專利名稱：一種載脂蛋白e檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人載脂蛋白E的檢測試劑盒。
背景技術：
載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)是一種多態(tài)性蛋白，參與脂蛋白的轉化與代謝過程，其基因可以調節(jié)許多生物學功能，對ApoE及其基因多態(tài)性的研究是目前醫(yī)學研究的熱點之一。人群中ApoE多態(tài)性存在種族變異，不同人群中ApoE基因型高度不同。歐洲人ε4等位基因頻率從北到南呈下降趨勢的分布。亞洲人ε 4頻率低，相比之下，非洲人及巴布比 亞和新幾內亞ε 4頻率高。許多證據(jù)認為，ApoE多態(tài)性是動脈粥樣硬化早期及發(fā)展過程中個體差異的主要原因。大量人群調查發(fā)現(xiàn)ε4等位基因的一般作用是可以顯著地升高健康人的總膽固醇濃度，使之易患動脈粥樣硬化，相反，ε 2等位基因的一般作用是降低膽固醇濃度，其降低效應是ε 4升高膽固醇的2 3倍。ApoE等位基因變異還與血漿ApoB濃度、甘油三酯及血管收縮壓有關。ε 2等位基因對冠狀動脈硬化的發(fā)展有防護作用，經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，患心血管疾病如心肌梗塞幸存者，或血管造影證明有動脈粥樣硬化者，比其對照組的ε 4等位基因頻率高。ΑροΕ4/3雜合子比Ε3/2和Ε3/3基因型者發(fā)生心肌梗塞年齡早。ApoE多態(tài)性變異還與腎病綜合癥、糖尿病有關。值得重視的是ApoE多態(tài)性與老年性癡呆病(AD)的關系。1993年，Rose研究發(fā)現(xiàn)，晚發(fā)性家族型AD病人ε 4頻率增多，還發(fā)現(xiàn)ApoE和來源于淀粉樣前體蛋白的小多肽A β的未和力很聞。其后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)AD病人中攜帶ε 4等位基因者占46. 2%,而對照組占13. 2%。還發(fā)現(xiàn)攜帶二個ε 4等位基因的研究對象比攜帶一個ε 4的研究對象發(fā)生AD年齡早，比不攜帶ε 4等位基因的研究對象發(fā)生AD年齡更早，1994年，Schacher等人相繼報道百歲老人普遍攜帶ε 2基因。。這一發(fā)現(xiàn)使ApoE多態(tài)性和研究向前邁出了一大步。有報道高老年人攜帶ε2等位基因數(shù)量是年青人的2倍。因此ε2等位基因似乎不僅可以保護人們免患AD，而且還與長壽有關。ApoE多態(tài)性與AD的關系，目前的研究主要集中在腦代謝中與A β或Tau蛋白以及神經(jīng)元生長和分枝等有關?？傊?，在研究高脂血癥評定心腦血管疾病的危險因素方面，以ApoE多態(tài)性為手段進行研究有重要的臨床意義。有學者認為，基因型的“壞”(ε 4)和“好”(ε 2)的等位基因之間的平衡，可作為基因分析應用于醫(yī)學檢驗領域，協(xié)助臨床疾病的診斷。載脂蛋白E測定方法很多，包括(一)放射免疫測定法(RIA)、(二)酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、(三)乳膠凝集試驗和免疫比濁法、(四)熒光免疫測定法。這些方法具有操作繁瑣、耗時長、過度浪費資源的缺點，不適于常規(guī)檢驗
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種載脂蛋白E的檢測試劑盒。該試劑盒可直接應用于全自動生化分析儀上，結果準確性強、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。本發(fā)明的另一目的是提供上述檢測試劑盒的生產(chǎn)制備及使用方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒組成為
試劑Rl :緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；
試劑R2 :緩沖液、結合有載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。本發(fā)明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下
(a)按下列比例配制好試劑試劑Rl
Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I,
疊氮鈉1-5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200-220mmol/L
結合有載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子 3. 5-5% (v/v)
吐溫-20l-5mmol/L
疊氮鈉O. 5-3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
(b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應；
(c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值；
Cd)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中載脂蛋白E的濃度。
具體實施例方式下述實施例是為了更詳細的解釋本發(fā)明，但不應理解為本發(fā)明局限于此。實施例I :
本發(fā)明的試劑盒舉例是雙試劑，其中
試劑Rl
Tris 緩沖液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L 結合有載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。實施例2 :試劑盒使用方法
I.試劑準備，試劑為液體雙試劑，開瓶即用，其中
試劑Rl
Tris 緩沖液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L 結合有載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自動生化儀參數(shù)設置
(a)檢測溫度37°C
(b)檢測波長主波長為340nm；
(c)反應時間10分鐘。3.檢測步驟(全部在全自動生化分析儀中完成)
(a)取180μ L試劑I和3 μ L血清樣本混勻；
(b)將混勻后的溶液在37°C溫育5分鐘，讀取吸光度Al；
(c)再添加60μ L試劑2，反應5分鐘后，讀取吸光度Α2 ；
(d)計算ΛA= Α2 - Al。4.通過吸光度變化值計算出載脂蛋白E的濃度。本發(fā)明具有的優(yōu)點
該試劑盒結果準確性強、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。所需檢測儀器(生化分析儀)在各大醫(yī)院和檢測中心普遍使用。
權利要求
1.一種載脂蛋白E檢測試劑盒，其組成為試劑R1、試劑R2，其中 a、試劑Rl 包括200-220mmol/L Tris 緩沖液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 疊氮鈉、l-5mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白； b、試劑R2200-220mmol/L Tris緩沖液、結合有載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子、l_5mmol/L 吐溫 _20、0. 5-3 mmol/L 疊氣納、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸納、l-5mmol/L 牛血清白蛋白。
2.權利要求I的試劑盒，其特征在于試劑R2中的載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子的制備方法為10. 5mg/ml的載脂蛋白E單克隆抗體與10%的乳膠顆粒(直徑50_100nm)，加入到200-220mmol/L Tris緩沖液中，震蕩反應4小時，離心去上清，再用200-220mmol/LTris緩沖液稀釋至O. 5%，并加入O. 1-0. 3 mmol/L疊氮鈉。
3.上述試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為 (a)按下列比例配制好試劑 試劑Rl Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 疊氮鈉1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L 試劑R2 Tris 緩沖液 200-220mmol/L 結合有載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子 3. 5-5% (v/v) 吐溫-20l-5mmol/L 疊氮鈉0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L (b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應； (c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值； Cd)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中載脂蛋白E的濃度。
4.權利要求3的方法，其特征在于，被測樣品與試劑比例應控制在I: 75到I :85之間。
5.權利要求3的方法，其特征在于，反應溫度為37(±1) °C。
6.權利要求3的方法，其特征在于，反應時間為10分鐘。
7.權利要求3的方法，其特征在于，用半/全自動生化分析儀檢測的波長為340nm。
全文摘要
一種載脂蛋白E檢測試劑盒。試劑盒盒體內包括試劑R1緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；試劑R2緩沖液、結合有載脂蛋白E單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列反應，再將反應物置于半/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度變化的速度，從而測算出載脂蛋白E的濃度大小。本試劑盒具有準確、穩(wěn)定、方便的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/577GK102818900SQ20121029168
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權日2012年8月16日
發(fā)明者謝兵 申請人:北京恩濟和生物科技有限公司