一種熒光分析方法和裝置與流程

本發(fā)明屬于體外檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種基于測(cè)量熒光強(qiáng)度的分析方法和裝置。

背景技術(shù)：
在免疫檢測(cè)領(lǐng)域中，常常需要對(duì)各類抗原或抗體進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。現(xiàn)有技術(shù)中，以“競(jìng)爭(zhēng)抑制和雙抗夾心”為基礎(chǔ)衍生出多種免疫反應(yīng)分析方法，如：放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨熒光法和熒光免疫法等，可用于確定病原微生物，對(duì)人體的特異性蛋白定量檢測(cè)，從而對(duì)疾病進(jìn)行輔助診斷或監(jiān)測(cè)等等，用途非常廣泛。這類免疫反應(yīng)分析方法，通常將捕獲抗體固定于固相載體，然后與抗原(目標(biāo)蛋白)反應(yīng)，洗滌后再與標(biāo)記抗體反應(yīng)，洗滌，最后檢測(cè)放射性強(qiáng)度、溶液吸光度或光信號(hào)等，從而報(bào)告檢測(cè)樣本中目標(biāo)蛋白的濃度。上述方法的自動(dòng)化免去了人工洗滌的煩瑣，但正因?yàn)樽詣?dòng)化，使得儀器體積龐大價(jià)格昂貴，一般只在大型實(shí)驗(yàn)室使用。1990年，Beggs等綜合膠體金和免疫分析技術(shù)，建立了膠體金免疫層析法(GICA)，用于檢測(cè)人尿和血清中的HCG(BEGGSM，NOVOTNYM，SAMPEDROS.Aselfperformingchromatographicimmunoassayforthequalitativedeterminationofhumanchorionicgonadotrophin(HCG)inurineandserum[J].ClinChem，1990，36：1084-1085)。此后20年，人們?cè)贕ICA的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)出了用于病原體(CN03115143.4)、激素(CN200610014168.3)、心臟標(biāo)志物(CN200410011165.5)、腫瘤標(biāo)志物(CN200510104796.6)、自身免疫病標(biāo)志物(CN200410027291.X)等的檢測(cè)試劑；同時(shí)也應(yīng)用到食品、環(huán)境(CN03116692.X)和獸醫(yī)(CN02139704.X)領(lǐng)域。由于該方法只需肉眼觀察即可，非專業(yè)人士也可操作，使急診、基層醫(yī)院、病人床邊和現(xiàn)場(chǎng)等遠(yuǎn)離大型實(shí)驗(yàn)室的地方開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)成為可能，所以應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛。雖然這種免疫分析技術(shù)已經(jīng)超過(guò)20年的發(fā)展，但其基本的工作原理并未改 變，這決定了到目前為止，它只用于定性或半定量檢測(cè)(根據(jù)檢測(cè)線灰度深淺定量)，且靈敏度也不如前述的定量免疫分析方法，其進(jìn)一步的應(yīng)用遇到了瓶頸。因此，本領(lǐng)域急需對(duì)現(xiàn)有的膠體金層析方法進(jìn)行變革，在賦予其高靈敏度和定量準(zhǔn)確的新優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，保持其快捷、簡(jiǎn)便、成本低廉等特點(diǎn)，從而進(jìn)一步擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種測(cè)試片，用于定量檢測(cè)樣品中的待測(cè)物。本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)待測(cè)物的檢測(cè)方法，所述方法靈敏度高，定量準(zhǔn)確。本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)待測(cè)物的檢測(cè)裝置。本發(fā)明第一方面提供了一種測(cè)試片，該測(cè)試片包括：(i)可加入樣品的加樣區(qū)；(ii)位于加樣區(qū)近端的結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含：一種或多種可流動(dòng)的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑中至少一種被吸光物質(zhì)標(biāo)記，所述結(jié)合劑能與待測(cè)物或其等同物結(jié)合形成含吸光物質(zhì)的復(fù)合物；(iii)位于結(jié)合區(qū)近端和加樣區(qū)遠(yuǎn)端的測(cè)試區(qū)，所述測(cè)試區(qū)包含固定化的捕獲劑，所述捕獲劑用于捕獲從結(jié)合區(qū)移動(dòng)至測(cè)試區(qū)的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑或含吸光物質(zhì)的復(fù)合物，所述測(cè)試區(qū)具有熒光；和(iv)位于測(cè)試區(qū)近端和結(jié)合區(qū)遠(yuǎn)端的樣品吸收區(qū)，其中吸收區(qū)具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)的樣品從加樣區(qū)擴(kuò)散至末端樣品吸收區(qū)；其中，當(dāng)所述捕獲劑捕獲所述被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑或所述含吸光物質(zhì)的復(fù)合物時(shí)，所述吸光物質(zhì)影響所述測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度。