專利名稱：一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測水體中氟含量的方法。
背景技術(shù)：
氟污染主要來源于主要來源于鋁的冶煉、磷礦石加工、磷肥生產(chǎn)、鋼鐵冶煉和煤炭燃燒過程的排放物，以及電鍍、金屬加工等工業(yè)的含氟廢水的排放。含氟煙塵沉降或受降水淋洗，會使土壤、地表水和地下水受污染。氟可以抑制脂肪酶、骨質(zhì)磷酸酶和尿素酶等酶的活性，引起物質(zhì)代謝紊亂。氟還可使甲狀旁腺代償性增生，干擾骨的鈣磷代謝。骨骼氟中毒表現(xiàn)為骨硬化，韌帶、關(guān)節(jié)囊鈣化，椎管及椎間孔變窄后，可壓迫脊髓神經(jīng)根而導(dǎo)致麻痹、癱瘓。氟還可抑制內(nèi)分泌作用，對生殖腺、腎上腺和胰腺產(chǎn)生不良影響。高濃度氟污染可刺激皮膚和粘膜，弓I起皮膚灼傷、皮炎、呼吸道炎癥。我國國標(biāo)規(guī)定的氟含量環(huán)境監(jiān)測方法主要為類氟試劑比色法、茜素磺酸鋯目視比色法、離子選擇性電極法以及離子色譜法。這些化學(xué)分析和儀器檢測一般都需要量藥品或者昂貴設(shè)備，前處理步驟繁瑣，操作復(fù)雜，而且往往由于缺乏特異標(biāo)樣而無法獲得精確數(shù)值?；瘜W(xué)分析中包括過硫酸銨分光光度法、高碘酸銀鉀分光光度法和甲醛肟分光光度法等測定氟的方法，這些方法都需要大量藥品，步驟繁雜，工作量大，而且誤差也較大。大腸桿菌(Escherichia coli)作為水質(zhì)衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，在環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測中起著非常重要的指示作用，其實驗方法規(guī)范，生長培養(yǎng)操作簡易，存在多種突變體菌株，可通過有綠色熒光蛋白胨GFP表達的0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液指示水體污染程度并量化表征，并通過培養(yǎng)基擴散的變化，評價其生存條件的優(yōu)劣，因此廣泛應(yīng)用于環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決現(xiàn)有的檢測水體中氟含量的方法存在的對設(shè)施要求高、操作復(fù)雜、成本昂貴的技術(shù)問題，而提供一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法。本發(fā)明的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行一、配置LB液體培養(yǎng)基；二、將菌液濃度為IO6 109Cuf/mL的0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基按體積比為(f2):1000混合，在溫度為34 40°C的條件下，培養(yǎng)擴llh，至平臺期，得到平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液；三、將步驟二得到的平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基按體積比為I :(9(Γ110)混合，得到檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液；四、將不同氟含量的水樣與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液按體積比為(f2):1000分別混合，在溫度為3Γ40 的條件下，震蕩培養(yǎng)4 6h，得到不同濃度的含氟菌液；然后取每個濃度的含氟菌液，在熒光顯微鏡下進行熒光強度檢測，利用圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化熒光強度以表征細菌生長狀況，建立菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線和回歸方程y=_8. 6575x+994. 36 ;其中x為含氟水樣的氟濃度，y為含氟菌液的熒光強度；不同氟含量的水樣中氟濃度分別為 O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. Img/L、0. 5mg/L、lmg/L、5mg/L、IOmg/L、20mg/L 和 50mg/L ；五、取待測水樣，加入到步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液中，在溫度為3Γ40 的條件下，震蕩培養(yǎng)4 6h，測量菌液熒光強度，利用步驟四獲得的回歸方程計算待測水樣中的氟含量；其中待測水樣的與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液的體積t匕(I 2) 1000o本發(fā)明有益效果 本發(fā)明的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法的優(yōu)點在于，在較短時間內(nèi)，通過細菌生長檢測含氟水體的濃度并評價其毒性，與化學(xué)檢測方法和儀器分析等傳統(tǒng)技術(shù)相比成本低、步驟少、操作簡單。本發(fā)明的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，利用發(fā)光細菌熒光敏感度強于傳統(tǒng)的OD值的優(yōu)點，通過熒光顯微鏡和圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化熒光強度以表征細菌生長狀況，然后建立菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線和回歸方程，利用回歸方程可快速計算出待測水樣中氟的含量，與傳統(tǒng)的瓊脂擴散法比較，本發(fā)明的利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法更快捷和準(zhǔn)確，且實驗操作方便，精確度高，不需要特殊的高精分析儀器和檢測設(shè)備，可應(yīng)用于環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域。
