，并將體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA轉(zhuǎn)染ΒΗΚ-21細(xì)胞，通過定點(diǎn)收集細(xì)胞和上清，可獲得帶有熒光素酶的JEV病毒。
[0009]本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在活體動(dòng)物成像中的應(yīng)用。利用帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV報(bào)告病毒對小鼠進(jìn)行Rluc-JEV報(bào)告病毒感染實(shí)驗(yàn)，通過動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)Rlu c信號，實(shí)現(xiàn)了對病毒在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)觀察。[0010]本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在抗病毒藥物篩選的應(yīng)用。利用該克隆所拯救出的Rluc-JEV報(bào)告病毒，通過檢測熒光素酶活性，可知道藥物對病毒的抑制情況，可以作為有效的抗病毒藥物篩選平臺。
[0011]本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了一種帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆在乙型腦炎疫苗評價(jià)中的應(yīng)用。通過比較新型疫苗株病毒免疫的小鼠與未免疫對照小鼠在感染Rl uc-JEV報(bào)告病毒后的動(dòng)物成像結(jié)果，對新型疫苗研制進(jìn)行效果評價(jià)。
[0012]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0013]本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為:
[0014]以低拷貝的載體PACYC177為對象，將JEV的基因組插入到pACYC177中，同時(shí)在與病毒5’端非編碼區(qū)上游的連接區(qū)域引入T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，病毒3’末端引入HDVR(hepatitis delta virus ribozyme, HDVR)序列，并將 Rluc 基因插入病毒衣殼蛋白capsid的N端，Rluc基因插入的同時(shí),將capsid的N端34個(gè)氨基酸進(jìn)行重復(fù)拷貝，因此帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆基因組的順序?yàn)?T7-5’ UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-PrM-E-NSl~5_3’ UTR.其中5’ UTR后面重復(fù)的capsid-34可以提供病毒復(fù)制必須的順式作用元件，保證病毒5’末端和3’末端的正常環(huán)化，從而不影響Rluc插入后的基因組的正常復(fù)制。此外，T7啟動(dòng)子可以線性化的DNA為模板，在體外高效的轉(zhuǎn)錄獲得病毒RNA，H DVR序列可將轉(zhuǎn)錄后的RNA從3’ UTR末端與pACYC載體序列切割開來，從而保證體外轉(zhuǎn)錄的RNA具有正確的病毒3’ UTR序列。以上處理可以高效獲得正確的病毒RNA，并解決了外源基因插入病毒基因組造成基因組不復(fù)制的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，RNA可正常復(fù)制，并產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子。
[0015]一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆，其構(gòu)建方法如下:
[0016]1) JEV-SA14病毒株基因組序列分段合成:
[0017]構(gòu)建帶有JEV全長基因組的cDNA感染性克隆:選擇JEV-SA14病毒株序列，GenBank N0.U14163.1;分成四個(gè)片段進(jìn)行基因合成，這四個(gè)片段分別命名為片段A，片段B，片段C，和片段D，其中片段A為T7+基因組I~3450nt序列，片段B為基因組3446_5581nt序列，片段C為基因組5576-9136nt序列，片段D為基因組9121_10976nt+H DVR序列；T7啟動(dòng)子序列如SEQ ID N0.2所示，HDVR序列為SEQ ID N0.3所示，四個(gè)片段分別用Psi I和BamH I插入低拷貝質(zhì)粒pACYC177載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)HBlO ;質(zhì)粒均經(jīng)過DNA測序鑒定為正確序列，分別命名為pACYC-A，pACYC-B, pAC YC-C和pACYC-D。
[0018]2)含有病毒基因組的JEV cDNA感染性克隆的構(gòu)建:
[0019](I)JEV基因組片段A+B的拼接:用BspE I和BamH I酶切上述步驟I)中所得的pACYC-A和pACYC-B，回收pACYC-A的大片段與pACYC-B的大片段；將pACYC-A的大片段作為載體，pACYC-B的大片段作為片段，使用T4DNA連接酶將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HB101，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定；將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pACYC-A+B ；
[0020](2) JEV基因組片段C+D的拼接:用Xba I和Xho I酶切上述步驟I)中所得的pACYC-C和pACYC-D，回收pACYC-C的大片段與pACYC-D的大片段；將pACYC_C的大片段作為載體，pACYC-D的大片段作為片段，使用T4DNA連接酶將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HB101，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定；將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pACYC-C+D ；
[0021](3) JEV基因組全長pACYC-A+B+C+D的拼接:用BamH I和Xho I酶切上述步驟中所得的pACYC-A+B和上述步驟所得pACYC-C+D，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收pACYC-A+B的大片段與pACYC-C+D的大片段；將pACYC-A+B的大片段作為載體，pACYC-C+D的大片段作為片段，使用T4DNA連接酶將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HB101，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒即為拼接完成的含有JEV全長基因組的cDNA質(zhì)粒，命名為pACYC-JEV-FLο
[0022]3)帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的構(gòu)建:
[0023](I)待融合的三個(gè)目的基因的特異性擴(kuò)增:
[0024]①片段T7-5’ UTR-Capsid-34 的擴(kuò)增:以 pACYC-JEV-FL 為模板，使用 PrimeSTARHS酶擴(kuò)增含有T7-5’UTR-Capsid-34的序列，引物為SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6所示，回收DNA片段。
[0025]②片段Rluc-2A的特異性擴(kuò)增:以含有Rluc基因的WNV-Rluc-r印Iicon質(zhì)粒為模板，使用PrimeSTAR HS酶擴(kuò)增含有Rluc_2A的序列，引物為SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8，回收DNA片段；
