專利名稱：一種高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法。
背景技術(shù)：
QT間期指心電圖上測量心跳電循環(huán)中Q波與T波這個時(shí)間段，代表心肌細(xì)胞從去極化到復(fù)極化整個過程。長QT綜合癥(long QTsyndrome, LQTs)分為先天性長QT綜合癥(co ngenital long QT syndrome)和獲得性長 QT 綜合癥(acquired long QT syndrome) 先天性長QT綜合征是因編碼心肌細(xì)胞膜離子通道蛋白的基因突變導(dǎo)致離子通道功能障礙 而引起的。藥物是引起獲得性長QT綜合癥的重要原因。當(dāng)QT間期明顯延長時(shí)，可能導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)型室速(TdP)，TdP具有自限性，也可能進(jìn)一步發(fā)展為室顫引起死亡。引起獲得性長QT綜合癥的藥物幾乎都作用于一種特異性K+電流-快速激活的延遲整流鉀電流(IKr)。IKr是由位于第7對染色體上的人hERG，(也稱KCNH2)基因表達(dá)的產(chǎn)物。2005年起，G7各發(fā)達(dá)國家開始執(zhí)行由歐盟、日本和美國的藥品法規(guī)機(jī)構(gòu)和大型制藥企業(yè)聯(lián)合制定的關(guān)于心臟安全評估的S7B法規(guī)。隨著時(shí)間的推移，S7B法規(guī)將會逐漸被各國的藥物管理局和制藥公司所接受。據(jù)統(tǒng)計(jì)，259^40%的先導(dǎo)化合物都顯示出不同程度的hERG通道相關(guān)的心臟毒性。因此，候選藥物的hERG安全性評價(jià)是藥物開發(fā)過程中至關(guān)重要的一環(huán)。hERG通道安全性評價(jià)作為新藥臨床前試驗(yàn)一個很重要的部分，經(jīng)典的檢測方法采用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行評價(jià)，該方法實(shí)驗(yàn)設(shè)備較昂貴，對技術(shù)人員的要求較高，且由于手動膜片鉗技術(shù)自身缺陷使得hERG通道安全性評價(jià)效率很低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有高通量、自動化、高效率、操作簡便等特點(diǎn)的高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法。本發(fā)明的高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法，其特征在于，包括以下步驟常規(guī)培養(yǎng)表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株，然后棄去其培養(yǎng)基，將細(xì)胞株加入到固定緩沖液中，在細(xì)胞株的常規(guī)培養(yǎng)條件下孵育l_4h，然后棄去固定緩沖液，再加入含待檢藥物的固定緩沖液，孵育5-40min，再棄去含待檢藥物的固定緩沖液，用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞株，洗掉殘留Rb+，然后再加入離子通道開放緩沖液，孵育5-20min，移去細(xì)胞上清液，將細(xì)胞株裂解得細(xì)胞裂解液，分別測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+濃度；再將上述含待檢藥物的固定緩沖液中的待檢藥物設(shè)定為其他不同濃度，按照上述方法重復(fù)測定，根據(jù)不同濃度的待檢藥物的測定所得的數(shù)據(jù)，得到該待檢藥物的IC5tl值，如果IC5tl值< 1000 u mol/L就認(rèn)為該待檢藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用，IC5tl值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大。根據(jù)《2011藥品注冊的國際技術(shù)要求安全部分》，體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)的最高濃度為1000 u mol/L,因此如果IC5tl值彡1000 u mol/L就認(rèn)為該待檢藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用，IC5tl值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大,心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大；所述的固定緩沖液RbCl2-10mM, NaCl 120_180mM，CaCl2 l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2O. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量為水。每升固定緩沖液的配置方法為在水中加入RbCl 2-10mmol, NaCl 120-180mmol, CaCl2 l_3mmol，NaH2PO4O. 4-1. 2mmol, MgCl2O. 8-1. 