圖I是實施例I中菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明的技術(shù)方案不局限于以下具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行一、配置LB液體培養(yǎng)基；二、將菌液濃度為IO6 109Cuf/mL的0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基按體積比為(f2):1000混合，在溫度為34 40°C的條件下，培養(yǎng)擴llh，至平臺期，得到平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液；三、將步驟二得到的平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基按體積比為I :(9(Γ110)混合，得到檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液；四、將不同氟含量的水樣與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液按體積比為(f2):1000分別混合，在溫度為3Γ40 的條件下，震蕩培養(yǎng)4 6h，得到不同濃度的含氟菌液；然后取每個濃度的含氟菌液，在熒光顯微鏡下進行熒光強度檢測，利用圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化熒光強度以表征細菌生長狀況，建立菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線和回歸方程y=_8. 6575x+994. 36 ;其中x為含氟水樣的氟濃度，y為含氟菌液的熒光強度；不同氟含量的水樣中氟濃度分別為 O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. Img/L、0. 5mg/L、lmg/L、5mg/L、IOmg/L、20mg/L 和 50mg/L ；五、取待測水樣，加入到步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液中，在溫度為3Γ40 的條件下，震蕩培養(yǎng)4 6h，測量菌液熒光強度，利用步驟四獲得的回歸方程計算待測水樣中的氟含量；其中待測水樣的與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液的體積t匕(I 2) 1000o本實施方式的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法的優(yōu)點在于，在較短時間內(nèi)，通過細菌生長檢測含氟水體的濃度并評價其毒性，與化學(xué)檢測方法和儀器分析等傳統(tǒng)技術(shù)相比成本低、步驟少、操作簡單。本實施方式的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，利用發(fā)光細菌熒光敏感度強于傳統(tǒng)的OD值的優(yōu)點，通過熒光顯微鏡和圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化熒光強度以表征細菌生長狀況，然后建立菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線和回歸方程，利用回歸方程可快速計算出水樣中氟的含量，與傳統(tǒng)的瓊脂擴散法比較，本實施方式的利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法更快捷和準(zhǔn)確，且實驗操作方便，精確度高，不需要特殊的高精分析儀器和檢測設(shè)備，可應(yīng)用于環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基的體積比為I. 5 :1000，其它步驟與參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟二中培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為10h，其它步驟與參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一的是步驟三中步驟二得到的平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與LB液體培養(yǎng)基的體積比為I :100，其它步驟與參數(shù)與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一的是步驟四中不同氟含量的水樣中的水為蒸餾水，其它步驟與參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟四中不同氟含量的水樣與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液的體積比為I. 5 :1000，其它步驟與參數(shù)與具體實施方式
一或五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一的是步驟四和步驟五中振蕩培養(yǎng)的溫度條件均為37°C,時間為5h,其它步驟與參數(shù)與具體實施方式
