適配子滲濾式生物芯片及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適配子滲濾式生物芯片及制備方法。本發(fā)明在芯片外殼上設(shè)置窗口，在窗口下的芯片外殼內(nèi)從上至下設(shè)置硝酸纖維素膜、反滲層、吸水層、防漏層；硝酸纖維素膜的表面固定有針對靶物質(zhì)的適配子分子，適配子分子是RNA或者DNA或者是經(jīng)過修飾的RNA或DNA。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的檢測范圍受到限制、靈敏度不高、特異性不強、易變質(zhì)、工藝復(fù)雜、反應(yīng)時間長等缺陷。本發(fā)明通過SELEX篩選，從體外大量的單鏈寡核苷酸文庫中篩選出與目標分子有特異性結(jié)合的DNA分子，再經(jīng)過大量擴增得到適配子，且滲濾式生物芯片讓待檢測的樣本快速通過硝酸纖維膜的微孔，其目標分子可迅速和膜上的適配子結(jié)合，大大縮短反應(yīng)時間，而且敏感性和特異性更高。
【專利說明】適配子滲濾式生物芯片及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床檢測以及科學(xué)研究檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種適配子滲濾式生物芯片及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]適配子是上個世紀九十年代發(fā)展起來的一種新技術(shù)，是一種人工合成的單鏈DNA或者RNA，可以和特定的物質(zhì)相結(jié)合。通常，適配子是通過多次的SELEX篩選技術(shù)篩選出，適合和各種分子進行特異性結(jié)合，例如小分子，蛋白質(zhì)，核酸，甚至細胞，組織和微生物等，在生物研究和體外診斷以及治療上有廣闊的應(yīng)用前景。相比抗體而言，適配子具有非常多的優(yōu)點，例如適配子可以完全人工合成，成本低，另外適配子的篩選過程也比單克隆抗體制備快。核酸適配子的穩(wěn)定性非常好，可以在常溫條件下運輸和保存很長時間，即使變性后也容易復(fù)性。適配子結(jié)合目標分子特異性非常高，可以提高檢測結(jié)果的準確性。
[0003]上個世紀九十年代另一個突破性的發(fā)明是生物芯片。生物芯片是把生物分子固定在固相載體上，利用分子之間相互作用的原理，同時檢測成千上萬種生物分子，例如核酸，蛋白，糖，多肽等等。生物芯片的固相載體一般是玻璃片、硅片、凝膠、尼龍膜等。固定在載體上的分子可以是DNA，蛋白質(zhì)，多肽，抗原等。待檢測的物質(zhì)和生物芯片上的分子結(jié)合后，再通過標記，轉(zhuǎn)變成為信號由生物芯片識別儀進行分析，就可以得到大量數(shù)據(jù)。生物芯片作為生命科學(xué)研究和臨床檢測的有力工具，可以一次性得到大量的數(shù)據(jù)，而且準確性比以往的檢測方法更高，操作更加簡單，自動化程度更高。
[0004]在本發(fā)明之前，傳統(tǒng)生物芯片包括基因芯片和蛋白芯片，也存在著明顯的缺陷。基因芯片是將DNA探針固定在固相載體上，從而檢測樣品中的DNA含量。這種設(shè)計有幾個缺點:1.被檢測物質(zhì)只能是核酸，限制了待檢測物質(zhì)的范圍。2.由于探針一般為20個堿基左右，所以不能很好地和待檢測的物質(zhì)結(jié)合，因而靈敏度不高。3.特異性不強:DNA雜交的時候可能存在堿基錯配的現(xiàn)象，因此基因芯片對于序列相近的DNA特異性不強。蛋白芯片是將抗原或抗體固定在載體上，這類芯片業(yè)也存在著問題:1.保存條件嚴格:由于固定在載體上的是蛋白質(zhì)，因此容易變質(zhì)。2.敏感性和特異性也容易受到抗原或者抗體純度的影響。
3.制備抗原或者抗體的工藝復(fù)雜，使得蛋白芯片應(yīng)用受到限制。另外，傳統(tǒng)的生物芯片需要待檢測物質(zhì)充分和載體上的探針結(jié)合，因而往往需要較長時間進行反應(yīng)，難以滿足臨床上對樣本大量檢測的需要。