2mmol, glucose 3_7mmol、HEPES 20-30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。所述的洗滌緩沖液KC12-10mM, NaCl 120_180mM，CaCl2l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2O. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量為水。每升洗滌緩沖液的配置方法為在水中加入KCl 2-10mmol, NaCl 120-180mmol, CaCl2 l-3 mmol,NaH2PO4O. 4-1. 2mmol, MgCl2O. 8-1. 2mmol, glucose 3_7mmol、HEPES 20-30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。所述的離子通道開放緩沖液KC120-80mM, NaCl 70_130mM，CaCl2l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量為水。每升離子通道開放緩沖液的配置方法為在水中加入KCl 20-80mmol, NaCl 70-130mmol, CaCl2l_3mmol，NaH2PO4 0.4-1. 2mmol, MgCl2 0.8-1. 2mmol, glucose 3-7mmol>HEPES 20-30mmol,待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290-320m0sm。所述的再將上述含待檢藥物的固定緩沖液中的待檢藥物設(shè)定為其他不同濃度，按照上述方法重復(fù)測定，優(yōu)選待檢藥物設(shè)置成濃度梯度10_4、3X10_5、10_5、3X10_6、10_6、3 X 10'10'3 X 10'10'3 X 10'KT9JXKT'KTiqM 等等。所述的表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株優(yōu)選為表達(dá)hERG通道的CHO細(xì)胞株或HEK 293細(xì)胞株。所述的常規(guī)培養(yǎng)表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株是常規(guī)培養(yǎng)表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株直至聚合度為80 90%。所述的將細(xì)胞株加入到固定緩沖液中，在細(xì)胞株的常規(guī)培養(yǎng)條件下，優(yōu)選孵育時(shí)間為2. 5h。所述的再加入含待檢藥物的固定緩沖液，孵育時(shí)間優(yōu)選為30min。所述的再加入離子通道開放緩沖液，孵育時(shí)間優(yōu)選為lOmin。所述的固定緩沖液優(yōu)選為RbCl5. 4mM, NaCl 150mM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM,MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量為水。所述的洗滌緩沖液優(yōu)選為KC15. 4mM, NaCl 150mM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM,MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量為水。所述的離子通道開放緩沖液優(yōu)選為KC1 50mM, NaCl IOOmM, CaCl2 2mM, NaH2PO4
0.8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM,余量為水。所述的固定緩沖液、洗滌緩沖液和離子通道開放緩沖液的pH值優(yōu)選為7. 4。所述的將細(xì)胞裂解得細(xì)胞裂解液優(yōu)選是用裂解液裂解細(xì)胞20min得細(xì)胞裂解液，每IOOml裂解液為每IOOml的離子通道開放緩沖液中含有Iml Triton X-100。其配置方法為在每IOOml離子通道開放緩沖液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，過濾分裝，4
度保存待用。所述的分別測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+濃度優(yōu)選是利用ICR 8000離子通道閱讀器測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+濃度。ICR 8000是一類中高通量的篩選儀器，每天能處理5000個樣品。它是自動原子吸收光譜測量儀，能準(zhǔn)確監(jiān)視流經(jīng)離子通道的離子流量，如K+，Na+，Rb+等，從而反映出離子的濃度變化。本發(fā)明中的HEPES是4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N- (2-羥乙基)哌嗪-N’ _2_乙烷磺酸。