一至六之一相同。用以下試驗驗證本發(fā)明的有益效果實施例I、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行一、配置LB液體培養(yǎng)基稱取Ig酵母膏，2g蛋白胨和2g NaCl，加入到IOOOmL蒸餾水中，在溫度為120°C條件下，加熱20min，進行滅菌，得到LB液體培養(yǎng)基；二、取2mL菌液濃度為109cuf/mL的0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液，加入到步驟一的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度為37°C的條件下，培養(yǎng)10h，至平臺期，得到平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液；其中0P50-GFP大腸桿菌菌株購買自美國NIH資助的國際線蟲種質(zhì)中心(CGC)；三、將步驟二得到的平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基按體積比為1:100混合，得到檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液；四、將不同氟含量的水樣與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液按體積比為I. 5 1000分別混合，在溫度為37°C的條件下，震蕩培養(yǎng)5h，得到不同濃度的含氟菌液；然后取O. ImL每個濃度的含氟菌液，分別滴于載玻片上，用蓋玻片平鋪封蓋，在型號為AxioObserverAl的zeiss突光顯微鏡下進行突光強度檢測,利用AxioVision LE圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化熒光強度以表征細菌生長狀況，建立菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線如圖I所示、回歸方程y=_8. 6575x+994. 36 (x為含氟水樣的氟濃度,y為含氟菌液的熒光強度)；其中不同氟含量的水樣中水為蒸餾水，水樣中氟濃度分別為O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. lmg/L、
O.5mg/L、lmg/L、5mg/L,、10mg/L、20mg/L和50mg/L,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)參考生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和污水排放濃度；
五、取已知氟濃度為O. 05mg/L的待測水樣，將其加入到步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液中，在溫度為37°C的條件下，震蕩培養(yǎng)5h，測量菌液熒光強度，利用步驟四得到的回歸方程計算待測水樣中的氟含量；其中待測水樣與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液按體積比為I. 5 1000o通過本實施例的方法，計算出待測水樣的氟含量為O. 048mg/L,與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。本實施例的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法的優(yōu)點在于，在較短時間內(nèi)，通過細菌生長檢測含氟水體的濃度并評價其毒性，與化學(xué)檢測方法和儀器分析等傳統(tǒng)技術(shù)相比成本低、步驟少、操作簡單。本實施例的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，利用發(fā)光細菌熒光敏感度強于傳統(tǒng)的OD值的優(yōu)點，通過熒光顯微鏡和圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化熒光強度以表征細菌生長狀況，然后建立菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線和回歸方程，利用回歸方程可快速計算出水樣中氟的含量，與傳統(tǒng)的瓊脂擴散法比較，本實施例的利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法更快捷和準(zhǔn)確，且實驗操作方便，精確度高，不需要特殊的高精分析儀器和檢測設(shè)備，可應(yīng)用于環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域。實施例2、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行本實施例與實施例I不同的是步驟七中待測水樣濃度為O. lmg/L，其他過程及參數(shù)與實施例I相同。利用實施例I的回歸方程，計算出待測水樣的氟含量為O. 116mg/L，與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。實施例3、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行本實施例與實施例I不同的是步驟七中待測水樣濃度為O. 5mg/L，其他過程及參數(shù)與實施例I相同。利用實施例I的回歸方程，計算出待測水樣的氟含量為O. 485mg/L，與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。實施例4、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行本實施例與實施例I不同的是步驟七中待測水樣濃度為lmg/L，其他過程及參數(shù)與實施例I相同。利用實施例I的回歸方程，計算出待測水樣的氟含量為I. 212mg/L，與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。實施例5、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行本實施例與實施例I不同的是步驟七中待測水樣濃度為5mg/L，其他過程及參數(shù)與試驗一相同。利用實施例I的回歸方程，計算出待測水樣的氟含量為5. 626mg/L，與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。