在另一優(yōu)選例中，所述測(cè)試區(qū)的熒光為所述測(cè)試片的自有熒光。在另一優(yōu)選例中，所述的吸光物質(zhì)影響所述測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度是導(dǎo)致測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度下降。在另一優(yōu)選例中，所述待測(cè)物為抗原或抗體。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合劑特異性結(jié)合待測(cè)物或其等同物；較佳地，所述結(jié)合劑為抗原、抗體或寡核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合區(qū)可以包含兩種結(jié)合劑，其中，一種被吸光物 質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑，另一種被生物素標(biāo)記的結(jié)合劑，所述兩種結(jié)合劑同時(shí)與待測(cè)物結(jié)合，從而形成一種被生物素標(biāo)記的含吸光物質(zhì)的復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述含吸光物質(zhì)的復(fù)合物可以含有待測(cè)物，也可以含有待測(cè)物等同物。在另一優(yōu)選例中，所述捕獲劑特異性結(jié)合被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑或含吸光物質(zhì)的復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述捕獲劑為鏈親和素、待測(cè)物的抗體或待測(cè)物的等同物。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合劑的數(shù)量大于所述待測(cè)物的數(shù)量；所述捕獲劑的數(shù)量大于從結(jié)合區(qū)移動(dòng)至測(cè)試區(qū)的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑或含吸光物質(zhì)的復(fù)合物的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物包括：蛋白、核酸或小分子化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物是液相(溶液)、懸浮液或固相。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物包括腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物等特異性的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述測(cè)試片自有熒光的激發(fā)或發(fā)射光譜與所述吸光物質(zhì)的吸收光譜全部或部分重疊。在另一優(yōu)選例中，所述的吸光物質(zhì)選自下組：膠體金、納米金棒、納米銀棒或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的膠體金是平均粒徑為10-70nm的膠體金顆粒。在另一優(yōu)選例中，在測(cè)試區(qū)和樣品吸收區(qū)之間還包含至少一個(gè)對(duì)照區(qū)，所述對(duì)照區(qū)含有固定化的對(duì)照劑，其中，所述對(duì)照劑用于特異性結(jié)合被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑。在另一優(yōu)選例中，所述對(duì)照區(qū)用于揭示待測(cè)物的檢測(cè)結(jié)果的有效性。本發(fā)明第二方面提供了一種定量檢測(cè)待測(cè)物的熒光分析方法，包括步驟：(1)將待測(cè)物樣品加至本發(fā)明第一方面所述的測(cè)試片的加樣區(qū)；(2)測(cè)量所述測(cè)試片的測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度，從而換算為待測(cè)物的數(shù)量。本發(fā)明第三方面提供了一種定量檢測(cè)待測(cè)物的熒光分析方法，包括步驟：(a)提供一本發(fā)明第一方面所述的測(cè)試片；(b)將待測(cè)物樣品加至所述測(cè)試片的加樣區(qū)；(c)樣品中的待測(cè)物移動(dòng)至結(jié)合區(qū)，與其中的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑結(jié) 合，從而形成可流動(dòng)的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；(d)步驟(c)中剩余的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑或步驟(c)得到的可流動(dòng)的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物移動(dòng)至測(cè)試區(qū)，與其中的捕獲劑結(jié)合，從而形成固定于測(cè)試區(qū)的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；(e)測(cè)量所述測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度，從而換算為待測(cè)物的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述測(cè)試區(qū)的熒光為所述測(cè)試片的自有熒光。