一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的方法及模型建立方法

專利名稱：一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的方法及模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的方法及模型建立方法。
背景技術(shù)：
中藥是中醫(yī)臨床預(yù)防及治療疾病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有多成分、多靶點和多途徑整體的特點。然而中藥成分復(fù)雜，挖掘和闡釋中藥活性物質(zhì)成分是研發(fā)安全有效、質(zhì)量可控的現(xiàn)代中藥的基礎(chǔ)，是揭示中藥科學(xué)內(nèi)涵、指導(dǎo)臨床合理用藥的前提。長期以來，中藥藥效活性成分研究的主流模式主要是借鑒國外對天然產(chǎn)物活性成分研究的基本策略[1_3]。這樣的研究模式對一些中藥藥效活 性成分的闡明起到了積極作用，如青蒿素的發(fā)現(xiàn)M。然而傳統(tǒng)方法需要將所有部分逐一提取、分離得到單體，再做藥效活性篩選，不僅實驗周期長，成本高，而且還會出現(xiàn)活性成分易丟失，純度與活性背離的問題[5]。日本科學(xué)家曾在過去數(shù)十年里試圖從中草藥中提取藥效活性成分，但未獲得成功[6]。靶細胞提取或脂質(zhì)體色譜固定相已用于藥物成分的初步篩選，但篩選的成分是否為真正的活性成分還有待進一步探討。近年來，針對體外抗氧化活性篩選模型，建立了高效液相色譜在線篩選方法[8’9]，該方法直觀、快速，但需要改裝儀器和柱后反應(yīng)通道，且藥理學(xué)模型特殊(僅用于抗氧化活性成分的篩選)，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。上述中藥藥效活性成分的篩選方法也不能體現(xiàn)多成分對藥效指標綜合作用的特點。通過高效液相色譜指紋圖譜與藥效指標進行關(guān)聯(lián)確定可能的藥效相關(guān)成分亦有報道，這些方法均采用相對峰面積代替成分含量進行篩選[1(U1]。由于色譜指紋圖譜的相對峰面積不能反映這些成分實際含量，因此篩選結(jié)果有待商榷。對于中藥這種復(fù)雜體系，尋找簡便、快速、準確且通用的中藥藥效相關(guān)成分的篩選方法一直是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。隨著計算機信息技術(shù)的迅猛發(fā)展，一些先進方法已應(yīng)用于中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，不僅加速了中藥藥效活性成分的發(fā)現(xiàn)和辨識，而且也減少了盲目性和偶然性，為中藥活性成分的篩選提供了先進的技術(shù)手段。參考文獻[I]李萍，齊煉文，聞曉東，盛亮洪.中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究的思路與方法[J] ·中國天然藥物，2007，5 (I) : 1-9.[2]熊清平，張強華，石瑩瑩.基于代謝組學(xué)的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路與方法[J],現(xiàn)代中藥研究與實踐，2011，25 (6) :97-99.[3] Li HJ, Jiang Y, Li P. Chemistry, bioactivity and geographicaldiversity of steroidal alkaloids from the Liliaceae family[J]· Natural ProductReports, 2006, 23(5) : 735-752.[4]Michelle Grayson. Traditional asian medicine[J]. Nature, 2011, 480:S81.[5]劉慶山，張梓倩，方亮，江一帆，尹小英.高通量技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，2012，37 (2) :134-137.