[0026]③片段Capsid-prM-E的特異性擴(kuò)增:以pACYC-JEV-FL為模板，使用PrimeSTAR HS酶擴(kuò)增含有Capsid-prM-E的序列，引物為SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10，回收DN A片段；
[0027](2)兩步融合 PCR 法擴(kuò)增 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 片段:
[0028]第一步融合PCR:片段T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc_2A的融合PCR特異性擴(kuò)增:以上述所得片段T7-5’ UTR-Capsid-34和Rluc_2A為模板，使用PrimeSTAR HS酶擴(kuò)增含有T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc-2A 的序列，引物為 SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.8，回收 DNA 片段；
[0029]第二步融合PCR:片段 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 的融合 PCR特異性擴(kuò)增:以上述所得片段Capsid-prM-E和T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc_2A為模板，使用 PrimeSTAR HS 酶擴(kuò)增含有 T7-5’ UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 的序列，引物為SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.10，回收 DNA 片段；
[0030](3)將熒光素酶基因Rluc插入JEV全長感染性克隆:將T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Cap si d-prM-E和JEV全長感染性克隆pACYC-JEV-FL分別用Kpn I和BsrG I雙酶切。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)過T4DNA連接酶將回收的酶切產(chǎn)物按照片段:載體摩爾比為6:1進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化HBlOl感受態(tài)，將PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，測序正確，獲得的質(zhì)粒即為帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆，命名為 pACYC-Rluc-JEV-FL。
[0031]帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆成功拯救出與野生型病毒生長趨勢相同的Rluc-JEV報(bào)告病毒，其步驟是:
[0032]1、用Xho I酶切pACYC-JEV-FL及pACYC-Rluc-JEV-FL進(jìn)行線性化處理，線性化產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提后，分別以線性化的pACYC-JEV-FL和pACYC-Rluc-JEV-FL為模板，使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒T7mMESSAGE mMACHINE kit (購自美國Ambion公司)，按照試劑盒說明分別得到帶 JEV 的 RNA 及 Rluc-JEV 的 RNA。
[0033]2、體外轉(zhuǎn)錄得到的Rluc-JEV及JEV RNA分別使用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，接種2 X IO5轉(zhuǎn)染了各RNA的BHK細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在轉(zhuǎn)染后2、12、24、48、72和96h后收取培養(yǎng)基上清作為不同時(shí)間點(diǎn)的Rluc-JEV及JEV PO代病毒，并于_80°C保存。
[0034]3、接種2 X IO5轉(zhuǎn)染了 Rluc-JEV的BHK細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在轉(zhuǎn)染后2、12、24、48、72和96h后，收集上清完畢后分別向孔中加入Iml PBS洗一遍后，吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ I細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，分別混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入 50μ1 的底物腔腸素(coelenterazine),按照 Luciferase Assay S ystem(購于Promega公司)說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀(購于德國Thermo公司)檢測Rluc的活性。
[0035]4、接種4 X IO5轉(zhuǎn)染了 Rluc-JEV及JEV RNA的BHK細(xì)胞于每孔放置了三個(gè)IOmmX IOmm蓋玻片的6孔板中，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h后用丙酮固定液(購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)對細(xì)胞進(jìn)行固定，使用針對黃病毒E蛋白的抗體進(jìn)行免疫熒光檢測，檢測RN A轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后的病毒E蛋白表達(dá)情況；
[0036]5、雙層噬斑檢測不同時(shí)間點(diǎn)的Rluc-JEV及JEV PO代病毒的噬斑形態(tài)及生長曲線:在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中分別接種4X IO5個(gè)VeiO細(xì)胞，24h后待細(xì)胞覆蓋孔底80-90%時(shí)，吸棄孔中的培養(yǎng)基，加入DMEM培養(yǎng)基10倍比稀釋的轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的Rluc-JEV及JEV的病毒100μ 1，37°C吸附lh。吸附完畢后將各個(gè)孔的病毒液吸棄，加入第一層由含有2%FBS培養(yǎng)基的瓊脂糖覆蓋物，于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，加入第二層含有中性紅的瓊脂糖覆蓋物，于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后觀察噬斑形態(tài)和數(shù)量。
[0037]—種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用，其步驟是:
[0038]本發(fā)明選擇兩種已知的對黃病毒屬病毒有抑制作用的藥物:利巴韋林及NITD008來檢測這兩種藥物對Rluc-JEV的抑制作用:
[0039]1、利巴韋林對Rluc-JEV的抑制作用:在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中接種
IX 105BHK-21細(xì)胞，在37 °C，5%C02培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到60%時(shí)，分別向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染復(fù)數(shù)MOI為0.01，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中吸附Ih后，將各個(gè)孔的病毒液用槍頭吸棄，分別加入用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2倍系列稀釋的利巴韋林(濃度分別為0,0.25,0.5,0.25、1和2mg/ml )，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后分別丟棄孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ I細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物，按照LuciferaseAssay System (前面已述)說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀(前面已述)檢測Rluc的活性。