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)捕獲劑結(jié)合步驟(c)中剩余的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑時(shí)，所述捕獲劑為所述結(jié)合劑的抗體或抗原、或?yàn)榇郎y(cè)物等同物。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)待測(cè)物樣品為固相時(shí)，步驟(b)還包括加入溶劑(如水或緩沖液)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)或步驟(e)中，將測(cè)試區(qū)與對(duì)照區(qū)中間處的熒光強(qiáng)度F2與測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度F1的比值，和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定待測(cè)物的數(shù)量；或者將測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度F1和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定待測(cè)物的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括用已知濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)量，從而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟。本發(fā)明第四方面提供了一種檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：一本發(fā)明第一方面所述的測(cè)試片；和使用說(shuō)明書。本發(fā)明第五方面提供了一種定量檢測(cè)待測(cè)物的熒光測(cè)量裝置，所述的裝置包括：(a)一本發(fā)明第一方面所述的測(cè)試片；(b)一用于檢測(cè)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)器；和(c)描述使用方法的使用說(shuō)明。在另一優(yōu)選例中，所述裝置還包括光源和計(jì)算機(jī)。所述光源通過(guò)光導(dǎo)纖維照射到檢測(cè)線處，激發(fā)出的熒光通過(guò)光導(dǎo)纖維進(jìn)入檢測(cè)器，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說(shuō)明圖1是測(cè)試片示意圖。圖2是檢測(cè)裝置示意圖。圖3是實(shí)施例1的AFP標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(C)與相應(yīng)熒光強(qiáng)度比值(F2/F1)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4是實(shí)施例2的CRP標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)與相應(yīng)熒光強(qiáng)度比值的對(duì)數(shù)值lg(F2/F1)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種基于熒光淬滅原理的檢測(cè)方法，所述方法不僅可以通過(guò)目測(cè)測(cè)試區(qū)的顏色來(lái)判斷是否含有待測(cè)物；還可以通過(guò)測(cè)量測(cè)試區(qū)熒光強(qiáng)度的方式來(lái)定量檢測(cè)待測(cè)物，上述方法可以直接通過(guò)淬滅物質(zhì)對(duì)測(cè)試區(qū)的自有熒光強(qiáng)度的影響，從而測(cè)定待測(cè)物的數(shù)量。所述方法不僅具有靈敏度高，定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，而且操作仍然十分簡(jiǎn)便、快捷、且成本低廉。所述方法是基于本發(fā)明提供的一種測(cè)試片，通過(guò)一種含有光源和檢測(cè)器的裝置實(shí)現(xiàn)了對(duì)待測(cè)物的定量檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。測(cè)試片現(xiàn)在更詳細(xì)地描述用于制造本發(fā)明測(cè)試片的方法和材料。應(yīng)注意，測(cè)試片的具體構(gòu)造可以變化，這取決于意圖用測(cè)試片來(lái)進(jìn)行的具體測(cè)試。在實(shí)施例之外制造測(cè)試片的變動(dòng)方法，也落于本發(fā)明范圍之中。