專利名稱：鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產(chǎn)品及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產(chǎn)品及應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
測(cè)定尿或腦脊液總蛋白的方法有許多，但就對(duì)各種蛋白顯色的一致性來(lái)講，雙縮脲顯色法的均一性還是最好的。如目前最常用的鄰苯三酹紅鑰法(PyrogaUol Red.fnolybdate)和氯化節(jié)甲乙氧銨(Benzethonium Chloride)尿總蛋白質(zhì)測(cè)定，前者為染料結(jié)合法后者為濁度法。由于兩者都與白蛋白和球蛋白反應(yīng)靈敏性存在差異，故不能準(zhǔn)確表達(dá)蛋白含量，而雙縮脲法是利用了蛋白質(zhì)的多肽鍵，所以顯色和蛋白質(zhì)種類沒(méi)關(guān)系。臨床大多采用銅雙縮脲法，但是其顯色不太敏感，通常只能用于檢測(cè)血清總蛋白等含量較高的體液，而對(duì)尿、腦脊液蛋白卻需要沉淀離心濃縮步驟而不能直接檢測(cè)。而已報(bào)道的鎳-雙縮脲 試劑穩(wěn)定性、檢測(cè)靈敏度也都不能同時(shí)達(dá)不到對(duì)尿、腦脊液蛋白直接檢測(cè)要求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種不需沉淀離心濃縮即可直接測(cè)定尿液或腦脊液總蛋白的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產(chǎn)品及應(yīng)用方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.(Tl. 4 mol/L氫氧化鈉用O. Γθ. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05 O. 07mol/L三乙醇胺、O. 17 O. 23mol/L檸檬酸三鈉、
O.015^0. 025 mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 14^0. 2mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解,然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3: (Γ5)(2^3)的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑；
3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以4:1飛I體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。步驟2中所述三乙醇胺優(yōu)選為O. 06mol/L。所述步驟I、步驟2中所述氯化鈉溶液分別優(yōu)選為O. 154 mol/L?！N如上所述的鎳-雙縮脲試劑的制備方法所制得的產(chǎn)品。一種如上所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)在濃度為(T8000mg/L的范圍內(nèi)，用3 7個(gè)不同濃度定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線.
b)測(cè)定被測(cè)樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8 2. 8ml與B組試劑0. 3 0. 7ml混合，然后加入0. 25 0. 35ml被測(cè)樣本混合后，放置30°C 40°C水浴2 4小時(shí)或避光室溫16 48小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述定標(biāo)液的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑
0.18 O. 28ml加入被測(cè)樣本O. 025 O. 035ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在30°C 40°C水浴4^7分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 03、. 07ml混合后繼續(xù)水浴1(Γ25分鐘，測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述定標(biāo)液的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量。步驟b的手工比色法中所述分光光度儀在波長(zhǎng)為420nnT 470nm處進(jìn)行吸光值測(cè)定。步驟b中所述被測(cè)樣本的總蛋白含量在50mg/L 8000mg/L范圍內(nèi)呈線性。 所述步驟b的生化自動(dòng)儀測(cè)試法中測(cè)定吸光值時(shí)所在的主波長(zhǎng)為420nnT470nm，副波長(zhǎng)為650nm 700nm。所述被測(cè)樣本在尿液樣本、腦脊液樣本中任選一種。所述步驟b的手工比色法中，所述空白鎳-雙縮脲試劑是指取所述A組試劑
1.8^2. 8ml與B組試劑O. 3^0. 7ml混合，然后用等量的生理鹽水或蒸餾水代替被測(cè)樣本加入到A組試劑與B組試劑的混合液中，所述空白鎳-雙縮脲試劑用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)。本發(fā)明發(fā)明原理及效果如下
I、本發(fā)明所述的空白鎳-雙縮試劑為淺黃色，6個(gè)內(nèi)月穩(wěn)定，鎳-雙縮脲試劑與被測(cè)樣本混合后最終產(chǎn)物為深黃。根據(jù)本發(fā)明用鎳-雙縮脲試劑盒測(cè)定尿液或腦脊液總蛋白的應(yīng)用方法(簡(jiǎn)稱鎳雙縮法)，消光系數(shù)可達(dá)到O. 459，而銅Doumas法雙縮法復(fù)合物消光系數(shù)為O. 298，比銅雙縮法高出54%，恰好達(dá)到了能夠測(cè)定尿液總蛋白的最低要求。其光譜吸收曲線用SHIMABEU-2550型分光光度儀進(jìn)行掃描，吸收峰為440nm。但是若通過(guò)手工比色法，要完成整個(gè)反應(yīng)在37°C需3小時(shí)，為了適合自動(dòng)化分析儀的應(yīng)用，對(duì)生化自動(dòng)儀的測(cè)定過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)，縮短了反應(yīng)時(shí)間，增加了定標(biāo)點(diǎn)，最后標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)拋物線。