[0040]2、NITD008對Rluc-JEV的抑制作用:在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中接種I X 105BHK_21細(xì)胞，在37°C，5%C02培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到60%時(shí)，分別向每孔加入Rluc-JEV病毒液，感染復(fù)數(shù)MOI為0.01，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中吸附Ih后，將各個(gè)孔的病毒液用槍頭吸棄，分別加入用含2 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基系列稀釋的NITD008 (濃度分別為O、0.11、1、3、9和27 μ Μ),于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后分別丟棄孔中的上清，并向孔中加入ImlPBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ I細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物,按照Luciferase Assay System(前面已述)說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀(前面已述)檢測Rluc的活性。[0041]一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆在活體動(dòng)物成像中的應(yīng)用，其步驟是:[0042]取兩只三周齡BALB/c小鼠，每只均經(jīng)腹腔注射I X IO7PFU Rluc-JEV病毒，分別在接種病毒后的24h、48h和72h以后，每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔腸素(Coelenterazine)(購于Promega公司),注射腔腸素10分鐘后,將小鼠經(jīng)小動(dòng)物麻醉機(jī)(購于
美國Matrx公司)麻醉后放入成像暗箱，使用Xenogeri IVISr 50成像系統(tǒng)(購于美國精諾真公司Xenogen Corp)進(jìn)行檢測成像并攝取影像，應(yīng)用系統(tǒng)配套分析軟件ROI對小鼠體內(nèi)細(xì)胞或組織發(fā)出的熒光進(jìn)行定量分析。
[0043]一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆在乙型腦炎疫苗評價(jià)中的應(yīng)用，其步驟是:
[0044]取兩只三周齡BALB/c小鼠，分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)腹腔注射
0.03ml乙型腦炎減毒疫苗JEV-SA14-14-2 (購于北京生物制品研究所)，對照組腹腔注射0.03mlPBS。三周后，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠均經(jīng)腹腔注射IX IO7PFU Rluc-JEV病毒，分別于注射Rluc-JEV病毒后第3天和第5天，實(shí)驗(yàn)組小鼠和對照組小鼠分別經(jīng)腹腔注射
1.5mgRluc的底物腔腸素，注射腔腸素10分鐘后，將小鼠經(jīng)小動(dòng)物麻醉機(jī)(前面已述)麻醉
后放入成像暗箱，使用Xenogen SVISe 50成像系統(tǒng)(前面已述)進(jìn)行檢測成像并攝取影像，應(yīng)用系統(tǒng)分析軟件ROI進(jìn)行分析，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠體內(nèi)細(xì)胞或組織發(fā)出的熒光量。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0045]1、本發(fā)明制備的帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆可以高效獲得正確的病毒R NA，并解決了外源基因插入病毒基因組造成基因組不復(fù)制的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，RNA可正常復(fù)制，并產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子。
[0046]2、本發(fā)明中的Rluc-JEV報(bào)告病毒感染性克隆拯救出的Rluc-JEV與野生型JEV病毒有著相同的生長趨勢，Rluc-JEV病毒滴度又與Rluc信號值直線相關(guān)，因此，可通過直接檢測Rluc信號值，即可判斷Rluc-JEV的病毒生長情況，繼而反映JEV的病毒生長情況。因此，可通過檢測Rluc信號來替換傳統(tǒng)的病毒滴度測定方法，與傳統(tǒng)的通過病毒噬斑檢測病毒生長情況相比，通過檢測Rluc-JEV的熒光素酶活性來反映病毒生長趨勢更加快捷、更加靈敏。不僅具有極高的檢測靈敏度，而且可以用低廉的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用在極短的時(shí)間獲得預(yù)期的實(shí)驗(yàn)或檢測結(jié)果。
[0047]3、通過藥物抑制實(shí)驗(yàn)，證明本發(fā)明中的帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒是有效的藥物篩選平臺。與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比，Rluc-JEV病毒不僅有著明顯的靈敏度和高效率，還可以用于高通量篩選抗病毒藥物，可同時(shí)對多種藥物抗病毒效果進(jìn)行快速檢測，縮短藥物研發(fā)周期，是研發(fā)出特異性抗JEV病毒藥物的有效工具。與目前應(yīng)用廣泛的帶有報(bào)告基因的復(fù)制子系統(tǒng)篩選體系相比，Rluc-JEV報(bào)告病毒與帶有報(bào)告基因的復(fù)制子系統(tǒng)一樣，具有易操作、高靈敏度以及高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)，都可應(yīng)用于抗病毒藥物的高通量篩選。同時(shí)，Rluc-JEV報(bào)告病毒克服了復(fù)制子系統(tǒng)不能篩選作用靶點(diǎn)為病毒結(jié)構(gòu)蛋白的藥物的缺點(diǎn):復(fù)制子系統(tǒng)由于缺失病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因，僅能檢測作用靶點(diǎn)為非結(jié)構(gòu)蛋白的藥物；然而本發(fā)明所拯救出的Rluc-JEV病毒含有病毒全長基因組，可形成具有感染性的病毒粒子，不僅可以篩選作用靶點(diǎn)為非結(jié)構(gòu)蛋白的藥物，還能篩選出作用靶點(diǎn)為結(jié)構(gòu)蛋白的藥物，并可區(qū)分出所篩選藥物的作用機(jī)制是基于病毒的復(fù)制過程還是包裝過程。
[0048]4、本發(fā)明中的帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒可有效在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行活體成像。這項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)無損傷的在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行病毒的動(dòng)態(tài)示蹤，因此可以利用同一組動(dòng)物進(jìn)行長時(shí)間的研究，從而大大減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用數(shù)量。更為有力的是，由于一系列的數(shù)據(jù)來源于同一只或同一組動(dòng)物，以自身作為內(nèi)對照，大大增加了數(shù)據(jù)的可靠性。通過活體動(dòng)物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可觀測到病毒在動(dòng)物體內(nèi)的發(fā)展進(jìn)程以及藥物治療或疫苗免疫所產(chǎn)生的反應(yīng)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物水平的藥物測試和疫苗評價(jià)。通過活體動(dòng)物成像系統(tǒng)，可以觀察Rluc-JEV病毒在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反映；并且是同一批老鼠持續(xù)觀察，可排除個(gè)體間的差異；具有更高的靈敏度，在整體上觀察活體動(dòng)物的感染途徑；可定量比較各個(gè)器官的感染程度。