如圖1所示，測(cè)試片1可包括背襯片2，其長(zhǎng)度與測(cè)試片相同。加樣區(qū)3位于測(cè)試片的一端，樣品墊片31位于加樣區(qū)，可通過(guò)粘合劑粘貼于加樣區(qū)。吸收區(qū)7位于測(cè)試片的另一端，在加樣區(qū)的遠(yuǎn)端，吸水墊片71位于吸收區(qū)。結(jié)合區(qū)4位于加樣區(qū)和吸收區(qū)之間，在加樣區(qū)的近端和吸收區(qū)的遠(yuǎn)端，結(jié)合墊片41位于結(jié)合區(qū)。測(cè)試區(qū)5(也稱檢測(cè)線)位于結(jié)合區(qū)和吸收區(qū)之間，通常測(cè)試區(qū)設(shè)置在膜片56上，通過(guò)所述膜片連接結(jié)合墊和吸水墊。優(yōu)選地，所述膜片上還設(shè)置有對(duì)照區(qū)6(也稱質(zhì)控線)，對(duì)照區(qū)位于測(cè)試區(qū)和吸收區(qū)之間，也可以位于測(cè)試區(qū)和結(jié)合區(qū)之間，并與測(cè)試區(qū)之間有適當(dāng)?shù)目臻g。測(cè)試片制造方法，優(yōu)選地，如圖1所示，分別將樣品墊片、結(jié)合墊片、膜片、吸水墊片通過(guò)粘合劑粘貼于背襯板上，即得所述測(cè)試片。背襯片可以用任何穩(wěn)定的、無(wú)孔的材料制成，其強(qiáng)度應(yīng)足以支承材料和粘于其的測(cè)試片。因?yàn)樵S多測(cè)定用水作為擴(kuò)散介質(zhì)，因此背襯片較佳地是基本上不透水的。在一個(gè)優(yōu)選例中，背襯片是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC膠板)。樣品墊片可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括：纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。結(jié)合墊片或膜片可以用任何材料制成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內(nèi)部發(fā)生流體的毛細(xì)管作用。結(jié)合墊片或膜片應(yīng)有足夠的孔隙度，從而允許涂有抗體或抗原的顆粒移動(dòng)。結(jié)合墊片或膜片還可被含待檢測(cè)分析物的樣品中所用的液體潤(rùn)濕(例如，對(duì)于水性液體具有親水性，對(duì)于有機(jī)溶劑具有疏水性)。通過(guò)例如在美國(guó)專利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉(zhuǎn)變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用于水性液體。可用于制造結(jié)合墊片或膜片的材料例子包括：聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一個(gè)優(yōu)選例中，結(jié)合墊片是用聚脂膜制成的，膜片是用硝酸纖維素制成的。吸收墊片可以用任何能吸收作為樣品和緩沖液的液體的材料制成。吸收墊片的吸收能力應(yīng)足夠大，以便吸收添加至測(cè)試片的液體。適用于吸收墊片的材料的例子包括纖維素和玻璃纖維。檢測(cè)方法本發(fā)明測(cè)試片可用于大量不同的側(cè)流分析方法，而這些分析方法涉及使用一種或多種可流動(dòng)的結(jié)合劑和一種固定化的捕獲劑，以及利用測(cè)試區(qū)自有的熒光強(qiáng)度的變化。優(yōu)選地，所述方法包括步驟：(1)將待測(cè)物樣品加至本發(fā)明所述的測(cè)試片的加樣區(qū)；(2)測(cè)量所述測(cè)試片的測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度，從而換算為待測(cè)物的數(shù)量。在加樣后，樣品中的待測(cè)物移動(dòng)至結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)含有結(jié)合劑，所述 待測(cè)物與其中的結(jié)合劑結(jié)合，從而形成含吸光物質(zhì)的復(fù)合物；接著，剩余的含吸光物質(zhì)的結(jié)合劑和結(jié)合區(qū)中形成的含吸光物質(zhì)的復(fù)合物移動(dòng)至測(cè)試區(qū)，與其中的捕獲劑結(jié)合，從而形成富集有吸光物質(zhì)的測(cè)試區(qū)。具體地，當(dāng)所述富集在測(cè)試區(qū)的吸光物質(zhì)影響(部分淬滅或全部淬滅)所述測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度(測(cè)試片自有熒光)時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法即可通過(guò)檢測(cè)測(cè)試區(qū)熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定待測(cè)物的數(shù)量。待測(cè)物或其等同物如本文所用，術(shù)語(yǔ)“待測(cè)物”、“其等同物”或“分析物”指待用測(cè)試片檢測(cè)以及可任選地被定量測(cè)定的、樣品中的任何組份，待測(cè)物或其等同物或分析物的例子包括：蛋白質(zhì)，如激素或其他分泌蛋白質(zhì)、酶和細(xì)胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體及其片段)；核酸；藥物(包括地高辛等強(qiáng)心甙類藥物)；毒素；毒品；病毒或病毒顆粒；細(xì)胞壁組份；或其他具有表位的化合物。