實施例6、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行本實施例與實施例I不同的是步驟七中待測水樣濃度為10mg/L，其他過程及參數(shù)與實施例I相同。利用實施例I的回歸方程，計算出待測水樣的氟含量為11. 302mg/L，與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。實施例7、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行本實施例與實施例I不同的是步驟七中待測水樣濃度為20mg/L，其他過程及參數(shù)與實施例I相同。利用實施例I的回歸方程，計算出待測水樣的氟含量為21. 446mg/L,與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。實施例8、一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法按以下步驟進行本實施例與實施例I不同的是步驟七中待測水樣濃度為50mg/L，其他過程及參數(shù)與實施例I相 同。利用實施例I的回歸方程，計算出待測水樣的氟含量為52. 181mg/L，與實際值相差無幾，準(zhǔn)確度高。
權(quán)利要求
1.一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，其特征在于該方法按以下步驟進行 一、配置LB液體培養(yǎng)基； 二、將菌液濃度為IO6 109cuf/mL的0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基按體積比為(Γ2)1000混合，在溫度為3Γ40 的條件下，培養(yǎng)擴llh，至平臺期，得到平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液； 三、將步驟二得到的平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基按體積比為I :(9(Γ110)混合，得到檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液； 四、將不同氟含量的水樣與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液按體積比為(1 2) :1000分別混合，在溫度為34 40°C的條件下，震蕩培養(yǎng)4 6h，得到不同濃度的含氟菌液；然后取每個濃度的含氟菌液，在熒光顯微鏡下進行熒光強度檢測，利用圖像軟件顯微分析系統(tǒng)量化熒光強度以表征細菌生長狀況，建立菌液熒光強度與氟含量的關(guān)系曲線和回歸方程y=_8. 6575x+994. 36 ;其中x為含氟水樣的氟濃度，y為含氟菌液的熒光強度；不同氟含量的水樣中氟濃度分別為 O. 01mg/L、0. 05mg/L、0. Img/L、0. 5mg/L、lmg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L 和 50mg/L ； 五、取待測水樣，加入到步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液中，在溫度為3Γ40 的條件下，震蕩培養(yǎng)4 6h，測量菌液熒光強度，利用步驟四獲得的回歸方程計算待測水樣中的氟含量；其中待測水樣的與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液的體積t匕(I 2) 1000o
2.權(quán)利要求I所述的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，其特征在于步驟二中0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與步驟一的LB液體培養(yǎng)基的體積比為I. 5 1000ο
3.權(quán)利要求I或2所述的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，其特征在于步驟二中培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為IOh。
4.權(quán)利要求3所述的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，其特征在于步驟三中步驟二得到的平臺期0P50-GFP大腸桿菌菌株菌液與LB液體培養(yǎng)基的體積比為I :100。
5.權(quán)利要求3所述的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，其特征在于步驟四中不同氟含量的水樣中的水為蒸餾水。
6.權(quán)利要求3所述的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，其特征在于步驟四中不同氟含量的水樣與步驟三得到的檢測水體中氟含量的培養(yǎng)菌液的體積比為1.5 :1000。
7.權(quán)利要求3所述的一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，其特征在于步驟四和步驟五中振蕩培養(yǎng)的溫度條件均為37°C，時間為5h。
全文摘要
一種利用發(fā)光細菌檢測水體中氟含量的方法，它涉及一種檢測水體中氟含量的方法，本發(fā)明是為解決現(xiàn)有的檢測水體中氟含量的方法存在的對設(shè)施要求高、操作復(fù)雜、成本昂貴的技術(shù)問題，該檢測方法過程如下一、配置LB液體培養(yǎng)基；二、培養(yǎng)OP50-GFP大腸桿菌菌株菌液至平臺期；三、在含菌液的新鮮LB液體培養(yǎng)基中加入不同含量的氟進行培養(yǎng)；四、通過熒光強度表征細菌生長狀況；五、建立菌液發(fā)光強度和氟含量的關(guān)系曲線和回歸方程；六、在含菌液的新鮮LB液體培養(yǎng)基中加入待測水樣，檢測其熒光強度，計算水樣中的氟含量，本發(fā)明具有用時少，成本低，準(zhǔn)確度、感度高，直觀便捷，操作簡單等優(yōu)點，因此廣泛應(yīng)用于環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測領(lǐng)域。
文檔編號G01N21/64GK102914528SQ20121040063
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者侯曉麗, 王云彪, 張風(fēng)君 申請人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所