專(zhuān)利名稱(chēng)：一種脂聯(lián)素濃度的測(cè)定方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂聯(lián)素濃度的測(cè)定方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂聯(lián)素(APN)是一種由脂肪細(xì)胞合成、分泌的細(xì)胞因子，1995年由Scherer等在小鼠3T3脂肪細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)。編碼脂聯(lián)素基因在人類(lèi)定位于染色體3q27，大小為17kb，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。全基因組掃描顯示該區(qū)域存在2型糖尿病和代謝異常綜合征的易感位點(diǎn)。脂聯(lián)素在人體是一個(gè)在胰島素敏感性和炎性通路中起重要作用的脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)。臨床研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素與肥胖、糖尿病、冠心病、胰島素抵抗密切相關(guān)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化形成、抗炎癥和血管損傷后抗內(nèi)膜增生的特性。目前的體外細(xì)胞培養(yǎng)及組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)脂聯(lián)素可能通過(guò)以下幾種機(jī)制直接作用于動(dòng)脈粥樣硬化的形成(I)脂聯(lián)素通過(guò)激活環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信號(hào)通路來(lái)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。(2)抑制巨噬細(xì)胞的功能，可抑制前體巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇酯的攝取，從而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。(3)抑制內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的分化、增殖與遷移[41-43]。(4)脂聯(lián)素通過(guò)減少血漿游離脂肪酸以及肌肉和肝臟內(nèi)的甘油三脂含量減弱了胰島素抵抗，改善糖、脂代謝紊亂。由此可見(jiàn)脂聯(lián)素既可直接作用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程，又可通過(guò)引起與冠狀動(dòng)脈硬化形成有關(guān)的一系列危險(xiǎn)因素的變化而間接影響血管病變的發(fā)生與發(fā)展。人體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，APN與機(jī)體胰島素敏感性之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性RI程度越高，APN血漿水平越低；反過(guò)來(lái)，APN水平升高可明顯改善RI，APN可能是通過(guò)以下機(jī)制來(lái)改善胰島素敏感性(I)脂聯(lián)素可增加5-AMP活化蛋白激酶(AMPK)對(duì)乙酰輔酶A羧化酶(ACC)磷酸化作用，加快脂肪酸氧化，使胰島素受體及受體后水平信號(hào)傳導(dǎo)加速，減少肝臟糖異生，促進(jìn)葡萄糖利用，從而達(dá)到改善胰島素抵抗的目的。(2)脂聯(lián)素對(duì)脂肪因子和脂肪酸引起的胰島B細(xì)胞凋亡起到一定的對(duì)抗作用，促進(jìn)葡萄糖的利用。(3)脂聯(lián)素可增強(qiáng)胰島素敏感性，并且可以改善胰島B細(xì)胞功能，對(duì)疾病的發(fā)生起到雙重保護(hù)作用。(4)抑制巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，減少其對(duì)脂質(zhì)的攝取，從而減少巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可結(jié)合血管損傷處膠原聚集在血管內(nèi)膜下，參與炎癥反應(yīng)的終止過(guò)程。通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型糖調(diào)節(jié)受損人群大血管病變影響因素分析，評(píng)價(jià)糖尿病血漿脂聯(lián)素(APN)在預(yù)測(cè)糖尿病前期大血管病變及其嚴(yán)重程度中的臨床意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種脂聯(lián)素的測(cè)定方法及其應(yīng)用，給預(yù)測(cè)糖尿病前期大血管病變的情況提供一種依據(jù)。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)?！N脂聯(lián)素濃度的測(cè)定方法，其步驟為(I)配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品 APN (濃度分別為 200、100、50、25、12. 5,6. 25,3. 125,1. 56、0.78ng/ml,共 9 管)。(2)血漿標(biāo)本IOml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測(cè)樣本。(3)每管加入IOOml待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入1-APN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在室溫下(20 25°C)孵育24小時(shí)過(guò)夜。(4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體(對(duì)照管除外)，混勻，40C孵育20分鐘，離心20分鐘(3000 Xg)吸取上清液棄去。