本發(fā)明根據(jù)hERG通道對Rb+和K+的通透性是類似，且野生型或表達(dá)了 hERG通道的CHO或HEK293細(xì)胞株都不含有Rb+，然后在表達(dá)hERG通道的CHO或HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系 上，固定緩沖液中含有Rb+而不含K+，使非放射性的銣元素來替代鉀，通過hERG通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后再用待測藥物孵育細(xì)胞株，再用不含Rb+洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞株，洗掉細(xì)胞株外的Rb+，再加入離子通道開放緩沖液，如果待測藥物對hERG通道沒有抑制，那么細(xì)胞株中的Rb+就會流出細(xì)胞外，進(jìn)入上清液中，直至平衡，如果有抑制作用，導(dǎo)致hERG通道受到抑制的話，那么流出至細(xì)胞外上清液中的Rb+就會減少，抑制作用越大，即導(dǎo)致hERG通道受到抑制越多，流入細(xì)胞外上清液中的Rb+就越少，也就說明該待檢藥物對hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大。本發(fā)明使用非放射性銣流量分析法間接地檢測待檢藥物對hERG通道的作用，從而了解該藥物對心肌毒性的大小。本發(fā)明方法簡便、所需設(shè)備簡單、對技術(shù)人員要求不高，高通量，效率高，如用ICR 8000離子通道閱讀器測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+濃度，每天可以處理5000個樣品，一個人一天可以實(shí)現(xiàn)處理1000個樣品的檢測，而傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)只能檢測廣2樣品，實(shí)現(xiàn)了高通量的檢測，使得效率大大的提高，并實(shí)現(xiàn)了自動化。由此可見，本發(fā)明的高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法具有高通量、自動化、高效率、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，為新藥臨床前評價(jià)其對hERG通道安全性提供了簡便有效的方法，大大加快了新藥的篩選。
圖I是陽性藥Terfenadine的量效曲線；圖2是陽性藥verapamil的量效曲線；圖3是陽性藥多潘立酮的量效曲線；圖4是陰性藥鹽酸環(huán)丙沙星的量效曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :(I)細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)了 hERG通道的CHO細(xì)胞株(現(xiàn)有技術(shù)中已有)接種于HamsF-12培養(yǎng)基中，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
(2)種板取狀態(tài)良好，聚合度達(dá)到90%的細(xì)胞株以每孔50000個的密度種于96孔板中，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。(3)固定Rb+ :待細(xì)胞長至覆蓋孔底90%左右，棄孔中培養(yǎng)基，加200 ii L的固定緩沖液，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中孵育2. 5h。(4)藥物處理?xiàng)壐骺字械墓潭ň彌_液，加入用固定緩沖液配置的待檢藥物，孵育30mino(5)洗滌棄各孔中含待檢藥物的固定緩沖液，加200 U L的洗滌緩沖液于96孔板各孔洗掉殘留Rb+，重復(fù)三次。(6)通道激活加200 u L離子通道開放緩沖液于各孔，孵育lOmin，將細(xì)胞上清液移至另一全新96孔板。(7)細(xì)胞裂解加200 u L裂解液于各孔，裂解細(xì)胞20min，得細(xì)胞裂解液。 (8) ICR8000樣品分析用ICR8000分別測定細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液中Rb+濃度。上清液及細(xì)胞裂解液中Rb+濃度分別為[Rb+]e、[Rb+]i。ICR8000是一種原子吸收分光光度法，一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借比較對照品溶液和供試品溶液的吸光度，求得供試品中待測Rb+的濃度。(9)數(shù)據(jù)處理:用[Rb+]e、[Rb+]i，求得[Rb+]流量，[Rb+]流量=([Rb+]e/([Rb+]e+[Rb+]i))。將得到的不同的濃度梯度(至少5個濃度)待檢藥物和[Rb+]流量值輸入到Original 6 (Sigmaplot)數(shù)據(jù)處理軟件中利用邏輯斯蒂方程擬合IC5tl曲線，獲得待檢藥物的IC5tl值。一般IC5tl值小于等于lOOOumol/L就認(rèn)為該藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用。IC5tl值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大。(10)各種試劑配方和配置方法待檢藥物濃度梯度設(shè)置為:10_4、3X10_5、10_5、3X10_6、10_6、3X10_7、10_7、3X10_8、Io-8Jxio-9Uo-9Jxio-iqUo-iqM等等。用固定緩沖液配置的待檢藥物，是在固定緩沖液中加入待檢藥物，使其濃度為上面的梯度濃度。然后按照上述方法進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。固定緩沖液RbCl5. 4mM, NaCl 150mM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2ImM,glucose 5mM, HEPES 25mM，余量為水。每升固定緩沖液的配置方法為在水中加入RbCl
