專利名稱：一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體及制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組抗體，特別涉及一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體及制備方法及用途。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus, SA)是一種人畜共患病的重要致病菌，是國內(nèi)外最常見的細(xì)菌性食物中毒病原之一。該菌廣泛分布于自然界中，包括空氣、水、塵埃及人和動(dòng)物的排泄物中，尤其食品極易受污染，其引起的食物中毒臨床表現(xiàn)主要以惡心、嘔吐和腹痛為主，少數(shù)病人有腹瀉、頭痛、頭暈、發(fā)熱、脫水等癥狀。迄今，世界諸多國家都曾相繼報(bào)道金黃色葡萄球菌的暴發(fā)流行，不但嚴(yán)重危害人類健康，且直接間接經(jīng)濟(jì)損失巨大。金黃色葡萄球菌的強(qiáng)致病性主要取決于耐熱毒素和相關(guān)酶類物質(zhì)的產(chǎn)生能力，其中葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)作用至關(guān)重要。葡萄球菌腸毒素為一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的細(xì)胞外毒素，分子量低(22-24KDa)，易溶于水和鹽溶液，不受胰蛋白酶影響，可耐受100°C煮沸30min而不被破壞。自從1959年葡萄球菌腸毒素被證實(shí)以來，已獲得腸毒素類型共21種，根據(jù)血清學(xué)特征分類，包括早為人類發(fā)現(xiàn)和熟知的五種腸毒素SEA, SEB, SEC (C型又可分為C1、C2和C3三亞型)，SED, SEE和毒性休克綜合癥毒素I (Toxic shock syndrome toxin-1, TSST-1,既SEF),以及近幾年相繼發(fā)現(xiàn)的 SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SE0, SEP, SEQ, SER, SET, SEU 等多種新型腸毒素。研究表明，并非所有的腸毒素都能在食物中毒中起作用，其中以SEA和SED最常見，并以SEA毒力最強(qiáng)，攝入I y g即能引起中毒。雖然已從基因水平對傳統(tǒng)及新型腸毒素加以區(qū)分，但關(guān)于其毒素蛋白及功能的研究甚少，尚無借鑒資料，因此廣泛獲得不同動(dòng)物及動(dòng)物性食品中葡萄球菌株，提純天然腸毒素蛋白，可為研究葡萄球菌腸毒素檢測方法及其功能活性奠定基礎(chǔ)，對豐富其認(rèn)識(shí)亦有重要意義。目前，葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致食物中毒機(jī)制有待于進(jìn)一步證實(shí)，從免疫機(jī)制研究，可能與其介導(dǎo)大量細(xì)胞因子釋放而引起多器官損害有關(guān)。與此同時(shí)，作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的超抗原，其獨(dú)特高效的誘導(dǎo)機(jī)體免疫機(jī)制依舊倍受關(guān)注。新生物構(gòu)建技術(shù)與其固有生物特性 的結(jié)合，葡萄球菌腸毒素研究及應(yīng)用前景將更為廣闊?，F(xiàn)階段，對于葡萄球菌腸毒素的檢測、預(yù)防、治療的方法和手段多基于免疫原理，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，抗體技術(shù)也逐步由細(xì)胞工程抗體(單克隆抗體)向基因工程抗體演替。基因工程抗體，又被稱為第三代抗體，即應(yīng)用基因工程技術(shù)將抗體基因重組并克隆到表達(dá)載體上，在宿主中表達(dá)并折疊成有功能的抗體分子?；蚬こ炭贵w具有分子小、免疫原性低、可塑性強(qiáng)及成本低等優(yōu)點(diǎn)。此技術(shù)的基本原理是，首先從雜交瘤或免疫脾細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，經(jīng)PCR分別擴(kuò)增出抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)基因，按特定方式連接克隆到表達(dá)載體后，表達(dá)、折疊成功能抗體分子，篩選出高表達(dá)的細(xì)胞株，再用親和層析等手段純化抗體片段?；蚬こ炭贵w技術(shù)的著眼點(diǎn)在于盡量減少鼠源成分，保留原有抗體的親和力和特異性。該技術(shù)既可以對完整抗體，又可以對抗體片段進(jìn)行改造，且不受倫理和技術(shù)等因素的制約，發(fā)展迅速。
單鏈抗體(Single chain Fv segment, scFv)是基因工程抗體技術(shù)重要應(yīng)用產(chǎn)物，即將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因用寡聚核甘酸連接，經(jīng)表達(dá)、折疊后形成只由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的新型的小分子抗體，大小僅為完整IgG的1/6，同時(shí)抗原結(jié)合位點(diǎn)沒有發(fā)生變化，即保持完整的特異性。該抗體缺失Fe片段，減少了與FcR陽性細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性，最大限度地降低鼠源性蛋白的同時(shí)，降低了免疫變態(tài)反應(yīng)的可能性。另外，其分子量小，有利于穿透腫瘤組織，并避免了傳統(tǒng)制備方法中細(xì)胞雜交的過程，減少工作量，提高制備成功率。近年來已構(gòu)建了多種類的表達(dá)載體，使單鏈抗體在真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、噬菌體等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其表達(dá)量、蛋白折疊及糖基化各具特點(diǎn)。通過抗體庫展示技術(shù)，體外表達(dá)重組抗體已顯示出廣泛的臨床應(yīng)用前景，特別是寄生蟲抗原表位、自身免疫疾病、基因治療、腫瘤印象分析與治療等方面?