(5)測(cè)定各試管的δ射線(xiàn)量。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，Β/Β0 (%)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。(7)根據(jù)樣品Β/Β0 (%)從曲線(xiàn)上查得相應(yīng)的APN濃度(ng/ml)。(8) APN濃度(ng/ml)計(jì)算:所得APN濃度(ng/ml)值乘以稀釋倍數(shù)(500)再除以1000即為樣本濃度。所述的IOX倍緩沖液(50ml)兔抗APN抗體(13ml)、IAPN標(biāo)記物(13.5ml)、標(biāo)準(zhǔn)品(重組APN純品0.75ml)、質(zhì)控品I和2(重組APN純品1ml)、兔載體(2ml)、沉淀試劑(羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體、3%聚乙二醇)。購(gòu)于美國(guó)Linco公司的放射免疫試劑盒，批內(nèi) CV < 6.21%,批間 CV < 9.25%。測(cè)定原理固定濃度的標(biāo)記抗原與一定量抗血清溫育抗體上抗原的結(jié)合位點(diǎn)是有限的。若加入未標(biāo)記抗原，兩者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體上的有限固定位點(diǎn)，隨著未標(biāo)記抗原增加，與抗體結(jié)合的標(biāo)記物將減少。將抗體結(jié)合物與游離的標(biāo)記物分離，然后計(jì)數(shù)其中一部分或兩部分，通過(guò)由標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可查得未知樣本中APN抗原的含量。本發(fā)明所述的測(cè)試方法，步驟簡(jiǎn)單，測(cè)量精準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型糖調(diào)節(jié)受損人群大血管病變影響因素分析，評(píng)價(jià)糖尿病血漿脂聯(lián)素(APN)在預(yù)測(cè)糖尿病前期大血管病變及其嚴(yán)重程度中的臨床意義。
圖1為實(shí)施例四組間血漿APN濃度比較具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn):實(shí)施例2009-2011收集長(zhǎng)寧區(qū)中心醫(yī)院，臨床疑似冠心病而住院行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)患者共210例。行口服糖耐量試驗(yàn)，根據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)糖代謝狀態(tài)分為:正常糖代謝組(NGT) 42例(男性21例，女性21例，平均年齡60.3± 10.9歲)；空腹血糖調(diào)節(jié)受損組(IFG)36例(男性20例，女性16例，平均年齡62.8±8.2歲);糖耐量減低組(IGT) 92例(男性54例，女性38例，平均年齡61.5±9.9歲)；其中IGTl組44例，IGT2組48例，空腹血糖受損合并糖耐量減低組(IFG+IGT)40例(男性25例，女性15例，平均年齡61.0±9.5歲)。所有入選對(duì)象均排除肝、腎、甲狀腺疾病，急性代謝紊亂、心功能衰竭、感染、自身免疫性疾病或結(jié)締組織疾病、腫瘤及既往曾接受過(guò)PTCA或CABG治療者。并未使用影響胰島素分泌和胰島素抵抗的藥物。
診斷及分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn):采用1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖調(diào)節(jié)受損(IFG),FPG6.1 〈7.0mmol/L，服糖后 2hPG〈7.8mmol/L;糖耐量減低(IGT)，F(xiàn)PG〈6.1mmoI/L，7.8mmol/L彡服糖后2hPG〈ll.lmmol/L ;空腹血糖受損合并糖耐量減低(IFG+IGT)，F(xiàn)PG6.1 〈7.0mmol/L，7.8mmol/L 彡服糖后 2hPG〈lL lmmol/L。對(duì) IGT 人群以2hPG10.0mmol/L 為節(jié)點(diǎn)進(jìn)一步分層，IGTl 組:7.8mmol/L 彡服糖 2hPG〈10.0mmol/L ；IGT2組:10.0mmol/L彡服糖后2hPG〈ll.lmmol/L。每例受試者空腹8-10小時(shí)后于次H晨8AM做75g葡萄糖耐量試驗(yàn)，將75g葡萄糖溶于250-300毫升水中，五分鐘內(nèi)飲完，分別于空腹、服糖后2小時(shí)抽取靜脈血測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、服糖后2h血糖(2hpost-challenge glucose, 2hPG),采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定,在美國(guó)貝克曼全自動(dòng)生化儀上完成。同時(shí)空腹檢測(cè)甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-c)低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-c),并測(cè)空腹胰島素(fasting insulin, FINS)、脂聯(lián)素、C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)。每例受試者均測(cè)體重(kg)、身高(m)、血壓(mmHg)計(jì)算每位患者的體重指數(shù)BMI (kg/m2)=體重/身高2。評(píng)價(jià)胰島素抵抗指標(biāo)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù) HOMA-1R= (FINS X FBG) /22.5。所有入選者在抽取上述空腹靜脈血標(biāo)本同時(shí)，留取2毫升靜脈血，以296EDTA抗凝后離心15分鐘，轉(zhuǎn)速3000r/min，留取上清液血漿0.5毫升，放置_80°C冰箱保存，保存時(shí)間小于3個(gè)月。