[0049]5.本發(fā)明所構(gòu)建的帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆，是以JEV病毒強(qiáng)毒株SA14株為模板所構(gòu)建的，SA14病毒為強(qiáng)毒株，其弱毒株SA14-14-2為目前廣泛使用的乙型腦炎疫苗株。通過比較JEV-SA14-14-2疫苗株病毒免疫的小鼠與未免疫對照小鼠在感染Rluc-JEV報(bào)告病毒后的動(dòng)物成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疫苗株免疫的小鼠可以抵抗Rluc-JEV病毒感染，成像結(jié)果為陰性，而未免疫對照小鼠則可以檢測到明顯的Rluc信號，證明本發(fā)明所構(gòu)建的Rluc-JEV報(bào)告病毒系統(tǒng)可用于疫苗評價(jià)，未來可對新型疫苗研制進(jìn)行效果評價(jià)。
[0050]因此，以本發(fā)明為基礎(chǔ)，將為深入開展JEV的動(dòng)物模型、病毒的復(fù)制機(jī)制與致病機(jī)理，抗病毒藥物篩選和藥物的作用機(jī)制、疫苗和診斷試劑等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因此具有十分重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
【專利附圖】

【附圖說明】: [0051]圖1為一種含有JEV病毒SA14株基因組cDNA的JEV全長感染性克隆的構(gòu)建示意圖。
[0052]圖2為一種帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的構(gòu)建示意圖。
[0053]圖3為一種由感染性克隆拯救出的JEV及Rluc-JEV病毒免疫熒光及噬斑形態(tài)示意圖。
[0054]圖4為JEV及Rluc-JEV RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞的病毒生長曲線，及Rluc-JEV不同時(shí)間點(diǎn)的Rluc信號與病毒滴度的線性關(guān)系示意圖。
[0055]A =Rluc-JEV不同時(shí)間點(diǎn)的Rluc信號，以及JEV和Rluc-JEV轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的病毒生長曲線；
[0056]B =Rluc-JEV不同時(shí)間點(diǎn)的Rluc信號與病毒滴度的線性關(guān)系，其中R2=0.986，y=0.6881x+5.0966.[0057]圖5為抗病毒藥物NITD008及利巴韋林對Rluc-JEV病毒的抑制作用示意圖。
[0058]A:不同濃度NITD008作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信號；
[0059]B:不同濃度利巴韋林作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信號。
[0060]圖6為Rluc-JEV感染小鼠后第1，3，5天動(dòng)物活體成像示意圖。
[0061]圖7為JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的實(shí)驗(yàn)組小鼠及未免疫對照組小鼠在感染Rluc-JEV后的體內(nèi)成像示意圖。
[0062]A為JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的實(shí)驗(yàn)組小鼠及未免疫對照組小鼠在感染Rluc-JEV后的體內(nèi)成像圖；
[0063]B為ROI軟件分析免疫組與對照組小鼠腹腔內(nèi)的Rluc信號值對比；
[0064]C為ROI軟件分析免疫組與對照組小鼠腦內(nèi)的Rluc信號值對比。
【具體實(shí)施方式】
[0065]本實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法以下列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以下實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0066]實(shí)施例1:
[0067]一種帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的構(gòu)建方法，其步驟是:
[0068]1 .JEV-SA14病毒株基因組序列分段合成:
[0069]構(gòu)建帶有JEV全長基因組的cDNA感染性克隆:選擇JEV-SA14 (GenBankN0.U14163.1)病毒株序列，分成四個(gè)片段進(jìn)行基因合成(金唯智生物科技有限公司)，這四個(gè)片段分別命名為片段A，片段B，片段C，和片段D。其中片段A包括”T7+基因組1~3450nt ”的序列，片段B包括”基因組3446-558 Int ”的序列，片段C包括“基因組5576-9136nt “的序列，片段D包括“基因組9121_10976nt+HDVR”的序列。片段A中的”T7”為啟動(dòng)子，序列如SEQ ID N0.2所示，位于病毒基因組5’UTR之前，是為了保證構(gòu)建的cDNA在體外轉(zhuǎn)錄得到基因組RNA。片段D中的”HDVR”為序列為丁型肝炎病毒核酶(hepatitisdelta virus ribozyme, HDVR)序列，序列如SEQ ID N0.3所不,位于病毒基因組3’ UTR之后，可將體外轉(zhuǎn)錄出的RNA自3’ UTR處切斷，與cDNA克隆3’ UTR后面的載體序列分開，形成正確的基因組3’UTR末端，如此在體外轉(zhuǎn)錄出的RNA序列，即為完整的JEV基因組R NA，不含有其他非特異序列。四個(gè)片段分別用Psi I (購于美國NEB公司)和BamH I (購于美國NEB公司)插入低拷貝質(zhì)粒PACYC177載體(購于美國Promega公司)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)HBlOl (購于美國Promega公司)。含有所合成基因片段的質(zhì)粒均經(jīng)過D NA測序鑒定為正確序列，分別命名為 pACYC-A，pACYC-B, pACYC-C 和 pACYC-D。
[0070]2、含有病毒基因組的JEV cDNA感染性克隆的構(gòu)建:
[0071](I) JEV基因組片段A+B的拼接:用BspE I (購于美國NEB公司)和BamH I(前面已述)酶切上述步驟I中所得的pACYC-A和pACYC-B，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)回收pACYC-A的大片段與pACYC-B的大片段，使用T hermo Scientific NanoDrop2000 (購于Thermo公司)測定DNA的濃度，使用1%瓊月旨糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。將pACYC-A的大片段作為載體，pACYC-B的大片段作為片段，使用T4DNA連接酶(購于美國NEB公司)將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定。PCR的鑒定反應(yīng)體系為:10Xbuffer:2U1 , dNTP:0.4μ 1，引物(5，-GAATGCCCTGATGAGCACAGA-3，):0.2 μ 1，弓丨物(5，-A TGGCAAACATCAATCCA-3，):0.2 μ 1，Taq 酶:0.2 μ 1，水:16.8 μ 1，總體系 20 μ 1.