；蚬こ讨貥?gòu)抗體技術(shù)日趨成熟，但將其應(yīng)用于葡萄球菌腸毒素抗體的研究，國內(nèi)外罕有報(bào)道，且研究對象僅局限于SEB、SEC等少數(shù)傳統(tǒng)腸毒素。綜述其基本路線為:查找相關(guān)IgG抗體的基因序列，分析抗體基因的結(jié)構(gòu)及完整性，利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因序列，再通過LinkeH多采用(Gly4Ser)3)將二者連接，克隆到表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入表達(dá)系統(tǒng)。2009年，Kalinina等建立抗SECl基因重構(gòu)抗體原核表達(dá)體系，但受到表達(dá)系統(tǒng)蛋白修飾功能缺乏的制約，其蛋白活性表現(xiàn)受阻，該抗體與SEA、SEB、SED、SEE、SEG和SEI均有不同程度交叉反應(yīng)，特異結(jié)合能力有待提高；2010年，Pawan等通過PCANTAB5E載體系統(tǒng)制備出特異性強(qiáng)和親和力高的抗SEB單鏈抗體，但研究發(fā)現(xiàn)該表達(dá)系統(tǒng)隨時(shí)間推移分泌能力逐漸消失，穩(wěn)定性缺陷突顯。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中葡萄球菌腸毒素檢測手段上存在的缺陷，提供一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的用途。本發(fā)明的技術(shù) 方案概述如下:一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體，是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的制備方法，包括如下步驟:(I)制備葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2 ；(2)采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2總mRNA，以oligo(dT) 18為引物,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(3)在相對保守的framel區(qū)和frame4區(qū)，設(shè)計(jì)由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2表達(dá)的單抗的輕鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示的上、下游簡并引物，以及重鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示的上、下游簡并引物；以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因，分別克隆至pUC-Tsimple載體，經(jīng)測序及MGT/V-QUEST、BLAST分析，確認(rèn)所獲序列符合鼠源抗體可變區(qū)經(jīng)典結(jié)構(gòu)，均為功能性V (D) J重排模式，其中，輕鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.2所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.3所示；重鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.4所示，其編碼的多肽為SEQ IDN0.5所示；(4)結(jié)合二硫鍵穩(wěn)定的重構(gòu)抗體突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)輕鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列為模板，通過PCR擴(kuò)增，使輕鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Sma I和Aba I酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)重鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ ID N0.4所示序列為模板，通過PCR擴(kuò)增，使重鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位點(diǎn)，同時(shí)在輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列的N端引A Kozak 序列；(5)經(jīng)酶切、連接，將步驟(4)獲得的修飾的重鏈可變區(qū)基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)，獲得pcDNA3.1-Vh過渡載體；另以pIRESneo質(zhì)粒為模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸為上、下游引物，通過PCR擴(kuò)增獲得ivs-1RES序列；同時(shí)以步驟(4)獲得的修飾的輕鏈可變區(qū)基因序列和ivs-1RES序列為模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸為上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸為下游引物，采用兩步法重疊PCR方法，擴(kuò)增獲得帶有后續(xù)重組操作BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)的ivs-1RES-'融合基因片斷，經(jīng)酶切、連接，插入所述pcDNA3.1-VhS渡載體，構(gòu)建真核單啟動(dòng)子共表達(dá)重組質(zhì)粒p2C2HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL-3' 融合序列如 SEQ ID N0.6 所示，p2C2HIL0 如 SEQ ID N0.7 所示；(6)通過Lipo2000脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21細(xì)胞系，經(jīng)PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)分泌細(xì)胞系。