優(yōu)選地，所述的待測(cè)物包括腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物等特異性的蛋白，所述腫瘤標(biāo)志物選自下組：甲胎蛋白(AFP)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、或人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)。結(jié)合劑本發(fā)明所用的結(jié)合劑可以是任何能夠結(jié)合于待測(cè)物或其等同物的物質(zhì)。具體地，為特異性結(jié)合待測(cè)物或其等同物的物質(zhì)。所述結(jié)合劑中至少一種是被吸光物質(zhì)標(biāo)記，所述結(jié)合劑能與待測(cè)物或其等同物結(jié)合形成含吸光物質(zhì)的復(fù)合物；有各種不同類型的分子可用作分析物結(jié)合劑，其中包括例如：寡核苷酸、抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結(jié)合位點(diǎn))的異源混合物的裂解物。P.Holliger等人，TrendsinBiotechnology13：7-9(1995)；S.M.Chamow等人，TrendsinBiotechnology14：52-60(1996)。如果待檢測(cè)分析物是配體，那么可使用結(jié)合于該配體的受體，反之亦然。優(yōu)選地，所述的待測(cè)物或其等同物是抗原，且所述的結(jié)合劑是可結(jié)合于所 述抗原的抗體；或者所述的待測(cè)物或其等同物是抗體，且所述的結(jié)合劑是可結(jié)合于所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)。捕獲劑本發(fā)明所用的捕獲劑可以是任何能結(jié)合含吸光物質(zhì)的復(fù)合物和/或結(jié)合劑的物質(zhì)，包括例如：抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結(jié)合位點(diǎn))的異源混合物的裂解物。所述捕獲劑用于捕獲從結(jié)合區(qū)移動(dòng)至測(cè)試區(qū)的含吸光物質(zhì)的復(fù)合物和/或剩余的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑，從而使得吸光物質(zhì)富集在測(cè)試區(qū)。優(yōu)選地，可以通過(guò)抗原和抗體的結(jié)合或寡核苷酸與互補(bǔ)核酸單鏈特異性結(jié)合的方式或通過(guò)生物素(biotin)和鏈親和素(Streptavidin，SA)的結(jié)合方式，將捕獲劑與含吸光物質(zhì)的復(fù)合物和/或剩余的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑結(jié)合，從而將吸光物質(zhì)富集混合于測(cè)試區(qū)。所述捕獲劑和含吸光物質(zhì)的復(fù)合物或剩余的被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑的結(jié)合為特異性結(jié)合。優(yōu)選地，所述的捕獲劑是鏈親和素、待測(cè)物的抗體或待測(cè)物等同物。吸光物質(zhì)的選擇用于本發(fā)明的吸光物質(zhì)應(yīng)有較寬泛的紫外可見(jiàn)甚至紅外吸收光譜，總的原則是其吸收光譜與測(cè)試片自有熒光的激發(fā)或發(fā)射光譜部分或完全重疊。最優(yōu)的是完全重疊，如此會(huì)有較高的檢測(cè)靈敏度。代表性的吸光物質(zhì)包括(但并不限于)：膠體金、納米金棒、納米銀棒等組合，它們的吸收光譜范圍為300～1000nm不等，只要所選吸光物質(zhì)的吸收光譜與測(cè)試片自有熒光激發(fā)或發(fā)射光譜重疊即可。膠體金顆粒可用任何常規(guī)方法制造，例如總結(jié)于G.Frens，1973NaturePhysicalScience，241：20(1973)中的方法。其他方法描述于美國(guó)專利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“納米金棒”指具有一定縱橫比、且橫軸和縱軸處于5-200納米范圍的金顆粒。一種特別優(yōu)選的吸光物質(zhì)是膠體金，尤其是粒徑為20-40nm的膠體金。熒光淬滅原理含吸光物質(zhì)標(biāo)記的物質(zhì)，被測(cè)試區(qū)的捕獲試劑捕獲后，含吸光物質(zhì)標(biāo)記的物質(zhì)會(huì)在測(cè)試區(qū)富集，當(dāng)測(cè)試片自有熒光的激發(fā)或發(fā)射光譜與該吸光物質(zhì)的吸收光譜全部或部分重疊時(shí)，因共振能量轉(zhuǎn)移，吸光物質(zhì)會(huì)對(duì)測(cè)試片自有熒光產(chǎn)生淬滅作用，即淬滅測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度。工作原理現(xiàn)結(jié)合圖1和具體的實(shí)施方式說(shuō)明本發(fā)明檢測(cè)方法的工作原理：利用膜片56本身的自有熒光。檢測(cè)線處固定能與結(jié)合劑結(jié)合的物質(zhì)(即捕獲劑)。所述結(jié)合劑位于結(jié)合墊片，可流動(dòng)。所述結(jié)合劑被樣品溶解后，在層析過(guò)程中與樣品中的待測(cè)物或其等同物結(jié)合形成含吸光物質(zhì)的復(fù)合物，所述復(fù)合物流經(jīng)檢測(cè)線時(shí)被捕獲，待測(cè)物越多，被捕獲的所述復(fù)合物也就越多。