5.4mmol, NaCl 150mmol，CaCl2 2mmol，NaH2PO4 0.8mmol, MgCl2 lmmol, glucose 5mmol，HEPES 25mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290-320 mOsm。洗滌緩沖液KC15. 4mM, NaCl 150mM, CaCl22mM, NaH2PO4O. 8mM, MgCl2ImM, glucose5mM、HEPES 25mM，余量為水。每升洗滌緩沖液的配置方法為在水中加入KCl 5. 4mmol,NaCl 1 SOmmoI , CaCl2 2mmoI, NaH2PO4 0. 8mmol, MgCl2 lmmol, glucose 5mmol、HEPES25mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。離子通道開放緩沖液KC150mM, NaCl IOOmM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量為水。每升離子通道開放緩沖液的配置方法為，在水中加入 KCl SOmmoI, NaCl IOOmmol, CaCl2 2mmol, NaH2PO4 0. 8mmol, MgCl2 lmmol, glucose5mmol, HEPES 25mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。
裂解液l%Triton X_100，溶劑為離子通道開放緩沖液。其配置方法為在每IOOml離子通道開放緩沖液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，過濾分裝，4度保存待 用。本實(shí)施例的待檢藥物為對hERG通道呈陽性的陽性藥Terfenadine、verapamil和多潘立酮，以及對hERG通道呈陰性的陰性藥鹽酸環(huán)丙沙星，按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置的待測藥物濃度梯度如圖中的橫坐標(biāo)所示，其結(jié)果如圖所示，圖I是陽性藥Terfenadine的量效曲線；圖2是陽性藥verapamil的量效曲線；圖3是陽性藥多潘立酮的量效曲線；圖4是陰性藥鹽酸環(huán)丙沙星的量效曲線。由圖中可以看出，Terfenadine的IC5tl為67. 3 y mol/L,verapamil 的 IC50 ^ 25. 8 u mol/L、多潘立酮的 IC50 ^ 86. 5 u mol/L,這三個藥物 IC50 都小于IOOOii mol/L，判斷這些藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于IOOOumol/L，說明該藥物對hERG通道的抑制作用很大，心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)很大，這與現(xiàn)有技術(shù)中對這三種藥物的心肌毒性的評定的結(jié)論一致，而鹽酸環(huán)丙沙星的IC5tl為3902. 8 u mol/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1000umol/L,判斷其對hERG通道不具有阻滯作用，無心肌毒性，這與現(xiàn)有技術(shù)中對這種藥物的心肌毒性的評定的結(jié)論也是一致的，由此可見，利用本發(fā)明的高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法評價(jià)待檢藥物對心肌的毒性是可行的。實(shí)施例2 (I)細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)了 hERG通道的CHO細(xì)胞株(現(xiàn)有技術(shù)中已有)接種于HamsF-12培養(yǎng)基中，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。(2)種板取狀態(tài)良好，聚合度達(dá)到90%的細(xì)胞株以每孔50000個的密度種于96孔板中，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。(3)固定Rb+ :待細(xì)胞長至覆蓋孔底90%左右，棄孔中培養(yǎng)基，加200 ii L的固定緩沖液，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中孵育lh。(4)藥物處理?xiàng)壐骺字械墓潭ň彌_液，加入用固定緩沖液配置的待檢藥物，孵育40mino(5)洗滌棄各孔中含待檢藥物的固定緩沖液，加200 u L的洗滌緩沖液于96孔板各孔洗掉殘留Rb+，重復(fù)三次。(6)通道激活加200 y L離子通道開放緩沖液于各孔，孵育5min，將細(xì)胞上清液移至另一全新96孔板。(7)細(xì)胞裂解加200 u L裂解液于各孔，裂解細(xì)胞20min，得細(xì)胞裂解液。(8) ICR8000樣品分析用ICR8000分別測定細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液中Rb+濃度。