擴(kuò)增條件為:94°C 2min,94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 3min,72°C IOmin, 16 °C IOmi n，28 個(gè)循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pACYC-A+B。[0072](2) JEV基因組片段C+D的拼接:用Xba I (購于美國NEB公司)和Xho I (購于美國NEB公司)酶切上述步驟I中所得的pACYC-C和pACYC_D，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收pACYC-C的大片段與pACYC-D的大片段，使用Thermo S cientificNanoDrop2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DN A的質(zhì)量。將pACYC-C的大片段作為載體，pACYC-D的大片段作為片段，使用T4DNA連接酶(前面已述)將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HBlOl (前面已述)，挑取菌落并進(jìn)行 PCR 鑒定。PCR 鑒定的反應(yīng)體系為:10Xbuffer:2y I, dNTP:0.4μ I,引物(5，_GGAAGGCCTGGGGGCAGGACG-3，):0.2 μ 1，引物(5，-AGATCCTGTGTTCTTCCTCAC ΤΑ-3，): 0.2 μ 1，Taq 酶:
0.2 μ 1，水:16.8 μ I，總體系 20 μ 1.擴(kuò)增條件為:94°C 2min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min,72°C IOmin, 16°C IOmin, 28個(gè)循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pACYC-C+D。
[0073](3) JEV基因組全長pACYC-A+B+C+D的拼接:用BamH I (前面已述)和Xho I (前面已述)酶切上述步驟中所得的pACYC-A+B和上述步驟所得pACYC-C+D，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)回收pACYC-A+B的大片段與pACYC-C+D的大片段，使用ThermoScientific NanoDrop2000 (購自Thermo公司)測定DNA的濃度,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。將pACYC-A+B的大片段作為載體，pACYC-C+D的大片段作為片段，使用T4DNA連接酶(前面已述)將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HB101(前面已述)，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定的反應(yīng)體系為:10Xbuffer:2y l,dNTP:0.4μ I,引物(5，-GTGTTTTGGGACACGCCATCC-3’): 0.2 μ 1，引物(5，-ACTAGAGCACCAAGACCCATC-3 ’):0.2 μ 1，Taq 酶:0.2 μ 1，水:16.8 μ 1，總體系 20 μ 1.擴(kuò)增條件為:94°C 2min，94°C 30s,55°C 30s, 72°C 3min,72 °C IOmin, 16°C 10min，28個(gè)循環(huán)。將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒即為拼接完成的包含有JEV全長基因組的cDNA質(zhì)粒(圖1 )，命名為 pACYC-JEV-FL.[0074]3、帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的構(gòu)建:
[0075](I)待融合的三個(gè)目的基因的特異性擴(kuò)增:
[0076]①片段“T7-5’UTR-Capsid-34”的擴(kuò)增:以pACYC-JEV-FL 為模板，使用 PrimeSTA RHS酶(購自Takara公司)擴(kuò)增含有“T7-5’UTR-Capsid-34”的序列，引物為SEQ ID N0.5，SEQID N0.6所示。使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)分別回收DNA片段,使用Thermo Sci entific NanoDrop2000(前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0077]②片段”Rluc-2A”的特異性擴(kuò)增:以含有Rluc基因的iNV-Rluc-r印licon”(來自Lo MK, Tilgner M, Shi PY.Potential high-throughput assay for screening inhibitorsof W est Nile virus replication J Virol.2003Dec; 77 (23): 12901-6.)質(zhì)粒為模板，使用PrimeS TAR HS酶(前面已述)擴(kuò)增含有“Rluc_2A”的序列，引物為SEQ ID N0.7, SEQ IDN0.8 ;其中Rluc為海腎熒光素酶序列，序列為GenBank:HV535459.1所示，2A為口蹄疫病毒FMDV的2A自切割肽序列，序列為SEQ ID N0.4所示。使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片段，使用ThermoScientific NanoDrop2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0078]③片段” Capsid-prM-E”的特異性擴(kuò)增:以pACYC-JEV-FL為模板，使用PrimeSTARHS酶(前面已述)擴(kuò)增含有”Capsid-prM-E”的序列，引物為SEQ ID N0.9, SEQ ID N 0.10。使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片段,使用Thermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)測定DNA的濃度,使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0079](2)兩步融合 PCR 法擴(kuò)增” T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM_E” 片段:
[0080]第一步融合PCR:片段 “T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc_2A” 的融合 PCR 特異性擴(kuò)增:以上述所得片段“T7-5，UTR-Capsid-34”和” Rluc-2A”為模板，使用PrimeSTAR HS酶(前面已述)擴(kuò)增含有 “T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc-2A” 的序列，引物為 SEQ ID N0.5, SEQ IDN0.8.使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片段,使用Thermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0081]第二步融合PCR:片段“T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”的融合 PCR特異性擴(kuò)增:以上述所得片段”Capsid-prM-E”和“T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc_2A”為模板，使用 PrimeSTAR HS 酶(前面已述)擴(kuò)增含有“T7-5，UTR-Capsid34-Rluc-2A-Capsid-prM_E”的序列，引物為SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.10.使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測P CR產(chǎn)物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(前面已述)分別回收DNA片段,使用Thermo ScientificNanoDrop2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0082]上述PCR擴(kuò)增所用PCR儀為Biorad公司的MyCycler Thermal cycler,所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系均為5XPS buffer:10 μ 1，dNTP:4μ 1，引物:0.5μ 1，引物:0.5μ 1，模板:0.5μ I, PrimeSTAR HS 酶:0.5μ 1，水:34μ I。擴(kuò)增條件為:98°C 30s, 98°C 10s, 55°C 10s, 68°C 3min, 68°C IOmin, 16°C IOmin, 30 個(gè)循環(huán)。