具體地，當(dāng)所述復(fù)合物(部分淬滅或全部淬滅)影響所述膜片檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度時(shí)，即可通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定待測(cè)物的數(shù)量。本發(fā)明在此提供了基于上述原理的如下優(yōu)選方法：方法一：(1.1)樣品加在玻璃纖維樣品墊片上，樣品中的待測(cè)物(如抗原)在毛細(xì)作用下向吸水墊片方向移動(dòng)，途經(jīng)載有結(jié)合劑(如針對(duì)抗原的金標(biāo)抗體、biotin標(biāo)記的抗體)的結(jié)合墊片后，將所述結(jié)合劑完全復(fù)溶，層析過(guò)程中抗原與結(jié)合劑形成“金標(biāo)抗體-抗原-biotin抗體”的3元復(fù)合物，被檢測(cè)線處的捕獲劑(如Streptavidin)捕獲；3元復(fù)合物中的金淬滅膜條檢測(cè)線處的自有熒光。(1.2)多余的游離金標(biāo)抗體繼續(xù)前移，被固定在質(zhì)控線處的對(duì)照劑(如抗金標(biāo)抗體的抗體)捕獲，呈現(xiàn)紅色，說(shuō)明檢測(cè)有效。(1.3)分別測(cè)定膜條檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度F1及檢測(cè)線與質(zhì)控線中間處的熒光強(qiáng)度F2，計(jì)算F2/F1的值，值越大說(shuō)明待測(cè)物濃度越高，反之則越低；如樣本中無(wú)待測(cè)物時(shí)，不能形成3元復(fù)合物，則F2/F1≈1。方法二：將捕獲劑(如針對(duì)待測(cè)物中抗原的捕獲抗體)固定于檢測(cè)線處。(1.1)樣品加在玻璃纖維樣品墊片上，樣品中的待測(cè)物(如抗原)在毛細(xì)作用下向吸水墊片方向移動(dòng)，途經(jīng)載有結(jié)合劑(如抗原的金標(biāo)抗體)的結(jié)合墊片后，將所述結(jié)合劑完全復(fù)溶，層析過(guò)程中抗原與結(jié)合劑形成“金標(biāo)抗體-抗原”的2元復(fù)合物，被檢測(cè)線處的捕獲抗體捕獲；2元復(fù)合物中的金淬滅膜條檢測(cè)線處的自有熒光。(1.2)多余的游離金標(biāo)抗體繼續(xù)前移，被固定在質(zhì)控線處的對(duì)照劑(如抗金標(biāo)抗體的抗體)捕獲，呈現(xiàn)紅色，說(shuō)明檢測(cè)有效。(1.3)分別測(cè)定膜條檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度F1及檢測(cè)線與質(zhì)控線中間處的熒光強(qiáng)度F2，計(jì)算F2/F1的值，值越大說(shuō)明待測(cè)物濃度越高，反之則越低；如樣本中無(wú)待測(cè)物時(shí)，不能形成2元復(fù)合物，則F2/F1≈1。本發(fā)明還適用于競(jìng)爭(zhēng)抑制法：(1.1)將待測(cè)物的等同物固定于檢測(cè)線處作為捕獲劑，結(jié)合劑的抗體固定于質(zhì)控線處；(1.2)將結(jié)合劑(如金標(biāo)抗體)滴加于附圖1的結(jié)合墊片處，樣品加在玻璃纖維樣品墊片上，其中的待測(cè)物(如抗原)向吸水墊片方向移動(dòng)，途經(jīng)載有所述結(jié)合劑的結(jié)合墊片并將其完全復(fù)溶，液體前行過(guò)程中，樣品中的待測(cè)物和結(jié)合墊片上的結(jié)合劑形成金標(biāo)抗體-抗原的“第1二元復(fù)合物”；(1.3)剩余的結(jié)合劑前行至膜片56的檢測(cè)線處，與待測(cè)物的等同物形成金標(biāo)抗體-待測(cè)物等同物的“第2二元復(fù)合物”而被捕獲，待測(cè)物濃度越高，形成的“第2二元復(fù)合物”越少，相應(yīng)地，被捕獲的“第2二元復(fù)合物”越少；(1.4)未被捕獲的結(jié)合劑與“第1二元復(fù)合物”繼續(xù)前行，被質(zhì)控線處結(jié)合劑的抗體捕獲，質(zhì)控線顯示紅色，試驗(yàn)有效；(1.5)分別測(cè)定膜條檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度F1及檢測(cè)線與質(zhì)控線中間處的熒光強(qiáng)度F2，計(jì)算F2/F1的值，值越大說(shuō)明待測(cè)物濃度越小，反之則越大。檢測(cè)裝置現(xiàn)結(jié)合圖2說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)裝置：如圖2所示，所述裝置可以包括：測(cè)試片、檢測(cè)器、光源、光導(dǎo)纖維和計(jì)算機(jī)。還可以包括一份檢測(cè)方法的使用說(shuō)明。其中測(cè)試片的工作原理如上所述， 熒光強(qiáng)度的檢測(cè)方法可以如下所述(但不僅限于此)，任何可用于檢測(cè)熒光強(qiáng)度的方法均可用于本發(fā)明的檢測(cè)裝置。熒光強(qiáng)度的檢測(cè)光源通過(guò)光導(dǎo)纖維照射到檢測(cè)線處，激發(fā)出的熒光通過(guò)光導(dǎo)纖維進(jìn)入檢測(cè)器，所得到的數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理和分析。所述光導(dǎo)纖維可以是Y型的，分別連接于光源、檢測(cè)線和檢測(cè)器。本發(fā)明中，光源用于提供某一發(fā)射波長(zhǎng)的光線，從而激發(fā)測(cè)試片發(fā)出熒光?？