[0005]由于以上原因，使得傳統(tǒng)生物芯片很難有進一步的發(fā)展。因此，為解決上述傳統(tǒng)生物芯片的問題，新型生物芯片的研究顯得十分迫切。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的就是克服上述缺陷，研制適配子滲濾式生物芯片。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]適配子滲濾式生物芯片，包括芯片外殼，其主要技術(shù)特征在于在芯片外殼上設(shè)置窗口，在窗口下的芯片外殼內(nèi)從上至下設(shè)置硝酸纖維素膜、反滲層、吸水層、防漏層；硝酸纖維素膜的表面固定有針對靶物質(zhì)的適配子分子，適配子分子是RNA或者DNA或者是經(jīng)過修飾的RNA或DNA。
[0009]本發(fā)明的另一技術(shù)方案是:
[0010]適配子滲濾式生物芯片的制備方法，其主要技術(shù)特征在于將適配子分子固定于硝酸纖維素膜上；適配子通過疏水性作用與硝酸纖維素膜進行物理性吸附，或者是標記生物素，透過分子間的疏水作用力、氫鍵以及靜電作用力固定于硝酸纖維素膜，得適配子滲濾式生物芯片。
[0011]上述所稱適配子分子是通過SELEX (Systematic Evolution of Ligands byExponential enrichment,是一種用來制造與目標分子具有高度親和力之核酸分子的演化篩選技術(shù))篩選出的特異性分子，經(jīng)過擴增制備后，固定于硝酸纖維素膜上。
[0012]所述的適配子生物芯片在使用時，先將待檢測物質(zhì)加在硝酸纖維素膜上，再加入顯色試劑和其他相應(yīng)試劑，待反應(yīng)后再將芯片放入配套的生物芯片識別儀中讀取反應(yīng)結(jié)果和數(shù)據(jù)，并進行分析從而得到檢測結(jié)果。
[0013]所述的適配子檢測的目標可以是核酸，蛋白，脂類，多糖，重金屬離子，病毒，細胞混合物，有機小分子。
[0014]所述的適配子生物芯片，顯色試劑在適配子滲濾式生物芯片檢測反應(yīng)中用于被檢測物之后，用來顯示免疫反應(yīng)是否進行。顯色試劑可以是標記的多抗，單抗，也可以是適配子。標記的方法可以是膠體金，酶，或者是熒光物質(zhì)。
[0015]適配子生物芯片的檢測方法，待檢樣本與生物芯片及配套試劑反應(yīng)后，生物芯片上的生物信息被識別儀識別、讀取，然后進行檢測，其檢測步驟包括儀器校正、套圈、生物芯片系數(shù)校正。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:
[0017]適配子是通過SELEX篩選，從體外大量的單鏈寡核苷酸文庫中篩選出與目標分子有特異性結(jié)合的DNA分子，再經(jīng)過大量擴增得到適配子。適配子與目標分子具有高親和力，甚至高于抗體。適配子制備不需要動物，制備過程簡單，自動化程度高，價格低廉，穩(wěn)定性好，沒有毒性或者毒性很低。適配子在應(yīng)用上有著抗體所沒有的優(yōu)勢:1.親和力和特異性高:通常適配子能夠區(qū)分甲基或者羥基基團，這是一般抗體不能做到的。2.目標分子范圍廣泛:理論上說任何一種分子都能夠篩選出相應(yīng)的適配子。而抗體對一些小分子則無能為力。3.體外篩選方法成熟:目前基于SELEX的方法不斷完善，篩選出適配子的周期越來越短。4.制備的適配子純度高，批間差小，易于大規(guī)模生產(chǎn)。5.方便修飾:由于適配子基于核酸，其修飾方法已經(jīng)非常成熟，并且修飾后不會破壞活性。
[0018]與傳統(tǒng)生物芯片不同，滲濾式生物芯片可以讓待檢測的樣本快速通過硝酸纖維膜的微孔，樣品中的目標分子可以迅速和膜上的適配子結(jié)合。傳統(tǒng)式的生物芯片由于只能靠長時間的溫育使得適配子和目標分子充分結(jié)合。因此滲濾式的生物芯片可以大大縮短反應(yīng)時間，而且敏感性和特異性更高。
[0019]由于識別儀軟件的自動套圈，圖像合成，系數(shù)校正和儀器校正等步驟，可以實現(xiàn)芯片反應(yīng)結(jié)果的準確分析，比傳統(tǒng)生物芯片方法更具有準確性?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0020]圖1—本發(fā)明實施例所述的適配子生物芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021]圖中所標標號與部件名稱對應(yīng)關(guān)系如下:
[0022]芯片外殼1、硝酸纖維素膜2、反滲層3、吸水層4、防漏層5。
【具體實施方式】
[0023]以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護范圍不限于此:
[0024]實施例1:
[0025]適配子滲濾式生物芯片，如圖1所示，芯片外殼I窗口下且芯片外殼I內(nèi)由上至下依次分別為硝酸纖維素膜(膜上固定有適配子分子)2、反滲層3、吸水層4、防漏層5。相互之間依次自然壓縮而成，無需任何膠黏劑。芯片外殼I上有一個窗口，窗口下方由有背襯的硝酸纖維素膜2緊密連接，防止加入窗口的液滴由縫隙處滲漏出；硝酸纖維素膜2下方緊密結(jié)合反滲層3，阻止液體從芯片內(nèi)腔反滲回硝酸纖維素膜2表面；反滲層3下面結(jié)合吸水層4，可以吸收多余液體；吸水層4下面結(jié)合防漏層5，防止液體漏出芯片，污染環(huán)境。
[0026]將待檢測物質(zhì)加在膜上，再加入顯色試劑和其他相應(yīng)試劑，待反應(yīng)后再將芯片放入配套的生物芯片識別儀中讀取反應(yīng)結(jié)果和數(shù)據(jù)，并進行分析從而得到檢測結(jié)果。
[0027]分析程序如下:
[0028](I)自動套圈:
[0029]軟件劃定拍攝的生物芯片盒邊界，確定生物芯片的有效區(qū)域。利用生物芯片上的物理信息對有效區(qū)域進行網(wǎng)格劃分，確定每個網(wǎng)格內(nèi)有且只有一個生物芯片點。在每個網(wǎng)格內(nèi)進行搜索，確定生物芯片點的實際邊界，并進行大范圍內(nèi)的動態(tài)差額算法搜索，構(gòu)造廣泛邊界點集合，對此集合進行篩選，確定生物芯片點。對已經(jīng)確定的生物芯片點位置進行校正，含點間距、陣間距、平行性。推算其余為確定的生物芯片點位置。得到自動套圈結(jié)果。在自動套圈失敗情況下，軟件可以轉(zhuǎn)為手工套圈進行校正。
[0030](2)圖像合成:
[0031]軟件對生物芯片連續(xù)拍攝I?10次，將上述圖像合成，獲取平均值。
[0032](3)芯片系數(shù)校正:
[0033]如見自動讀取生物芯片的芯片系數(shù)，并將芯片系數(shù)與生物芯片出廠時刻錄在光盤上的芯片系數(shù)進行校正，校正的范圍在允許的范圍內(nèi)。
[0034](4)儀器自動校正:
[0035]對生物芯片上的信息經(jīng)過上述(I)、(2)、(3)步驟，將上述步驟的結(jié)果與刻錄在光盤上的標準生物芯片的灰度數(shù)值、芯片系數(shù)進行對比，校正到標準生物芯片的灰度數(shù)值、芯片系數(shù)。
[0036]所述芯片的硝酸纖維素膜2上點有三種適配子分別為:
[0037]幽門螺旋桿菌尿素酶適配子、幽門螺旋桿菌細胞毒素相關(guān)蛋白適配子、幽門螺旋桿菌空泡毒素蛋白適配子。
[0038]所述芯片的制備方法為:
[0039]采用SELEX技術(shù)，用純化的尿素酶，細胞毒素相關(guān)蛋白，空泡毒素蛋白作為目標物質(zhì)篩選DNA適配子，再通過體外擴增技術(shù)制備純化的DNA適配子。[0040]利用生物素-親和素標記適配子:
[0041]取0嫩0.5 48加入5(1 TE(pH8.0)緩沖液中，再加入5yg生物素-補骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min,距離5cm,加等體積TE,移入用TE平衡的SephadexG-50柱(高1.0cm)，離心法過柱，收集液體即為Bio-DNA探針。
[0042]TE:10mM Tris-HCl (pH8.0), ImM EDTA (pH8.0):1M Tris-HCl (ρΗ8.0) Iml，0.5MEDTA (pH8.0)0.2ml，加 ddH20 至 100ml。121 °C高壓濕熱滅菌 20min，4°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0043](I)IM Tris Cl (Tris (三羥甲基)氨基甲烷):800ml H2O 中溶解 121gTris 堿，用濃鹽酸調(diào)PH值至8.0,混勻后加水到IL ；