上清液及細(xì)胞裂解液中Rb+濃度分別為[Rb+]e、[Rb+]i。ICR8000是一種原子吸收分光光度法，一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借比較對照品溶液和供試品溶液的吸光度，求得供試品中待測Rb+的濃度。(9)數(shù)據(jù)處理:用[Rb+]e、[Rb+]i，求得[Rb+]流量，[Rb+]流量=([Rb+]e/([Rb+]e+[Rb+]i))。將得到的不同的濃度梯度(至少5個濃度)待檢藥物和[Rb+]流量值輸入到Original 6 (或者Sigmaplot)數(shù)據(jù)處理軟件中利用邏輯斯蒂方程擬合IC5tl曲線，獲得待檢藥物的IC5tl值。一般IC5tl值小于等于1000 u mol/L就認(rèn)為該藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用。IC5tl值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大。( 10)各種試劑配方和配置方法
待檢藥物濃度梯度設(shè)置為:10_4、3X10_5、10_5、3X10_6、10_6、3X10_7、10_7、3X10_8、Io-8Jxio-9Uo-9Jxio-iqUo-iqM等等。用固定緩沖液配置的待檢藥物，是在固定緩沖液中加入待檢藥物，使其濃度為上面的梯度濃度。然后按照上述方法進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。固定緩沖液RbCl2mM, NaCl 180mM, CaCl2 ImM, NaH2PO4 I. 2mM, MgCl2 0. 8mM,glucose 7mM, HEPES 20mM，余量為水。每升固定緩沖液的配置方法為在水中加入RbCl2mmol，NaCl 180mmol，CaCl2 lmmol, NaH2PO4 I. 2mmol, MgCl2 0. 8mmol, glucose 7mmol，HEPES 20mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。洗滌緩沖液KCl2mM, NaCl 180mM, CaCl2 ImM, NaH2PO4 I. 2mM, MgCl2 0. 8mM,glucose 7mM、HEPES 20mM，余量為水。每升洗滌緩沖液的配置方法為在水中加入KCl2mmol, NaCl 180mmo1’ CaCl2 lmmol, NaH2PO4 I. 2mmol, MgCl2 0. 8mmol, glucose 7mmo1’ HEPES 20mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290-320m0sm。離子通道開放緩沖液KC120mM, NaCl 130mM, CaCl2ImM, NaH2PO4L 2mM,MgCl2O. 8mM, glucose 7mM, HEPES 20mM，余量為水。每升離子通道開放緩沖液的配置方法為，在水中加入 KCl 20mmol, NaCl 130mmol, CaCl2Immol, NaH2PO4L 2mmoI, MgCl2O. 8mmol,glucose 7mmol, HEPES 20mmol,待溶解完全后定容至1L, PH用NaOH調(diào)至7. 4,過濾分裝,4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。裂解液l%Triton X-100，溶劑為離子通道開放緩沖液。其配置方法為在每IOOml離子通道開放緩沖液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，過濾分裝，4度保存待用。利用本實(shí)施例的評價(jià)方法能夠高效評估藥物對hERG通道的安全性，具有高通量、自動化、高效率、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例3 (I)細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)了 hERG通道的CHO細(xì)胞株(現(xiàn)有技術(shù)中已有)接種于HamsF-12培養(yǎng)基中，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。(2)種板取狀態(tài)良好，聚合度達(dá)到90%的細(xì)胞株以每孔50000個的密度種于96孔板中，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。(3)固定Rb+ :待細(xì)胞長至覆蓋孔底90%左右，棄孔中培養(yǎng)基，加200 ii L的固定緩沖液，于37°C、飽和空氣濕度、95%空氣+5%C02的條件下在CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。(4)藥物處理?xiàng)壐骺字械墓潭ň彌_液，加入用固定緩沖液配置的待檢藥物，孵育5min。(5)洗滌棄各孔中含待檢藥物的固定緩沖液，加200 u L的洗滌緩沖液于96孔板各孔洗掉殘留Rb+，重復(fù)三次。(6)通道激活加200 u L離子通道開放緩沖液于各孔，孵育20min，將細(xì)胞上清液移至另一全新96孔板。(7)細(xì)胞裂解加200 u L裂解液于各孔，裂解細(xì)胞20min，得細(xì)胞裂解液。