定標(biāo)液的蛋白最高定標(biāo)濃度是2000mg/L，但經(jīng)過(guò)測(cè)定，本發(fā)明在定標(biāo)曲線的200(T8000mg/L的延伸范圍依然呈現(xiàn)良好的總蛋白測(cè)定結(jié)果。2.鎳雙縮法的核心問(wèn)題是絡(luò)合劑。絡(luò)合劑的作用就是防止鎳液析出沉淀，增加鎳液穩(wěn)定性并延長(zhǎng)使用壽命。如果鎳液中沒(méi)有絡(luò)合劑存在，由于鎳的氫氧化物溶解度較小，便可析出淺綠色絮狀含水氫氧化鎳沉淀。硫酸鎳溶于水后形成六水合鎳離子，如果六水合鎳離子中有部分絡(luò)合劑存在則可以明顯提高其抗水解能力，甚至有可能在堿性環(huán)境中以鎳離子形式存在。不過(guò)，pH值增加，六水合鎳離子中的水分子會(huì)被OH根取代，促使水解加劇，要完全抑制水解反應(yīng)，鎳離子必須全部螯合以得到抑制水解的最大穩(wěn)定性。但是加入絡(luò)合劑使試劑中游離鎳離子濃度大幅度下降，從質(zhì)量作用定律看降低反應(yīng)物濃度反而提高了反應(yīng)速度是不可能的，因此合適的絡(luò)合劑則要求它們具有較大的溶解度，存在一定的反應(yīng)活性。經(jīng)過(guò)研究和反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三乙醇胺絡(luò)合能力雖較差在堿性條件下較穩(wěn)定，PH11-13時(shí)能隱蔽Fe、Al、Mn等，可用于乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)鎳滴定的隱蔽齊U。符合使游離的鎳離子既不能太多使產(chǎn)生沉淀，也不能太少而影響雙縮脲顯色法的速度的要求。
3.黃疸尿光譜分析其色素變化規(guī)律為
I)尿液分析呈單一膽紅素峰。2)尿液中出現(xiàn)兩種吸收峰，一種吸收峰為420nm的膽紅素、另一種吸收峰為492nm的尿膽素，其中膽紅素為主。3)各種原因引起紅細(xì)胞大量破壞，肝臟超負(fù)荷代謝，至使尿膽原、尿膽素顯著增高。同時(shí)大量血紅蛋白(Hb)超過(guò)結(jié)合球蛋白等結(jié)合能力，從濾膜濾出。因此除尿膽素吸收峰外，尚可見(jiàn)吸收峰在415nm、540nm、575nm的血紅蛋白(Hb)特異吸收峰,其中以吸收峰在415nm為主。而膽紅素的吸收峰在420nm與自動(dòng)化分析儀的450nm相近,具有干擾作用。考慮到膽紅素在堿性條件下的分解情況，本發(fā)明 的生化自動(dòng)儀測(cè)試法中特意把含有氫氧化鈉液的A試劑放在I號(hào)試劑位，與2號(hào)位的B試劑三乙醇胺分開(kāi)存放，使三乙醇胺避開(kāi)強(qiáng)堿性而更穩(wěn)定，并把第I次測(cè)定點(diǎn)設(shè)在樣品加入A試劑后Γ7分鐘以用于膽紅素分解，膽紅素濃度〈0.07262mol/L時(shí)，對(duì)結(jié)果無(wú)影響。本發(fā)明產(chǎn)品在制備時(shí)三乙醇胺的最佳濃度在O. 05、. 07mol/L之間濃度，三乙醇胺濃度和試劑空白具有一定關(guān)系，當(dāng)二乙醇胺的濃度提聞時(shí)，試劑空白也會(huì)隨之相應(yīng)提聞，而O. O 6 mol/L就是在確保反應(yīng)速度的前提下盡可能減少空白值是最佳點(diǎn)。當(dāng)三乙醇胺的濃度再提高時(shí)反應(yīng)速度沒(méi)提高而只是提高了試劑空白。使最低檢測(cè)靈敏度下降。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯化鈉的存在可以加快鎳雙縮法的反應(yīng)速度，而在氯化鈉達(dá)到O. 154mol/L后，則加快作用不再增加。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明根據(jù)雙縮脲在堿性條件下除能與銅形成絡(luò)合物外，還能與鉆、鎳、鋅等結(jié)合，且與鎳-螯合物配制雙縮脲顯色較為靈敏的特點(diǎn)，通過(guò)研究和各種改進(jìn)建立了蛋白檢測(cè)范圍50mg/L-8000mg/L且能用于自動(dòng)化分析的方法，使雙縮脲顯色法的應(yīng)用領(lǐng)域得到了擴(kuò)展。本發(fā)明的產(chǎn)品在用于測(cè)定尿液總蛋白時(shí)，不需沉淀離心濃縮、可以直接準(zhǔn)確的測(cè)定尿液/腦脊液總蛋白。以生化自動(dòng)儀測(cè)試法測(cè)定20例尿液蛋白并與鎢酸沉淀離心銅雙縮脲法、鄰苯三酚紅鑰法、氯化芐甲乙氧銨法同時(shí)檢測(cè)，蛋白濃度在68-3684mg/L之間，結(jié)果配對(duì)t檢驗(yàn)分析顯示鎳雙縮脲法與鎢酸沉淀離心銅雙縮脲法間P>0. 05無(wú)顯著差異。而鄰苯三酚紅鑰法偏高，氯化芐甲乙氧銨法偏低，說(shuō)明鎳雙縮脲法具有銅雙縮脲沉淀離心法的準(zhǔn)確性，卻同時(shí)有著直接測(cè)定的便利性，值得推廣。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.(Tl. 4mol/L氫氧化鈉用O. Γθ. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05 O. 07mol/L三乙醇胺、O. 17 O. 23mol/L檸檬酸三鈉、O. 015^0. 025mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 14^0. 2mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解,然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3: (Γ5) : (2^3)體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以4:1飛I體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。
本發(fā)明鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)定標(biāo)曲線可通過(guò)常規(guī)手工比色法和常規(guī)生化自動(dòng)儀測(cè)試法兩種方法進(jìn)行定標(biāo)得至IJ，定標(biāo)曲線在用常規(guī)手工比色法定標(biāo)時(shí)，在濃度為(TSOOOmg/L的范圍內(nèi)用2 7個(gè)不同濃度定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線呈直線；在用常規(guī)生化自動(dòng)儀測(cè)試法定標(biāo)時(shí)在濃度為(T2000mg/L的范圍內(nèi)用5 7個(gè)不同濃度定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線呈拋物線。所述的用定標(biāo)液得出定標(biāo)曲線的方法為常規(guī)的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明不作詳述。