[0044](2)0.5M EDTA(乙二胺四乙酸):700ml H2O 中溶解 186.1g Na22EDTA..2Η20，用IOM NaOH 調(diào) ρΗ8.0 (需約 50ml)，補 H2O 到 1L。
[0045]Bio-DNA探針通過生物芯片噴墨點樣機噴點在硝酸纖維素膜2上，再將硝酸纖維素膜2和反滲層3、吸水層4、防漏層5材料按照次序組裝在生物芯片外殼中，即得到適配子滲濾式生物芯片。
[0046]用所述的生物芯片可以用來檢測幽門螺旋桿菌的抗原尿素酶，細胞毒素相關(guān)蛋白和空泡毒素蛋白分子。將病人的標本加入芯片的反應(yīng)窗口，待液體滲入芯片后，再加入顯色試劑和其他相應(yīng)試劑。顯色后放入生物芯片識別儀讀取反應(yīng)的信號，分析后即可得知抗原濃度，并判斷病人是否感染幽門螺旋桿菌。
[0047]實施例2:
[0048]適配子滲濾式生物芯片的結(jié)構(gòu)同實施例1所示。
[0049]所述的生物芯片的硝酸纖維素膜2是有濾紙被襯，膜上點有可以捕獲結(jié)核分枝桿菌抗原的三種適配子分別為:
[0050]脂阿拉伯甘露糖(LAM)適配子、結(jié)核分枝桿菌CFP-10蛋白適配子、結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白適配子。
[0051]將三種適配子通過生物芯片噴墨點樣機噴點在硝酸纖維素膜上，再將反滲層，吸水層，防漏層，和芯片外殼組裝即可得到用于檢測結(jié)核分枝桿菌抗原的適配子滲濾式生物芯片。檢測時將被檢測樣本(如痰液或者血清)滴加在生物芯片的反應(yīng)窗口內(nèi)，待樣品滲濾完全后，滴加相應(yīng)的洗滌液和顯色試劑，再用生物芯片識別儀讀取芯片反應(yīng)結(jié)果并進行分析。
【權(quán)利要求】
1.適配子滲濾式生物芯片，包括芯片外殼，其特征在于在芯片外殼上設(shè)置窗口，在窗口下的芯片外殼內(nèi)從上至下依次設(shè)置硝酸纖維素膜、反滲層、吸水層、防漏層；硝酸纖維素膜的表面固定有針對靶物質(zhì)的適配子分子，適配子分子是RNA或者DNA或者是經(jīng)過修飾的RNA或 DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的適配子滲濾式生物芯片，其特征在于硝酸纖維素膜包括有背襯的硝酸纖維素膜或無任何背襯的硝酸纖維素膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的適配子滲濾式生物芯片，其特征在于反滲層為濾紙或無紡布。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適配子滲濾式生物芯片的制備方法，其特征在于將適配子分子固定于硝酸纖維素膜上；適配子通過疏水性作用與硝酸纖維素膜進行物理性吸附，或者是標記生物素，透過分子間的疏水作用力、氫鍵以及靜電作用力固定于硝酸纖維素膜，得適配子滲濾式生物芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的適配子滲濾式生物芯片的制備方法，其特征在于所述標記生物素的制備方法:取DNA0.5 μ g加入50 μ I TE緩沖液中，再加入5 μ g生物素-補骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距離5cm，加等體積TE，移入用TE平衡的Sephadex G-50柱，離心法過柱，收集液體即為Bio-DNA探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的適配子滲濾式生物芯片的制備方法，其特征在于需搭配顯色試劑，顯色試劑是標記的物質(zhì)，即多抗或單抗或適配子。
7.根據(jù)權(quán)利要求書6所述的適配子滲濾式生物芯片的制備方法，其特征在于標記的物質(zhì)是膠體金、酶、或者是熒光物質(zhì)。
【文檔編號】G01N33/544GK103439493SQ201310346599
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月8日
【發(fā)明者】王臺虎, 邱一帆, 彭紅 申請人:南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司