[0083](3)將熒光素酶基因Rluc插入JEV全長感染性克隆:將“T7-5’UTR-Capsid_34-Rluc-2A-Capsid-prM-E”和 JEV 全長感染性克隆 pACYC-JEV-FL.分別用 Kpn I 和 BsrG I 雙酶切。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)過T4DNA連接酶(購自美國NEB公司)將回收的酶切產(chǎn)物按照片段:載體摩爾比為6:1進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化HBlOl感受態(tài)，將PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，測序正確。至此獲得的質(zhì)粒即為帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆(圖2)，命名為pACYC-Rluc-JEV-FL.[0084]實(shí)施例2:
[0085]帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆成功拯救出與野生型病毒生長趨勢相同的病毒
[0086]1、質(zhì)粒的線性化和酚氯仿抽提:各取10 μ g質(zhì)粒pACYC-JEV-FL和質(zhì)粒pACYC-Rluc-JEV-FL,用XhoI (前面已述)酶切，37°C酶切兩小時(shí)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切完全后，向酶切產(chǎn)物中加入100 μ I飽和酚(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，振蕩混勻，17000g離心5min，吸取上層液體于新的離心管中，并向原離心管中加入100 μ I無菌水振蕩混勻，17000g離心5min ;吸取上層液體與上一步所得液體合并(總體積約200 μ I )，加入200 μ I氯仿(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)混勻，17000g離心5min ;吸取上層液體于無菌進(jìn)口離心管管中(約150~200 μ I),加入十分之一體積的pH5.2, 3mol/l醋酸鈉(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)和2.5倍體積無水乙醇(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)混勻，_20°C放置30min,17000g離心5min ;吸棄上清，加入lml70%乙醇洗滌，17000g離心5min，吸棄上清；室溫放置15min,最后加入 11 μ I 無 RNAase 的水溶解，使用 Th ermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)測定DNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0087]2、RNA的體外轉(zhuǎn)錄:各取2.5 μ g酚氯仿抽提的pACYC-JEV-FL和pACYC-Rluc-JEV線性化產(chǎn)物為模板，按照HmMESSAGE mMACHINE kit (購自美國Ambion公司)說明書的要求將其體外轉(zhuǎn)錄為RNA,使用Thermo Scientific NanoDrop2000 (前面已述)測定RNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，檢測體外所得RNA均有明顯主帶后，于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0088]3、轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞:將5 μ g體外轉(zhuǎn)錄的JEV和Rluc-JEV RNA采用電轉(zhuǎn)的方法分別轉(zhuǎn)入8X 106BHK-21細(xì)胞，分別接種4X IO5轉(zhuǎn)染了 Rluc-JEV及JEV RNA的BHK細(xì)胞于每孔放置了三個(gè)IOmmX IOmm蓋玻片的6孔板中進(jìn)行免疫突光實(shí)驗(yàn),于轉(zhuǎn)染后24、48、72h分別用5%丙酮固定液(購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)室溫固定細(xì)胞15分鐘，PBS洗三遍后，于室溫環(huán)境孵育一抗，抗體為1:250倍稀釋的針對黃病毒屬E蛋白小鼠單克隆抗體(購于美國Millipore公司)，一抗孵育I~2h，PBS沖洗10遍后，于室溫避光孵育二抗，抗體為1:125倍稀釋的偶聯(lián)德克薩斯紅(Texs-Red)羊抗鼠抗體。孵育二抗Ih后，PBS沖洗10遍，于熒光顯微鏡下使用200X放大倍數(shù)進(jìn)行觀察(圖3A)。于此同時(shí)，電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞分別接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種2 X IO5的細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后2、12、24、48、72h和96h收集孔中培養(yǎng)基(即JEV和Rluc-JEV PO代不同時(shí)間點(diǎn)的病毒液)，并于-80°C保存。其中轉(zhuǎn)染Rluc-JEVRNA的細(xì)胞，每次收集病毒完畢后分別向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ I細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物,按照試劑盒說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀(購自德國Thermo)檢測Rluc的活性(圖4A)。將凍存的不同時(shí)間點(diǎn)Rluc-JEV和JEV病毒取出，室溫凍融，使用雙層噬斑檢測Rluc-JEV及JEV的滴度和噬斑形態(tài)，方法是:在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中分別接種4X IO5個(gè)Vero細(xì)胞，24h后待細(xì) 胞覆蓋孔底80-90%時(shí)，吸棄孔中的培養(yǎng)基，接入DMEM培養(yǎng)基10倍比稀釋的轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的Rluc-JEV及J EV的病毒100μ 1，37°C吸附Ih。吸附完畢后將各個(gè)孔的病毒液吸棄，加入由含有2%F BS培養(yǎng)基的瓊脂糖上層覆蓋物，于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，加入含有中性紅的瓊脂糖覆蓋物，于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后觀察噬斑形態(tài)(圖3B)和數(shù)量(圖4A)。從圖4A中可以看到，Rluc-JEV病毒生長曲線與JEV病毒生長曲線趨勢相同，同時(shí)，Rluc信號值與病毒滴度也呈相同增長趨勢，表明Rluc信號可以反映Rluc-JE V病毒生長情況，進(jìn)而反映出JEV病毒的生長趨勢。將Rluc-JEV Rluc信號值和滴度分別取對數(shù)值后，使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行二者線性回歸分析，得出Rluc-JEV病毒滴度與Rlu c信號值呈線性相關(guān)，回歸方程為y=0.6881x+5.0966，R2=0.986 (圖4B)。