蛇x用任何可以提供合適波長(zhǎng)的光源，包括(但不限于)：LED、氙燈、鹵鎢燈、激光等。一種優(yōu)選的光源是激光光源，激光光源可用本領(lǐng)域常規(guī)的方法和設(shè)備(如激光器)產(chǎn)生。代表性的激光器包括(但并不限于)：半導(dǎo)體激光器、氦氖激光器、氬離子激光器、還包括波長(zhǎng)可選的激光器、多波長(zhǎng)激光器和雙波長(zhǎng)激光器等。激光器產(chǎn)生的激光波長(zhǎng)與激光介質(zhì)有關(guān)，常見(jiàn)的激光波長(zhǎng)見(jiàn)下表1：表1激光種類波長(zhǎng)(納米)氬氟激光(紫外光)193氪氟激光(紫外光)248氙氯激光(紫外光)308氮激光(紫外光)337氬激光(藍(lán)光)488氬激光(綠光)514氦氖激光(綠光)543氦氖激光(紅光)633羅丹明6G染料(可調(diào)光)570-650紅寶石(CrAlO3)(紅光)694釹-釔鋁石榴石(近紅外光)1064本發(fā)明中的檢測(cè)器可以是(但不限于)光電倍增管、CCD或光電池等。標(biāo)準(zhǔn)曲線在本發(fā)明中，可以直接通過(guò)測(cè)定檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度，從而確定所述待測(cè)物的數(shù)量；也可以通過(guò)測(cè)定檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度F1和檢測(cè)線與質(zhì)控線中間處的熒光強(qiáng)度F2，計(jì)算F2/F1的值，從而確定所述待測(cè)物的數(shù)量。在優(yōu)選例中，可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而獲得定量結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)曲線可用以下方法獲得：將已知的不同濃度(C)的待測(cè)物樣品通過(guò)上述檢測(cè)方法后，分別測(cè)量其在檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度(F)，將各濃度(C)或其對(duì)數(shù)值(logC或lgC)和相應(yīng)的熒光強(qiáng)度(F)或其對(duì)數(shù)值(logF或lgF)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；或者將已知的不同濃度(C)的待測(cè)物樣品通過(guò)上述檢測(cè)方法后，分別測(cè)量其在檢測(cè)線處的熒光強(qiáng)度(F1)，檢測(cè)線與質(zhì)控線中間處的熒光強(qiáng)度F2，計(jì)算F2/F1的值，將各濃度(C)或其對(duì)數(shù)值(logC或lgC)和相應(yīng)的熒光強(qiáng)度比值(F2/F1)或其對(duì)數(shù)值(logF2/F1或lgF2/F1)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)有：(1)本發(fā)明提供了一種測(cè)試片。(2)本發(fā)明提供了一種上述測(cè)試片的檢測(cè)方法，所述方法基于熒光淬滅原理，通過(guò)測(cè)量測(cè)試片自有熒光強(qiáng)度測(cè)定待測(cè)物的數(shù)量，所述方法快捷、簡(jiǎn)便、成本低廉，而且靈敏度高，定量準(zhǔn)確。(3)本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)裝置，所述裝置基于上述檢測(cè)方法，可廣泛用于定量檢測(cè)領(lǐng)域。下面結(jié)合具體實(shí)施，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例試劑和設(shè)備：針對(duì)AFP的1對(duì)單克隆抗體(Ab1和Ab2)，市售品；針對(duì)C-反應(yīng)蛋白(CRP)的單克隆抗體，市售品；CRP抗原，市售品；AFP抗原購(gòu)自Biodesign；30nm的膠體金，市售品；Streptavidin(SA)，市售品；小牛血清白蛋白(BSA)，市售品；Biotin，市售品；檢測(cè)器：USB4000-FL(美國(guó)海洋光學(xué)公司)；光源：532nm激光光源。實(shí)施例1：血清中甲胎蛋白(AFP)的檢測(cè)(利用膜片的自有熒光)1、金標(biāo)抗體的制備1.1膠體金-抗體保存液四硼酸鈉0.1g小牛血清白蛋白(BSA)0.25gNaN30.025g加水溶解后用6NHCl調(diào)pH至7.4，補(bǔ)水至250ml，用0.45μm濾膜過(guò)濾后，4～8℃保存。1.2工作液Na2HPO4·12H2O6.1gNaCl8.5gPVP405.0g硼酸2.1gPEG1.0g10％BSA50mlNaN30.2g加水溶解后用6NHCL調(diào)pH至7.0～7.5補(bǔ)水至1000ml，用0.45μm濾膜過(guò)濾后，4～8℃保存。1.3金標(biāo)抗體(Gold-Ab1)的制備1.3.1取20～30nm顆粒膠體金液20ml，在磁力攪拌下緩慢加入已純化的Ab1抗體1.0ml(0.6mg/ml)，在室溫下攪拌30min；1.3.2加10％的BSA0.8ml(終濃度0.4％)，室溫?cái)嚢?min；1.3.3加10％的PEG0.4ml(終濃度0.2％)，室溫?cái)嚢?min；1.3.412000～1500r/min離心60～40min，小心吸離心上清，沉淀溶于0.5ml保存液中，金標(biāo)抗體的光密度(O.D)約為100O.D，其中Ab1抗體的濃度為1mg/ml，置4℃保存?zhèn)溆茫?.biotin標(biāo)記Ab22.1Ab2預(yù)處理2.2取上述預(yù)處理的Ab210μL，加入25μL的1mg/mlNHSS-BiotinDMSO溶液，混勻，4℃冰箱避光反應(yīng)2小時(shí)，透析過(guò)夜備用。