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發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，為了解決現(xiàn)有篩選中藥藥效相關(guān)成分時間周期長，成本高，通用性較差且可靠性有待考察的問題，本發(fā)明提供了一種能夠快速、簡單、準確且通用性較好的篩選中藥藥效相關(guān)成分的方法，該法能夠有效確定藥效相關(guān)成分，并能體現(xiàn)多成分對藥效指標綜合作用的特點。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的方法，步驟如下(I)以所研究中藥為對象，制備若干組化學(xué)成分濃度不同的供試品溶液；(2)選擇部分化學(xué)成分配制成不同濃度的溶液進行HPLC分析和/或?qū)⑼还┰嚻啡芤阂圆煌瑵舛冗M行HPLC分析，測定其濃度和峰面積，并考察峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系；(3)選擇在濃度與峰面積的線性范圍內(nèi)的若干組供試品溶液，并測定各自的HPLC指紋圖譜和對應(yīng)藥效指標;(4)在與峰面積呈線性關(guān)系的濃度范圍內(nèi)，采用線性回歸分析方法得到各成分的峰面積與藥效指標之間的相互關(guān)系，根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)和/或t檢驗結(jié)果的大小和正負確定藥效相關(guān)成分對藥效指標的作用，從而篩選出中藥藥效相關(guān)成分。所述步驟(I)中通過對所研究中藥的產(chǎn)地和/或提取工藝的變化來獲得化學(xué)成分濃度不同的供試品溶液。優(yōu)選的，選擇產(chǎn)地和/或提取工藝中不同因素和水平進行正交實驗，得到若干組化學(xué)成分濃度不同的供試品溶液。所述步驟(2)中選擇部分化學(xué)成分制成對照品溶液進行HPLC分析的方法是選擇部分化學(xué)成分配制成對照品混合溶液，并以該對照品混合液配制不同濃度的對照品溶液，然后進行HPLC分析，以各化學(xué)成分濃度為橫坐標，以各成分對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，考察峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系，確定各成分濃度的線性范圍。所述步驟(2)中將同一供試品溶液以不同濃度進行HPLC分析的方法是將同一供試品溶液制成供試液，分別以不同的進樣量進行HPLC分析，選擇全部或部分共有峰，以色譜分析的進樣量作為所選擇的共有峰所代表的化學(xué)成分的濃度單位，并以該濃度單位作為橫坐標，以該共有峰對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，考察峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系，確定各成分濃度的線性范圍。它還包括取若干已知對照品進行HPLC分析，從而對所研究中藥圖譜對應(yīng)色譜峰進行定性分析的步驟。所述步驟(2)中的部分成分并不限定成分數(shù)量，只是為了研究問題的方便。為了體現(xiàn)各種成分對藥效指標的綜合作用，成分數(shù)量應(yīng)大于I。所述步驟(4)還包括根據(jù)各成分與藥效指標建立的數(shù)學(xué)表達式體現(xiàn)各成分對藥效指標的綜合作用，所述數(shù)學(xué)表達式為藥效是各成分的濃度與其標準化回歸系數(shù)的乘積之和。本發(fā)明的另一目的是提供一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的模型建立方法，步驟如 下?lián)袢≈兴幹卸鄠€化學(xué)成分，采用正交試驗設(shè)計將各成分看作試驗因素按不同濃度水平組合安排各次試驗樣品，然后在25°C室溫下，采用高效液相色譜儀對正交試驗設(shè)計的各次試驗樣品測定得到高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。對各次試驗樣品測定對應(yīng)藥效指標。采用線性回歸分析方法建立HPLC指紋圖譜各色譜峰面積與藥效指標之間的相互關(guān)系。在濃度線性范圍內(nèi)，用峰面積代替成分含量與藥效指標計算的標準化回歸系數(shù)是一致的。根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)的大小及統(tǒng)計檢驗結(jié)果確定藥效相關(guān)成分；根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)的正負確定藥效相關(guān)成分對藥效指標的正向或負向作用；根據(jù)各成分與藥效指標建立的數(shù)學(xué)表達式體現(xiàn)多成分對藥效指標的綜合作用。