[0089]以下應(yīng)用實(shí)施例中使用的均為pACYC-Rluc-JEV-FL拯救出的完整病毒粒子Rluc-JEV，方法參見實(shí)施例2。
[0090]實(shí)施例3:
[0091]一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用，其步驟是:[0092]1、NITD008對Rluc-JEV的抑制作用:在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中接種I X 105BHK_21細(xì)胞，在37°C，5%C02培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到60%時(shí)，分別向每孔加入Rluc-J EV病毒液，感染復(fù)數(shù)MOI為0.01，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中吸附Ih后，將各個(gè)孔的病毒液用槍頭吸棄，分別加入用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基系列稀釋的NITD008 (濃度分別為0、0.11、1、3、9和27 μ Μ),于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后分別丟棄孔中的上清，并向孔中加入ImlPBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ I細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物,按照Luciferase Assay System說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀檢測Rluc的活性(圖5A)。通過對Rluc的活性檢測發(fā)現(xiàn)，隨著NITD008濃度的增加，Rluc信號值逐漸減弱，表明NITD008抑制JEV病毒生長呈現(xiàn)濃度依賴性。
[0093]2、利巴韋林對Rluc-JEV的抑制作用:在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中接種
1X 105BHK-21細(xì)胞，在37 °C，5%C02培養(yǎng)條件下，待匯合度達(dá)到60%時(shí)，分別向每孔加入Rluc-JE V病毒液，感染復(fù)數(shù)MOI為0.01，37°C，°C，5%C02培養(yǎng)箱中吸附Ih后，將各個(gè)孔的病毒液用槍頭吸棄，分別加入用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2倍系列稀釋的利巴韋林(濃度分別為0、0.25,0.5,0.25、I和2mg/ml )，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后分別丟棄孔中的上清，并向孔中加入Iml PBS后吸棄孔中PBS，并分別加入200 μ I細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞并混勻孔中的細(xì)胞裂解物，取20 μ I于白色96孔板中，并加入50 μ I的底物，按照Luciferase Assay System說明書的要求使用多功能酶標(biāo)儀檢測Rluc的活性(圖5B)。圖中結(jié)果顯不，隨著利巴韋林濃度的增加，Rluc信號值逐漸減弱,表明利巴韋林抑制JEV病毒生長也呈現(xiàn)濃度依賴性。
[0094]以上兩種藥物均是已報(bào)道的對黃病毒生長有抑制作用的藥物，通過檢測不同濃度作用下Rluc-JEV病毒的Rluc信號值,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加，Rluc信號值均呈下降趨勢，說明Rluc-JEV病毒的生長受到了抑制，這與已報(bào)道的藥物抑制野生型JEV病毒的結(jié)果相同。因此，實(shí)驗(yàn)表明:本發(fā)明所構(gòu)建的帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV報(bào)告病毒能夠用于抗JEV的藥物篩選，且靈敏度更強(qiáng)，檢測效率更高。
[0095]實(shí)施例4:
[0096]一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆在動(dòng)物體內(nèi)成像中的應(yīng)用，其步驟是:
[0097]取兩只三周齡BALB/c小鼠，每只均經(jīng)腹腔注射I X IO7PFU Rluc-JEV病毒，分別在接種病毒后的24h、48h和72h以后，每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔腸素(Coelenterazine)(購于Promega公司),注射腔腸素10分鐘后,將小鼠經(jīng)小動(dòng)物麻醉機(jī)(購于美國Matrx公司)麻醉后放入成像暗箱,使用Xenogen IVIS8 50成像系統(tǒng)(購于美國精諾真公司Xenogen Corp)進(jìn)行檢測成像并攝取影像(圖6)。從成像圖像中顯示，病毒感染后第一天，即可在小鼠的腦部和腹腔檢測到Rluc陽性信號，說明病毒在小鼠體內(nèi)正常擴(kuò)增；到病毒感染后第三天，小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性Rluc信號，說明病毒在小鼠體內(nèi)大量擴(kuò)增并持續(xù)感染周圍組織和細(xì)胞；到病毒感染后第五天，小鼠體內(nèi)仍可觀察到陽性Rluc信號，與第三天相比，信號強(qiáng)度及范圍有所下降，提示隨著時(shí)間延長，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，將病毒中和。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明所構(gòu)建的Rluc-JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV病毒可實(shí)現(xiàn)病毒在小鼠活體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，可觀測到病毒在動(dòng)物體內(nèi)的發(fā)展進(jìn)程，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0098]實(shí)施例5:[0099]一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆在乙型腦炎疫苗評價(jià)中的應(yīng)用，其步驟是:[0100]取兩只三周齡BALB/c小鼠，分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)腹腔注射
0.03ml乙型腦炎減毒疫苗JEV-SA14-14-2 (購于武漢生物制品研究所)，對照組腹腔注射0.03ml PBS。三周后，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠均經(jīng)腹腔注射I X IO7PFU Rluc-JEV病毒，分別于注射Rluc-JEV病毒后3天和5天,每只小鼠腹腔注射1.5mg Rluc的底物腔腸素(前面已述)，注射腔腸素10分鐘后，將小鼠經(jīng)小動(dòng)物麻醉機(jī)麻醉后放入成像暗箱放入成像暗箱，使用Xenogen IVISb 50成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測成像并攝取影像(圖7A)，應(yīng)用系統(tǒng)分析軟件ROI進(jìn)
行分析，對實(shí)驗(yàn)組小鼠和對照組小鼠體內(nèi)腹腔(圖7B)及腦部(圖7C)的熒光進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，經(jīng)過JEV-SA14-14-2疫苗株免疫的實(shí)驗(yàn)組小鼠可以抵抗Rluc-JEV病毒的感染，活體成像結(jié)果為陰性背景，而在對照組小鼠體內(nèi)，Rluc-JEV則可正常擴(kuò)增，呈現(xiàn)出強(qiáng)陽性信號。ROI軟件分析顯示，在腦內(nèi)和腹腔，對照組小鼠體內(nèi)Rluc信號值可達(dá)到IO7至108，而經(jīng)過疫苗株免疫的實(shí)驗(yàn)組小鼠，腦內(nèi)和腹腔的Rluc信號則為陰性。證明JEV-SA14-14-2疫苗株的免疫，使小鼠獲得了抵抗JEV病毒感染的能力。因此，實(shí)驗(yàn)表明:本發(fā)明所構(gòu)建的帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆所拯救出的Rluc-JEV報(bào)告病毒可觀測到病毒在動(dòng)物體內(nèi)的發(fā)展進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)直觀觀察病毒在小鼠體內(nèi)經(jīng)過疫苗免疫所產(chǎn)生的反應(yīng)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物水平的乙型腦炎疫苗評價(jià)。