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體在葡萄球菌腸毒素檢測中的應(yīng)用。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體在細(xì)胞間接免疫熒光檢測中的應(yīng)用。一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體在流式細(xì)胞術(shù)檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建葡萄球菌腸`毒素單抗輕、重鏈基因真核共表達(dá)載體，獲得高效表達(dá)穩(wěn)定分泌哺乳動(dòng)物細(xì)胞系及特異性高、親和力強(qiáng)的基因重構(gòu)抗體。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體可以對葡萄球菌腸毒素進(jìn)行檢測。特別是可以在細(xì)胞間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明中所涉及的葡萄球菌腸毒素為天然的葡萄球菌腸毒素或者通過重組表達(dá)獲得的腸毒素，該腸毒素優(yōu)選為葡萄球菌腸毒素A、葡萄球菌腸毒素G、葡萄球菌腸毒素K、葡萄球菌腸毒素O、葡萄球菌腸毒素Q、葡萄球菌腸毒素U型中的一種或多種。
圖1:葡萄球菌腸毒素單抗可變區(qū)基因克隆的電泳圖片；圖中A為輕鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增電泳圖譜，M為DNAMarker，1_6為同時(shí)制備的雜交瘤細(xì)胞267、202、765、5(:12、442、1卩10輕鏈可變區(qū)基因，7為陰性對照，8為空白對照。B為重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增電泳圖譜，M為DNAMarker, 1-6為同時(shí)制備的雜交瘤細(xì)胞2G7、2C2、7G5、5C12、4A2、IFlO重鏈可變區(qū)基因片段，
7.陰性對照，8.空白對照。圖2:細(xì)胞間接免疫熒光(IFA)結(jié)果圖；圖中a-g為SEA、SEA-his、SEG-his、SEK-his、SEO-his、SEQ-his、SEU-his 處理組，h 為陰性對照細(xì)胞系。圖3:流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果圖；圖中A為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系識(shí)別天然及重組抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系識(shí)別不同抗原能力比較。
圖4:ELISA應(yīng)用結(jié)果圖。
圖5:重疊PCR反應(yīng)程序。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例11.葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2的制備以SEK-GST融合蛋白為免疫抗原，免疫6周齡Balb/c小鼠4次，2周/次:初次免疫采用加入等量弗氏完全佐劑方法頸背部多點(diǎn)皮下注射，免疫抗原劑量為IOOiig/只；二次免疫采用加入等量弗氏不完全佐劑方法頸背部多點(diǎn)皮下注射，免疫抗原劑量為IOOil g/只；第三次及終次免疫不加佐劑，采用尾靜脈注射，免疫抗原劑量為50 yg/只。處死已結(jié)束免疫的Balb/c小鼠，無菌取脾，制備免疫脾臟細(xì)胞懸浮液備用。通過PEG法體外融合免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞，步驟如下:分別吸取并混勻IX IO8個(gè)免疫脾細(xì)胞和5 X IO7個(gè)SP2/0細(xì)胞，1000r/min離心lOmin，棄上清；緩緩加入lmL37°C預(yù)溫的PEG4000融合劑，作用90s后使用DMEM液終止反應(yīng)，800r/min離心lOmin，棄上清；加入適量HAT選擇培養(yǎng)基，以1000個(gè)cell/孔鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每3天更換培養(yǎng)液，持續(xù)篩選7d ;陽性細(xì)胞通過有限稀釋法單克隆后，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，制備得到葡萄球菌暢毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2。2.單抗雜交瘤輕鏈重鏈可變區(qū)基因克隆、測序分析及表達(dá)載體的構(gòu)建(I)選取穩(wěn)定分泌抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞2C2株，采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2的總mRNA，以oligo (dT) 18為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 (2)分別在抗體輕、重鏈可變區(qū)相對保守的framel區(qū)和frame4區(qū)，設(shè)計(jì)由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2表達(dá)的單抗的輕鏈可變區(qū)基因的上游簡并引物，用SEQID N0.8所示，下游簡并引物，用SEQ ID N0.9所示，以及重鏈可變區(qū)基因的上游簡并引物，用SEQ ID N0.10所示，下游簡并引物，用SEQ ID N0.11所示；以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得單抗輕鏈可變區(qū)基因\和單抗重鏈可變區(qū)基因VH。表I輕鏈、重鏈可變區(qū)基因PCR簡并引物
權(quán)利要求
1.一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體,是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