b)測(cè)定被測(cè)樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8 2. 8 ml (優(yōu)選2. 3 2. 7ml)與B組試劑O. 3 O. 7ml混合，然后加入O. 25 O. 35ml被測(cè)樣本混合后，放置30°C 40°C水浴2 4小時(shí)或避光室溫16 48小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定在波長(zhǎng)為420nnT470nm處的吸光值，并用空白·鎳-雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；所述被測(cè)樣本的總蛋白含量在50mg/L 8000mg/L范圍內(nèi)呈線性。所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水或蒸餾水代替被測(cè)樣本，即在取所述A組試劑I. 8 2. 8 ml與B組試劑O. 3 O. 7ml混合后，加入O. 25 O. 35ml的生理鹽水或蒸餾水混合。所述空白鎳-雙縮脲試劑用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)。方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法-M A組試劑O. 18 O. 28ml (優(yōu)選O. 23m廣O. 27ml)加入被測(cè)樣本O. 025πιΓθ. 035ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在30°C 40°C水浴4 7分鐘后在主波長(zhǎng)為42(T470nm，副波長(zhǎng)為65(T700nm處測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 03 O. 07ml混合后繼續(xù)水浴10 25分鐘，在主波長(zhǎng)為42(T470nm，副波長(zhǎng)為65(T700nm處測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量。所述被測(cè)樣本在尿液樣本、腦脊液樣本中任選一種。本發(fā)明所使用的分光光度儀主要包括以下幾種中的任意一種日本島京公司生產(chǎn)的、型號(hào)為SHIMABEU-2550型的分光光度儀；上海上分公司生產(chǎn)的、型號(hào)為721-100的分光光度儀；美國(guó)哈希公司生產(chǎn)的、型號(hào)為DR2700-01的分光光度儀；上海尤尼柯公司生產(chǎn)的、型號(hào)為7200的分光光度儀。本發(fā)明所使用的生化自動(dòng)儀主要包括以下幾種中的任意一種日本日立公司生產(chǎn)的、型號(hào)為=HITACH 17170型的全自動(dòng)生化分析儀；德國(guó)羅氏公司公司生產(chǎn)的、型號(hào)為MODULAR P-800模塊的生化自動(dòng)儀；美國(guó)雅培公司生產(chǎn)的、型號(hào)為Aeroset的生化自動(dòng)儀；德國(guó)西門子公司生產(chǎn)的、型號(hào)為ADBIA0R2400的生化自動(dòng)儀。以上所述分光光度儀與生化自動(dòng)儀的型號(hào)具有代表性，是為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限制。下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。實(shí)施例一本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.2mol/L氫氧化鈉用O. 154mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05mol/L三乙醇胺、O. 2mol/L檸檬酸三鈉、O. 02mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 154mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:2的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。
3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑按5:1體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測(cè)定尿液總蛋白的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內(nèi)，通過(guò)常規(guī)生化自動(dòng)儀測(cè)試法，用6個(gè)不同濃度的定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線。b)以加入已知血清含量的尿液樣本作為被測(cè)樣本，測(cè)定尿液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑2. 5ml與B組試劑O. 5ml混合，然后加入O. 3ml尿液樣本混合后，放置37°C水浴3小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定在波長(zhǎng)為440nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定 標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測(cè)樣本加入A組試劑和B組試劑進(jìn)行混合，用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)。根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內(nèi)符合準(zhǔn)確度要求。方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑O. 25ml加入尿液樣本O. 03ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在37°C水浴5分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 05ml混合后繼續(xù)水浴15分鐘，在主波長(zhǎng)為450nm，副波長(zhǎng)為700nm處測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)液定值進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內(nèi)符合準(zhǔn)確度要求。實(shí)施例二 本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.2mol/L氫氧化鈉用O. 154mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.05mol/L三乙醇胺、O. 2mol/L檸檬酸三鈉、O. 02mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 154mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:2體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以5:1體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測(cè)定腦脊液總蛋白的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內(nèi)，通過(guò)常規(guī)生化自動(dòng)儀測(cè)試法，用6個(gè)不同濃度的定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線。b)以加入已知血清含量的腦脊液作為被測(cè)樣本，測(cè)定腦脊液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法手工比色法取所述A組試劑2. 5ml與B組試劑O. 5ml混合，然后加入O. 3ml離心后腦脊液樣本混合后，放置避光室溫48小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定在波長(zhǎng)為440nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測(cè)樣本，用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內(nèi)符合準(zhǔn)確度要求。方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑O. 25ml加入腦脊液樣本O. 03ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在37°C水浴5分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 05ml混合后繼續(xù)水浴15分鐘，在主波長(zhǎng)為450nm，副波長(zhǎng)為700nm處測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)液定值進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量在50mg/L-8000mg/L范圍內(nèi)符合準(zhǔn)確度要求。實(shí)施例三本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.OmoI/L氫氧化鈉用O. 18mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.065mol/L三乙醇胺、O. 21mol/L檸檬酸三鈉、O. 015mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 18mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:3的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以5:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。 本例用鎳-雙縮脲試劑測(cè)定尿液總蛋白的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內(nèi)，用5個(gè)不同濃度的定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線。b)以加入已知血清含量的尿液作為被測(cè)樣本，測(cè)定尿液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8ml與B組試劑O. 36ml混合，然后加入O. 28ml尿液樣本混合后，放置37°C水浴2. 2小時(shí)或避光室溫30小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定在波長(zhǎng)為420nm處的吸光值，并用空白鎳_雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測(cè)樣本，用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量在50mg/L-7500mg/L范圍內(nèi)符合準(zhǔn)確度要求。方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑O. 18ml加入被測(cè)樣本O. 028ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在35°C水浴4. 3分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 036ml混合后繼續(xù)水浴18分鐘，在主波長(zhǎng)為450nm，副波長(zhǎng)為650nm處測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)液定值進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量在50mg/L-6000mg/L范圍內(nèi)符合準(zhǔn)確度要求。實(shí)施例四本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.25mol/L氫氧化鈉用O. 154mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.06mol/L三乙醇胺、O. 18mol/L檸檬酸三鈉、O. 017mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 154mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:4:3的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以4:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測(cè)定尿液總蛋白的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)在(T2000mg/L的范圍內(nèi)，用5個(gè)不同濃度的定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線。b)以加入已知血清含量的尿液作為被測(cè)樣本，測(cè)定尿液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑2. 