具體而言，所述模型建立方法是以下步驟(I)以所研究中藥為對象，擇取中藥中所含多個(數(shù)量大于I個)已知的化學(xué)成分；(2)將這些化學(xué)成分配制成對照品混合溶液，然后進行HPLC分析，以各化學(xué)成分濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，考察色譜峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系，確定各成分濃度的線性范圍。(3)將這些化學(xué)成分作為因素，在濃度線性范圍內(nèi)，采用正交試驗設(shè)計將這些化學(xué)成分按不同濃度水平進行組合，得到各次試驗樣品。(4)在25°C室溫下，采用高效液相色譜儀采集上述各次試驗樣品的原始高效液相色譜指紋圖譜；(5)將上述所得的各次試驗樣品HPLC指紋圖譜各色譜峰按照保留時間相近的原則進行色譜峰匹配；(6)將上述取得的各次試驗樣品進行藥理學(xué)實驗，測定相應(yīng)的藥效指標；(7)采用線性回歸分析法將匹配后的各次試驗樣品HPLC指紋圖譜色譜峰面積與對應(yīng)藥效指標進行關(guān)聯(lián)建立數(shù)學(xué)模型(即采用線性回歸分析建立數(shù)學(xué)模型)，計算各個成分對應(yīng)的標準化回歸系數(shù)；(8)根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)的大小及統(tǒng)計檢驗結(jié)果確定與藥效相關(guān)的成分；根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)的正、負確定藥效相關(guān)成分對藥效指標的正向或負向作用；根據(jù)各成分與藥效指標建立的數(shù)學(xué)表達式體現(xiàn)各成分對藥效指標的綜合作用。(9)對上述確定藥效相關(guān)成分進行實驗驗證。
優(yōu)選的，所述步驟(7)中，所述HPLC指紋圖譜色譜峰面積是指在色譜峰面積與對應(yīng)成分濃度線性關(guān)系良好(在濃度線性范圍內(nèi))的條件下，基于色譜峰面積與藥效指標計算的標準化回歸系數(shù)和基于成分含量與藥效指標計算的標準化回歸系數(shù)是一致的。因此可以采用指紋圖譜色譜峰面積代替成分含量與藥效指標建立數(shù)學(xué)模型。優(yōu)選的，所述步驟(7)中，所述數(shù)學(xué)模型中，用HPLC指紋圖譜色譜峰面積代替成分含量與藥效指標進行關(guān)聯(lián)建立數(shù)學(xué)模型是通過數(shù)學(xué)證明得到的。本發(fā)明的方法簡便、易行、可靠且通用性好，并能體現(xiàn)多成分對藥效指標綜合作用的特點，適于中藥復(fù)雜體系的藥效相關(guān)成分的篩選，為中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)和篩選提供技術(shù)數(shù)據(jù)支持。


圖1-1為25°C的室溫下，采用Agilent 1260型高效液相色譜儀取得的代表性黃芪 藥材5個成分對照品混合液原始高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。圖1-2為正交試驗設(shè)計(L16 (45)) 16次試驗樣品的原始HPLC指紋圖譜經(jīng)中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A (國家藥典委員會)按保留時間數(shù)據(jù)進行匹配后得到的各次試驗樣品的HPLC指紋圖譜。圖1-3為DPPH溶液與黃芪藥材中5種成分溶液在400nm 600nm范圍內(nèi)紫外吸
收光譜。圖1-4為黃芪甲苷及芒柄花素與DPPH自由基反應(yīng)時間曲線。圖2-1為黃芪藥材與對照品HPLC圖譜(I.毛蕊異黃酮苷2.毛蕊異黃酮3.芒柄花素)。圖2-2為黃芪藥材指紋圖譜的共有峰圖譜。圖2-3為正交設(shè)計各次實驗的HPLC指紋圖譜。圖2-4為黃芪樣本的I1Ai1圖一。圖2-5為色譜峰的標準化回歸系數(shù)一。圖2-6為PLSR模型的VIP圖一。圖2-7為黃芪樣本的I1Ai1圖二。圖2-8為色譜峰的標準化回歸系數(shù)二。圖2-9為PLSR模型的VIP圖二。圖2-10為黃芪藥材部分色譜峰紫外光譜及一級質(zhì)譜圖(分別為圖2-2中編號8、13、14、15、16、17、18所代表的色譜峰的紫外光譜和一級質(zhì)譜圖)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。實施例I所用中藥黃芪藥材；所用藥效指標清除DPPH自由基活性(DPPH自由基清除率)。雖然以中藥黃芪和清除DPPH自由基活性藥效指標為例，但本發(fā)明所述方法對所用中藥及藥效指標并無限制。I. I對照品溶液的配制精密稱取黃芪藥材中所含的4種化學(xué)成分山奈酚、槲皮素、毛蕊異黃酮及芒柄花素的標準品各約5mg、5mg、2mg和2mg,加甲醇溶解并分別定容于IOmL棕色容量瓶中，即得各個成分儲備液；精密稱取黃芪甲苷標準品約10mg，加甲醇溶解并定容于5mL棕色容量瓶中，即得其儲備液。對照品溶液進樣前用0.45 μ m微孔濾膜過濾。精密稱取維生素C 10mg，加甲醇溶解并定容于IOmL棕色容量瓶中，即得維生素C儲備液，作為陽性對照；精密稱取維生素E 25mg,加甲醇溶解并定容于IOmL棕色容量瓶中，即得維生素E儲備液(應(yīng)立即在4°C溫度下保存)，作為陽性對照。I. 2DPPH標準溶液的配制及DPPH自由基清除率的計算精密稱取DPPH約5mg，用甲醇溶解并定容于50mL的棕色容量瓶當中，即得DPPH儲備液。DPPH自由基清除率由式(I)計算得到