【權(quán)利要求】
1.一種帶有熒光素酶基因的JEV感染性克隆pACYC-Rluc-JEV-FL，其序列為SEQ IDN0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述感染性克隆的構(gòu)建方法，其步驟如下: 1)JEV-SA14病毒株基因組序列分段合成: 構(gòu)建帶有JEV全長基因組的cDNA感染性克隆:選擇JEV-SA14病毒株序列，GenBank N0.U14163.1;分成四個(gè)片段進(jìn)行基因合成，這四個(gè)片段分別命名為片段A，片段B，片段C，和片段D，其中片段A為T7+基因組I~3450 nt序列，片段B為基因組3446-5581 nt序列，片段C為基因組5576-9136 nt序列，片段D為基因組9121-10976 nt+ HDVR序列；T7啟動(dòng)子序列如SEQ ID N0.2所示，HDVR序列為SEQ ID N0.3所示，四個(gè)片段分別用Psi I和BamH I插入低拷貝質(zhì)粒pACYC177載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)HBlO ;質(zhì)粒均經(jīng)過DNA測序鑒定為正確序列，分別命名為pACYC-A，pACYC-B, pACYC_C和pACYC_D ; 2)含有病毒基因組的JEVcDNA感染性克隆的構(gòu)建: (1)JEV基因組片段A+B的拼接:用BspE I和BamH I酶切上述步驟I)中所得的PACYC-A和pACYC-B，回收pACYC_A的大片段與pACYC_B的大片段；將pACYC-A的大片段作為載體，pACYC-B的大片段作為片段，使用T4 DNA連接酶將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HB101，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定；將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pACYC- A+B ； (2)JEV基因組片段C+D的拼接:用XbaI和Xho I酶切上述步驟I)中所得的pACYC_C和pACYC-D，回收pACYC-C的大片段與pACYC_D的大片段；將pACYC_C的大片段作為載體，PACYC-D的大片段作為片段，使用T4 DNA連接酶將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HBlOl，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定；將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pACYC-C+D ； (3)JEV基因組全長pACYC- A+B+C+D的拼接:用BamH I和Xho I酶切上述步驟中所得的pACYC-A+B和上述步驟所得pACYC-C+D，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收pACYC-A+B的大片段與pACYC-C+D的大片段；將pACYC-A+B的大片段作為載體，pACYC-C+D的大片段作為片段，使用T4 DNA連接酶將載體與片段連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)HBlOl，挑取菌落并進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的質(zhì)粒即為拼接完成的含有JEV全長基因組的cDNA質(zhì)粒，命名為pACYC-JEV-FL ； 3)帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆的構(gòu)建: (1)待融合的三個(gè)目的基因的特異性擴(kuò)增: ①片段T7-5’UTR-Capsid-34 的擴(kuò)增:以 pACYC-JEV-FL 為模板，使用 PrimeSTAR HS 酶擴(kuò)增含有T7-5’UTR-Capsid-34的序列，引物為SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6所示，回收DNA片段； ②片段R1UC-2A的特異性擴(kuò)增:以含有1?111(3基因的1附-1?111(3-1'印1化011質(zhì)粒為模板，使用PrimeSTAR HS酶擴(kuò)增含有Rluc_2A的序列，引物為SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8，回收DNA片段； ③片段Capsid-prM-E的特異性擴(kuò)增:以pACYC-JEV-FL為模板，使用PrimeSTARHS酶擴(kuò)增含有Capsid-prM-E的序列，引物為SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10，回收DNA片段； (2)兩步融合PCR 法擴(kuò)增 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A- Capsid-prM-E 片段:第一步融合PCR:片段T7-5，UTR-Capsid-34-Rluc-2A的融合PCR特異性擴(kuò)增:以上述所得片段T7-5’ UTR-Capsid-34和Rluc_2A為模板，使用PrimeSTAR HS酶擴(kuò)增含有T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A 的序列，引物為 SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.8，回收 DNA 片段； 第二步融合 PCR:片段 T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E 的融合 PCR 特異性擴(kuò)增:以上述所得片段Capsid-prM-E和T7-5’ UTR-Capsid-34-Rluc_2A為模板，使用PrimeSTAR HS 酶擴(kuò)增含有 T7-5’ UTR-Capsid34-Rluc-2A- Capsid-prM-E 的序列，引物為SEQ ID N0.5，SEQ ID N0.10，回收 DNA 片段； (3)將熒光素酶基因Rluc插入JEV全長感染性克隆:將T7-5’UTR-Capsid-34-Rluc-2A-Capsid-prM-E和JEV全長感染性克隆pACYC-JEV-FL分別用Kpn I和BsrG I雙酶切，使回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)過T4 DNA連接酶將回收的酶切產(chǎn)物按照片段:載體摩爾比為6:1進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化HBlOl感受態(tài)，將PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，測序正確，獲得的質(zhì)粒即為帶有熒光素酶基因的JEV病毒感染性克隆。
3.權(quán)利要求1所述的感染性克隆在活體動(dòng)物成像中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的感染性克隆在抗病毒藥物篩選的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述 的感染性克隆在乙型腦炎疫苗評價(jià)的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/64GK103497972SQ201310441707
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】張波, 李曉丹, 秦成峰, 李曉峰, 袁志明, 鄧成林, 單超, 葉寒青 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所