8ml與B組試劑O. 7ml混合，然后加入O. 35ml尿液樣本混合后，放置33°C水浴3. 5小時(shí)或避光室溫40小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定在波長(zhǎng)為450nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的生理鹽水代替被測(cè)樣本，用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量為50mg/L-7500mg/L范圍內(nèi)，符合準(zhǔn)確度要求。方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑O. 28ml加入被測(cè)樣本O. 035ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在33°C水浴4分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 07ml混合后繼續(xù)水浴25分鐘，在主波長(zhǎng)為470nm，副波長(zhǎng)為700nm處測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)液的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量為50mg/L-6000mg/L。實(shí)施例五本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.4mol/L氫氧化鈉用O. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.07mol/L三乙醇胺、O. 23mol/L檸檬酸三鈉、O. 025mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 2mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:4:2的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以6:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測(cè)定腦脊液總蛋白的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)在(TSOOOmg/L的范圍內(nèi)，通過(guò)常規(guī)手工比色法，用7個(gè)不同濃度的定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線。b)以加入已知血清含量的腦脊液作為被測(cè)樣本，測(cè)定腦脊液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8ml與B組試劑O. 3ml混合，然后加入O. 25ml腦脊液樣本混合后，放置30°C水浴4小時(shí)或避光室溫16小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定在波長(zhǎng)為470nm處的吸光值，并用空白鎳_雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是指用等量的蒸餾水代替被測(cè)樣本，用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量為5(T5800 mg/L范圍內(nèi)，符合準(zhǔn)確度要求。方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑O. 18ml加入被測(cè)樣本O. 025ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在30°C水浴7分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 03ml混合后繼續(xù)水浴10分鐘，在主波長(zhǎng)為420nm，副波長(zhǎng)為620nm處測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)液的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量為5(T5500 mg/L。實(shí)施例六本例鎳-雙縮脲試劑的制備方法，包括如下步驟
1)制備A組試劑將I.3mol/L氫氧化鈉用O. 14mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；
2)制備B組試劑將O.065mol/L三乙醇胺、O. 17mol/L檸檬酸三鈉、O. 016mol/L六水合硫酸鎳分別用O. 14mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:5:3的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以4:1的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本例用鎳-雙縮脲試劑測(cè)定腦脊液總蛋白的應(yīng)用方法，包括如下步驟
a)定標(biāo)曲線在用常規(guī)手工比色法定標(biāo)時(shí)，在濃度為(T8000mg/L的范圍內(nèi)用3個(gè)不同濃度定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線，在用常規(guī)生化自動(dòng)儀測(cè)試法定標(biāo)時(shí)在濃度為(T2000mg/L的范圍內(nèi)用5個(gè)不同濃度定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線。b)以加入已知血清含量的腦脊液作為被測(cè)樣本，測(cè)定腦脊液樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種
方式一手工比色法取所述A組試劑2. 7ml與B組試劑O. 675ml混合，然后加入