DPPH ■_ (%) = (VX100
\J⑴式⑴中[DPPH · ] t=40和[DPPH · ] t=0分別表示時間為40分鐘和O分鐘時的DPPH自由基的濃度。該濃度可以采用紫外分光光度法在515nm處通過吸光度A與DPPH自由基濃度的回歸曲線(A=O. 0273 X [DPPH ·]+0. 0229，相關(guān)系數(shù)的平方R2=O. 9997)計算得到。由圖1-3可見，DPPH自由基在515nm處有吸收峰，而其它成分不干擾DPPH吸光度的測定。DPPH標準曲線的測定方法如下將98. 4μ g · mPDPPH甲醇溶液依次稀釋，得到6個不同濃度的DPPH 甲醇溶液(98. 4 μ g *mL S 49. 2 μ g *mL 1, 24. 6 μ g *mL \ 6. 15 μ g *mL 1, 3. 075 μ g *mL SI. 538 μ g .mL-1)，在515nm處測定上述各個濃度下的吸光度值(純甲醇作為空白)，以DPPH濃度(μ g · mL—1)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。I. 3色譜條件色譜柱PhenomexSynergi Hydro-RP C18 (250mmX 4. 6mm, 4 μ m);流動相乙臆(A)-水(B)，梯度洗脫(0min，25%乙腈；20min，45%乙腈);DAD設(shè)定波長范圍19(T400nm，色譜檢測波長采用切換波長法(Omin, 254nm ；15. 8min, 203nm ；17min, 254nm);柱溫25°C ;流速lmL/min ;進樣量10 μ L,分析時間為28min。I. 4線性范圍精密量取5種黃芪對照品儲備液，加甲醇制成含槲皮素62. 8 μ g/mL、山奈酚56. 5 μ g/mL、黃苗甲苷880. O μ g/mL、芒柄花素27. 5 μ g/mL、毛蕊異黃酮29. I μ g/mL的混合溶液，作為混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液O. lmL、0. 2mL、0. 5mL、ImL, I. 5mL和2mL，置于2mL容量瓶中，加甲醇定容，精密吸取10 μ L，進行HPLC分析，如圖1_1所示。以對照品濃度X ( μ g/mL)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，各對照品回歸方程及線性范圍如表1-1所示，5種成分在測定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。表1-1黃芪藥材所含的5種成分的線性回歸結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的方法，其特征是，步驟如下 (1)以所研究中藥為對象，制備若干組化學(xué)成分濃度不同的供試品溶液； (2)選擇部分化學(xué)成分配制成不同濃度的溶液進行HPLC分析和/或?qū)⑼还┰嚻啡芤阂圆煌瑵舛冗M行HPLC分析，測定其濃度和峰面積，并考察峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系; (3)選擇在濃度與峰面積的線性范圍內(nèi)的若干組供試品溶液，并測定各自的HPLC指紋圖譜和對應(yīng)藥效指標； (4)在與峰面積呈線性關(guān)系的濃度范圍內(nèi)，采用線性回歸分析方法得到各成分的峰面積與藥效指標之間的相互關(guān)系，根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)和/或t檢驗結(jié)果的大小和正負確定藥效相關(guān)成分對藥效指標的作用，從而篩選出中藥藥效相關(guān)成分。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征是，所述步驟(I)中通過對所研究中藥的產(chǎn)地和/或提取工藝的變化來獲得化學(xué)成分濃度不同的供試品溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，選擇產(chǎn)地和/或提取工藝中不同因素和水平進行正交實驗，得到若干組化學(xué)成分濃度不同的供試品溶液。