測(cè)定方法:(I)配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品 APN (濃度分別為 200、100、50、25、12.5,6.25,3.125,1.56、0.78ng/ml,共 9 管)。(2)血漿標(biāo)本IOml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測(cè)樣本。(3)每管加入IOOml待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入IAPN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在室溫下(20 25°C)孵育24小時(shí)過(guò)夜。(4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體(對(duì)照管除外)，混勻，40C孵育20分鐘，離心20分鐘(3000 Xg)吸取上清液棄去。(5)測(cè)定各試管的&射線(xiàn)量。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，Β/Β0 (%)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。(7)根據(jù)樣品Β/Β0 (%)從曲線(xiàn)上查得相應(yīng)的APN濃度(ng/ml)。(8) APN濃度(ng/ml)計(jì)算:所得APN濃度(ng/ml)值乘以稀釋倍數(shù)(500)再除以1000即為樣本濃度。各組血漿APN濃度的比較:糖耐量異常及空腹血糖受損合并糖耐量異常組的血漿APN濃度顯著低于空腹血糖受損組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.013和0.002);亦顯著低于糖耐量正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.004和0.000);而糖耐量異常組和空腹血糖受損合并糖耐量異常組之間并無(wú)顯著差異(P=0.419);與空腹血糖受損組相比，糖耐量正常組的APN濃度雖較高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.779)。見(jiàn)表I和圖1。表I四組間血漿APN濃度比較
權(quán)利要求
1.一種脂聯(lián)素濃度的測(cè)定方法，其特征在于:其步驟為: (1)配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品APN； (2)血漿標(biāo)本IOml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測(cè)樣本； (3)每管加入IOOml待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入1-APN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在20 25 °C溫度下孵育24小時(shí)過(guò)夜； (4)次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體，對(duì)照管除外，混勻，4°C孵育20分鐘，離心20分鐘吸取上清液棄去； (5)測(cè)定各試管的S射線(xiàn)量； (6)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，Β/Β0(%)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (7)根據(jù)樣品Β/Β0從曲線(xiàn)上查得相應(yīng)的APN濃度；(8)APN濃度ng/ml計(jì)算:所得APN濃度ng/ml值乘以稀釋倍數(shù)500再除以1000即為樣本濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂聯(lián)素濃度的測(cè)定方法，其特征在于:步驟I)中，緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品 APN 的濃度分別為 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78ng/ml,共 9 管。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種脂聯(lián)素濃度的測(cè)定方法，其步驟為配置緩沖液標(biāo)準(zhǔn)品APN。血漿標(biāo)本10ml加入4990ml溶解緩沖液稀釋至1:500，即為待測(cè)樣本。每管加入100ml待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入I-APN溶液、兔抗APN抗體，充分混勻，在室溫下孵育24小時(shí)過(guò)夜。次日加入兔血清以及羊抗兔IgG抗體，混勻，4℃孵育20分鐘，離心20分鐘吸取上清液棄去。測(cè)定各試管的射線(xiàn)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制；在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品APN濃度為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品B/B0從曲線(xiàn)上查得相應(yīng)的APN濃度。APN濃度計(jì)算。本發(fā)明所述的測(cè)試方法，步驟簡(jiǎn)單，測(cè)量精準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型糖調(diào)節(jié)受損人群大血管病變影響因素分析，評(píng)價(jià)糖尿病血漿脂聯(lián)素在預(yù)測(cè)糖尿病前期大血管病變及其嚴(yán)重程度中的臨床意義。
文檔編號(hào)G01N33/60GK103076452SQ20121058802
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者寧光, 黃珊, 王衛(wèi)慶, 顧衛(wèi)瓊, 洪潔 申請(qǐng)人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所