(8) ICR8000樣品分析用ICR8000分別測定細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液中Rb+濃度。上清液及細(xì)胞裂解液中Rb+濃度分別為[Rb+]e、[Rb+]i。ICR8000是一種原子吸收分光光度法，一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借比較對照品溶液和供試品溶液的吸光度，求得供試品中待測Rb+的濃度。(9)數(shù)據(jù)處理:用[Rb+]e、[Rb+]i，求得[Rb+]流量，[Rb+]流量=([Rb+]e/([Rb+]e+[Rb+]i))。將得到的不同的濃度梯度(至少5個濃度)待檢藥物和[Rb+]流量值輸入到Original 6 (或者Sigmaplot)數(shù)據(jù)處理軟件中利用邏輯斯蒂方程擬合IC5tl曲線，獲得待檢藥物的IC5tl值。一般IC5tl值小于等于lOOOumol/L就認(rèn)為該藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用。IC5tl值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大。( 10)各種試劑配方和配置方法待檢藥物濃度梯度設(shè)置為:10_4、3X10_5、10_5、3X 10_6、10_6、3X 10_7、10_7、3X 10_8、Io-8Jxio-9Uo-9Jxio-iqUo-iqM等等。用固定緩沖液配置的待檢藥物，是在固定緩沖液中加入待檢藥物，使其濃度為上面的梯度濃度。然后按照上述方法進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
固定緩沖液RbClIOmM, NaCl 120mM, CaCl2 3mM, NaH2PO4 0. 4mM, MgCl2L 2mM,glucose 3mM, HEPES 30mM，余量為水。每升固定緩沖液的配置方法為在水中加入RbCllOmmol, NaCl 120mmol，CaCl2 3mmol，NaH2PO4 0. 4mmol, MgCl2 I. 2mmol, glucose 3mmol，HEPES 30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。洗滌緩沖液KC1IOmM, NaCl 120mM, CaCl2 3mM, NaH2PO4 0. 4mM, MgCl2 I. 2mM,glucose 3mM, HEPES 30mM，余量為水。每升洗滌緩沖液的配置方法為在水中加入KClIOmmol, NaCl 120mmol, CaCl2 3mmol, NaH2PO4 0. 4mmo1, MgCl2 I. 2mmol, glucose 3mmol,HEPES 30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290 - 320m0sm。離子通道開放緩沖液KC180mM, NaCl 70mM, CaCl2 3mM, NaH2PO4 0. 4mM, MgCl2I. 2mM, glucose 3mM, HEPES 30mM，余量為水。每升離子通道開放緩沖液的配置方法為，在水中加入 KCl 80mmoI, NaCl 70mmol, CaCl2 3mmoI, NaH2PO4 0. 4mmo1, MgCl2 I. 2mmol, glucose3mmol, HEPES 30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調(diào)至7. 4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調(diào)節(jié)滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290-320m0sm。裂解液l%Triton X-100，溶劑為離子通道開放緩沖液。其配置方法為在每IOOml離子通道開放緩沖液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，過濾分裝，4度保存待用。利用本實(shí)施例的評價(jià)方法能夠高效評估藥物對hERG通道的安全性，具有高通量、自動化、高效率、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法，其特征在于，包括以下步驟 常規(guī)培養(yǎng)表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株，然后棄去其培養(yǎng)基，將細(xì)胞株加入到固定緩沖液中，在細(xì)胞株的常規(guī)培養(yǎng)條件下孵育l_4h，然后棄去固定緩沖液，再加入含待檢藥物的固定緩沖液，孵育5-40min，再棄去含待檢藥物的固定緩沖液，用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞株，洗掉殘留Rb+，然后再加入離子通道開放緩沖液，孵育5-20min，移去細(xì)胞上清液，將細(xì)胞株裂解得細(xì)胞裂解液，分別測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+濃度；再將上述含待檢藥物的固定緩沖液中的待檢藥物設(shè)定為其他不同濃度，按照上述方法重復(fù)測定，根據(jù)不同濃度的待檢藥物的測定所得的數(shù)據(jù)，得到該待檢藥物的IC5tl值，如果IC5tl值< 1000 u mol/L就認(rèn)為該待檢藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用，IC5tl值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大,心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大；所述的固定緩沖液RbCl 2-10mM, NaCl 120-180mM, CaCl2 I_3mM，NaH2PO4 0. 