2.一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體的制備方法，包括如下步驟: (1)制備葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2； (2)采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2總mRNA，以oligo(dT)18為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ； (3)在相對保守的framel區(qū)和frame4區(qū),設(shè)計(jì)由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細(xì)胞2C2表達(dá)的單抗的輕鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示的上、下游簡并引物，以及重鏈可變區(qū)基因的用SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示的上、下游簡并引物；以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因，分別克隆至pUC-T simple載體，經(jīng)測序及MGT/V-QUEST、BLAST分析，確認(rèn)所獲序列符合鼠源抗體可變區(qū)經(jīng)典結(jié)構(gòu)，均為功能性V (D)J重排模式，其中，輕鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.2所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.3所示；重鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID N0.4所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.5所示； (4)結(jié)合二硫鍵穩(wěn)定的重構(gòu)抗體突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)輕鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列為模板，通過PCR擴(kuò)增，使輕鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)重鏈可變區(qū)基因的上、下游表達(dá)引物，分別用SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ IDN0.4所示序列為模板，通過PCR擴(kuò)增，使重鏈可變區(qū)基因序列C端修飾半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位點(diǎn)，同時(shí)在輕鏈可變區(qū)基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列的N端引入Kozak序列； (5)經(jīng)酶切、連接，將步驟(4)獲得的修飾的重鏈可變區(qū)基因序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)，獲得pcDNA3.1-Vh過渡載體；另以pIRESneo質(zhì)粒為模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸為上、下游引物，通過PCR擴(kuò)增獲得ivs-1RES序列；同時(shí)以步驟(4)獲得的修飾的輕鏈可變區(qū)基因序列和ivs-1RES序列為模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸為上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸為下游引物，采用兩步法重疊PCR方法，擴(kuò)增獲得帶有后續(xù)重組操作BamHI和Xba I酶切位點(diǎn)的ivs_IRES-\融合基因片斷，經(jīng)酶切、連接，插入所述pcDNA3.1-Vh過渡載體，構(gòu)建真核單啟動(dòng)子共表達(dá)重組質(zhì)粒P2C2HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL-3' 融合序列如 SEQ ID N0.6 所示，p2C2HIL0 如 SEQ ID N0.7 所示； (6)通過Lipo2000脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21細(xì)胞系，經(jīng)PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)分泌細(xì)胞系。
3.權(quán)利要求1的抗體在葡萄球菌腸毒素檢測中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1的抗體在細(xì)胞間接免疫熒光檢測中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1的抗體在流式細(xì)胞術(shù)檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體及制備方法及用途，一種葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本發(fā)明的方法通過構(gòu)建葡萄球菌腸毒素單抗輕、重鏈基因真核共表達(dá)載體，獲得高效表達(dá)穩(wěn)定分泌哺乳動(dòng)物細(xì)胞系及特異性高、親和力強(qiáng)的基因重構(gòu)抗體。本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素基因工程重構(gòu)抗體可以在葡萄球菌腸毒素檢測中的應(yīng)用，細(xì)胞間接免疫熒光檢測中的應(yīng)用和流式細(xì)胞術(shù)檢測中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103224560SQ201310015929
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者黃金海, 劉鵬翀 申請人:天津大學(xué)