O.32ml腦脊液樣本混合后，放置40°C水浴2小時(shí)或避光室溫20小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定在波長(zhǎng)為430nm處的吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；所述空白鎳-雙縮脲試劑是 指用等量的蒸餾水代替被測(cè)樣本，用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量為5(T5600 mg/L范圍內(nèi)，符合準(zhǔn)確度要求。方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑O. 27ml加入被測(cè)樣本O. 032ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在40°C水浴6分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 0675ml混合后繼續(xù)水浴20分鐘，在主波長(zhǎng)為430nm，副波長(zhǎng)為630nm處測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)液的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量為5(T5200 mg/L。表I全自動(dòng)生化儀回收試驗(yàn)實(shí)施例一、三、四測(cè)試結(jié)果如下(單位mg/L)
權(quán)利要求
1.一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)制備A組試劑將I.(Tl. 4 mo I/L氫氧化鈉用O. Γθ. 2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑； 2)制備B組試劑將O.05 O. 07mol/L三乙醇胺、O. 17 O. 23mol/L檸檬酸三鈉、O.015^0. 025 mo I/L六水合硫酸鎳分別用O. 14^0. 2mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解,然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3: (Γ5)(2^3)的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑； 3)將A組試劑、B組試劑分別保存，使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以4:1飛I體積比的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于步驟2中所述三乙醇胺為O. 06mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟I、步驟2中所述氯化鈉溶液分別為O. 154 mol/L。
4.一種如權(quán)利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑的制備方法所制得的產(chǎn)品。
5.—種如權(quán)利要求I所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，其特征在于包括如下步驟 a)在濃度為(T8000mg/L的范圍內(nèi)，用3 7個(gè)不同濃度定標(biāo)液測(cè)定總蛋白，得出定標(biāo)曲線. b)測(cè)定被測(cè)樣本總蛋白含量在以下兩種方式中選擇一種方式一手工比色法取所述A組試劑I. 8 2. 8ml與B組試劑O. 3 O. 7ml混合，然后加入O. 25 O. 35ml被測(cè)樣本混合后，放置30°C 40°C水浴2 4小時(shí)或避光室溫16 48小時(shí)；用分光光度儀測(cè)定吸光值，并用空白鎳-雙縮脲試劑校零，最終測(cè)得的結(jié)果與步驟a中所述定標(biāo)液的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量；方式二 生化自動(dòng)儀測(cè)試法取A組試劑O.18 O. 28ml加入被測(cè)樣本O. 025 O. 035ml，混合后放入生化自動(dòng)儀中，在30°C 40°C水浴4^7分鐘后測(cè)定吸光值，然后加入B組試劑O. 03、. 07ml混合后繼續(xù)水浴1(Γ25分鐘，測(cè)定吸光值，最終測(cè)得結(jié)果與所述定標(biāo)液的定標(biāo)曲線進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)定標(biāo)曲線得出被測(cè)樣本總蛋白含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，其特征在于步驟b的手工比色法中所述分光光度儀在波長(zhǎng)為420nnT 470nm處進(jìn)行吸光值測(cè)定。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，其特征在于步驟b中所述被測(cè)樣本的總蛋白含量在50mg/L 8000mg/L范圍內(nèi)呈線性。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，其特征在于所述步驟b的生化自動(dòng)儀測(cè)試法中測(cè)定吸光值時(shí)所在的主波長(zhǎng)為420nnT470nm，副波長(zhǎng)為650nm 700nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，其特征在于所述被測(cè)樣本在尿液樣本、腦脊液樣本中任選一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法所制得產(chǎn)品的應(yīng)用方法，其特征在于所述步驟b的手工比色法中，所述空白鎳-雙縮脲試劑是指取所述A組試劑.1.8~2. 8ml與B組試劑O. 3~0. 7ml混合，然后用等量的生理鹽水或蒸餾水代替被測(cè)樣本加入到A組試劑與B組試劑的混合液中，所述空白鎳-雙縮脲試劑用于對(duì)被測(cè)樣本所測(cè)得的顏色進(jìn)行校準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明為一種鎳-雙縮脲試劑盒的制備方法、產(chǎn)品及應(yīng)用方法。本發(fā)明產(chǎn)品的制備方法包括如下步驟1)將1.0~1.4mol/L氫氧化鈉用0.14~0.2mol/L氯化鈉溶液溶解得A組試劑；2)將0.05~0.07mol/L三乙醇胺、0.17~0.23mol/L檸檬酸三鈉、0.015~0.025mol/L六水合硫酸鎳分別用0.14~0.2mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行溶解，然后將溶解后的三乙醇胺、檸檬酸三鈉、六水合硫酸鎳以3:(4~5):(2~3)的體積比先將溶解后的三乙醇胺慢慢加入溶解后的檸檬酸三鈉混合，然后再加入溶解后的六水合硫酸鎳混合得B組試劑。3)使用時(shí)將A組試劑與B組試劑以41~61的比例混合，得鎳-雙縮脲試劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)各種蛋白顯色的一致性好且靈敏度較高，線性范圍大。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102944525SQ20121043223
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者忻鼎廣 申請(qǐng)人:上海市東方醫(yī)院