4-1. 2mM,MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量為水；所述的洗滌緩沖液KCl 2-10mM, NaCl 120-180mM, CaCl2 l-3mM, NaH2PO4 bO. 4-1. 2mM,MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量為水； 所述的離子通道開放緩沖液KC1 20-80mM, NaCl 70-130mM, CaCl2 l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株為表達(dá) hERG通道的CHO細(xì)胞株或HEK 293細(xì)胞株。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的常規(guī)培養(yǎng)表達(dá)hERG通道的細(xì)胞 株是常規(guī)培養(yǎng)表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株直至聚合度為80 90%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的將細(xì)胞株加入到固定緩沖液中，在細(xì)胞株的常規(guī)培養(yǎng)條件下，孵育時(shí)間為2. 5h，所述的再加入含待檢藥物的固定緩沖液，孵育時(shí)間為30min，所述的再加入離子通道開放緩沖液，孵育時(shí)間為lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的固定緩沖液為RbCl5. 4mM,NaCl150mM，CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的洗滌緩沖液為KCl5. 4mM,NaCl150mM，CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的離子通道開放緩沖液為KC150mM, NaCl IOOmM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、5、6或7所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的固定緩沖液、洗滌緩沖液和離子通道開放緩沖液的PH值為7. 4。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的將細(xì)胞株裂解得細(xì)胞裂解液是用裂解液裂解細(xì)胞20min得細(xì)胞裂解液，每IOOml裂解液為每IOOml的離子通道開放緩沖液中含有Iml Triton X-100。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的評價(jià)方法，其特征在于，所述的分別測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+濃度是利用ICR 8000離子通道閱讀器測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+ 濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高效評估藥物對hERG通道安全性的評價(jià)方法。它是先常規(guī)培養(yǎng)表達(dá)hERG通道的細(xì)胞株然后棄去其培養(yǎng)基將細(xì)胞株加入到固定緩沖液中，在細(xì)胞株的常規(guī)培養(yǎng)條件下孵育1-4h，棄去固定緩沖液，再加入含待檢藥物的固定緩沖液，孵育5-40min，再棄去含待檢藥物的固定緩沖液，用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞株，洗掉殘留Rb+，再加入離子通道開放緩沖液孵育5-20min，移去細(xì)胞上清液，將細(xì)胞株裂解得細(xì)胞裂解液，分別測定細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液中的Rb+濃度；再設(shè)置含待檢藥物的固定緩沖液中的待檢藥物為不同濃度重復(fù)測定，根據(jù)不同濃度的待檢藥物的測定所得的數(shù)據(jù)得到IC50值，如果IC50值≤1000μmol/L就認(rèn)為該待檢藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用，IC50值越小抑制作用越大心肌毒性的風(fēng)險(xiǎn)越大。
文檔編號G01N21/31GK102747129SQ201210201680
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者徐慧娟, 李志遠(yuǎn), 梁洞泉, 程娜 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院