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征是，所述步驟(2)中選擇部分化學(xué)成分制成對照品溶液進行HPLC分析的方法是選擇部分化學(xué)成分配制成對照品混合溶液，并以該對照品混合液配制不同濃度的對照品溶液，然后進行HPLC分析，以各化學(xué)成分濃度為橫坐標，以各成分對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，考察峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系，確定各成分濃度的線性范圍。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征是，所述步驟(2)中將同一供試品溶液以不同濃度進行HPLC分析的方法是將同一供試品溶液制成供試液，分別以不同的進樣量進行HPLC分析，選擇全部或部分共有峰，以色譜分析的進樣量作為所選擇的共有峰所代表的化學(xué)成分的濃度單位，并以該濃度單位作為橫坐標，以該共有峰對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，考察峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系，確定各成分濃度的線性范圍。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征是，它還包括取若干已知對照品進行HPLC分析，從而對所研究中藥圖譜對應(yīng)色譜峰進行定性分析的步驟。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征是，所述步驟(4)還包括根據(jù)各成分與藥效指標建立的數(shù)學(xué)表達式體現(xiàn)各成分對藥效指標的綜合作用，所述數(shù)學(xué)表達式為藥效是各成分的濃度與其標準化回歸系數(shù)的乘積之和。
8.一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的模型建立方法，其特征是，步驟如下所述方法是通過以下步驟建立的 (O以所研究中藥為對象，擇取中藥中所含多個已知的化學(xué)成分； (2)將這些化學(xué)成分配制成對照品混合溶液，然后進行HPLC分析，以各化學(xué)成分濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，考察色譜峰面積與對應(yīng)成分濃度的線性關(guān)系，確定各成分濃度的線性范圍； (3)將這些化學(xué)成分作為因素，在濃度線性范圍內(nèi)，采用正交試驗設(shè)計將這些化學(xué)成分按不同濃度水平進行組合，得到各次試驗樣品； (4)在25°C室溫下，采用高效液相色譜儀采集上述各次試驗樣品的原始高效液相色譜指紋圖譜；(5)將上述所得的各次試驗樣品HPLC指紋圖譜各色譜峰按照保留時間相近的原則進行色譜峰匹配； (6)將上述取得的各次試驗樣品進行藥理學(xué)實驗，測定相應(yīng)的藥效指標； (7)采用線性回歸分析法將匹配后的各次試驗樣品HPLC指紋圖譜色譜峰面積與對應(yīng)藥效指標進行建立線性回歸數(shù)學(xué)模型，計算各個成分對應(yīng)的標準化回歸系數(shù)； (8)根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)的大小及統(tǒng)計檢驗結(jié)果確定與藥效相關(guān)的成分；根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)的正、負確定藥效 相關(guān)成分對藥效指標的正向或負向作用；根據(jù)各成分濃度與其標準化回歸系數(shù)的乘積之和體現(xiàn)各成分對藥效指標的綜合作用； (9)對上述確定藥效相關(guān)成分進行實驗驗證。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選中藥藥效相關(guān)成分的方法及模型建立方法，步驟如下以所研究中藥為對象，制備若干組化學(xué)成分濃度不同的供試品溶液；選擇部分化學(xué)成分進行HPLC分析，考察峰面積與濃度的線性關(guān)系；選擇線性范圍內(nèi)的若干組供試品溶液，測定各自的HPLC指紋圖譜和藥效指標；在線性關(guān)系范圍內(nèi)，采用線性回歸分析方法得到各成分的峰面積與藥效指標之間的相互關(guān)系，根據(jù)各成分標準化回歸系數(shù)和/或t檢驗結(jié)果的大小和正負確定藥效相關(guān)成分對藥效指標的作用，從而篩選出中藥藥效相關(guān)成分。本發(fā)明的方法簡便、易行、可靠且通用性好，并能體現(xiàn)多成分對藥效指標綜合作用的特點，適于中藥復(fù)雜體系的藥效相關(guān)成分的篩選，為中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)和篩選提供技術(shù)數(shù)據(jù)支持。
文檔編號G01N30/02GK102879486SQ201210324140
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日
發(fā)明者聶磊, 鄧書鴻, 姜紅, 宋麗, 段小菊, 張丹潞, 魏敏 申請人:山東大學(xué)