3.SA點(diǎn)膜與上載Gold-Ab1、biotin-Ab2取SA1mg/ml的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)0.5μl點(diǎn)在附圖1檢測(cè)線位置，避光室溫干燥；取Gold-Ab1、biotin-Ab20.5μl滴加在附圖1的結(jié)合墊片上。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備4.1用工作液配制AFP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度見(jiàn)表2)；4.2取5只測(cè)試片，水平放置，分別在各樣品墊上加5種濃度的50μl標(biāo)準(zhǔn)溶 液；4.310min后，測(cè)定各測(cè)試片上檢測(cè)線處605nm的熒光強(qiáng)度F1及檢測(cè)線與質(zhì)控線中間處605nm的熒光強(qiáng)度F2，計(jì)算F2/F1的值數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。表2AFP標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與相應(yīng)熒光強(qiáng)度5、樣本檢測(cè)用血清樣本替代標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，重復(fù)4.2、4.3步驟，將F2/F1代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得6個(gè)樣本的AFP值見(jiàn)表3。表3本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性良好，R2＝0.9637。實(shí)施例2：基于競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白(CRP)1.CRP單抗標(biāo)金(Gold-CRP)過(guò)程同實(shí)施例1步驟1，不同點(diǎn)在于，用已純化的CRP單抗替代Ab1抗體， 標(biāo)記后膠體金O.D值為75，CRP單抗?jié)舛葹?mg/ml。2.用PBS-TBN配制1mg/ml的CRP純抗原，取0.2μl點(diǎn)于檢測(cè)線處；用PBS-TBN配制1mg/ml的CRP抗體的抗體，取0.2μl點(diǎn)于質(zhì)控線處；取0.5μlGold-CRP加于結(jié)合墊，室溫干燥備用。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備3.1用工作液配制CRP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度見(jiàn)表4)；3.2取5只測(cè)試片，水平放置，分別在各樣品墊上加5種濃度的50μl標(biāo)準(zhǔn)溶液；3.310min后，測(cè)定各測(cè)試片上檢測(cè)線處605nm的熒光強(qiáng)度F1及檢測(cè)線與質(zhì)控線中間處605nm的熒光強(qiáng)度F2，計(jì)算F2/F1的值數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。表4CRP標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與相應(yīng)熒光強(qiáng)度5、樣本檢測(cè)用血清樣本替代標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，重復(fù)3.2、3.3步驟，將F2/F1代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得6個(gè)樣本的CRP值見(jiàn)表5。表5發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果與酶聯(lián)免疫法法檢測(cè)結(jié)果本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果與酶聯(lián)免疫法法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性良好，R2＝0.9586。結(jié)論：本發(fā)明所述方法僅通過(guò)測(cè)量淬滅物質(zhì)對(duì)測(cè)試區(qū)自有熒光強(qiáng)度的影響來(lái)測(cè)定待測(cè)物的數(shù)量，既克服了自有熒光帶來(lái)的熒光信號(hào)的干擾，而且不需要加入任何熒光物質(zhì)標(biāo)記的試劑，顯著減少了原料的使用，節(jié)約了經(jīng)濟(jì)成本，且實(shí)驗(yàn)方法更簡(jiǎn)便?？梢?jiàn)，本發(fā)明所述方法不僅具有靈敏度高，定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，而且快捷、操作簡(jiǎn)便、成本低廉。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。