專利名稱：分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是上個(gè)世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，在東南亞、東亞和南亞一些國(guó)家局部發(fā)生，對(duì)水稻生產(chǎn)造成一定影響。目前主要發(fā)生在我國(guó)的廣西、福建、湖南、江西、貴州、云南等地。病株表現(xiàn)濃綠矮縮，葉片扭曲呈鋸齒狀缺刻，在葉背和葉鞘生有細(xì)長(zhǎng)脈腫。分蘗期前發(fā)病不能抽穗，后期發(fā)病，抽穗不完全、谷粒不充實(shí)等癥狀。發(fā)病田塊一般減產(chǎn)10% 20%，嚴(yán)重的減產(chǎn)可達(dá)80% 100%，是影響水稻產(chǎn)量比較嚴(yán)重的病毒病害之一。RRSV為呼腸孤病毒科水稻病毒屬(Oryzavirus)的典型成員，引起水稻齒葉矮縮病。RRSV基因組包括10條雙鏈RNA片段(Sl-SlO)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和基因組雙鏈RNA的電泳圖譜與該科另外兩個(gè)屬一植物呼腸孤病毒屬(Wiytoreovirus) 和斐濟(jì)病毒屬(Fifivirus)的病毒有較大的區(qū)別。RRSV具有雙層衣殼，呈二十面體結(jié)構(gòu)，完整病毒粒體的直徑約為65nm，核心顆粒約50nm。電鏡下可觀察到直徑50 66nm或是40nm 的病毒粒子分布在感病水稻葉片韌皮細(xì)胞的病毒質(zhì)體(viro-plasm)中；帶毒蟲體內(nèi)的器官或組織里也可觀察到直徑40 45nm或50 75nm兩類球形結(jié)晶狀粒子，聚集或是分散地排列在細(xì)胞質(zhì)的病毒質(zhì)體中。水稻鋸齒葉矮縮病主要是由褐飛虱傳播的RRSV病毒引起， 病株液汁、種子和土壤均不傳毒。病毒粒子球狀，底部有較寬的突起。其自然寄主有水稻、 蟋蟀草、水蜈蚣和稗草，人工侵染的植物有大麥、小麥、燕麥、玉米、甘蔗、稗等10多種。RRSV 的介體昆蟲為褐飛虱(Nilaparvatalugens)，是一種遷飛性昆蟲，其傳播為持久性方式，但不經(jīng)卵傳播。褐飛虱的若蟲蛻皮但不失毒，病毒在蟲體中的分布以唾液腺中含量最高。介體最小獲毒時(shí)間是3小時(shí)(h)，平均9天(d)。最短的傳毒期是lh，接種后10-36d顯示癥狀，傳毒率大約為40%。幼蟲可能比成蟲的傳毒效率更高，雌蟲和雄蟲，長(zhǎng)翅型和短翅型傳毒效率相同。介體蛻皮時(shí)仍傳毒，介體傳毒通常具有間歇性傳毒期，可保持1-4周或終生傳毒。褐飛虱的四個(gè)型具有相似的傳毒特性。為了掌握褐飛虱自然種群帶毒及水稻發(fā)病狀況，強(qiáng)化我國(guó)水稻齒葉矮縮病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控，急需建立檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)及水稻中RRSV的高通量的檢測(cè)方法，而目前沒(méi)有這種高通量的檢測(cè)方法，僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法、核酸電泳等可對(duì)小樣本進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明以原核表達(dá)的RRSV衣殼蛋白 (CP)為抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了 1株抗RRSV的特異性單克隆抗體，以制備的單抗為核心建立了檢測(cè)RRSV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間RRSV的檢測(cè)，從而為我國(guó)水稻齒葉矮縮病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CGMCC No. 5536， 它能分泌抗水稻齒葉矮縮病毒的單克隆抗體。抗水稻齒葉矮縮病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_7，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與水稻齒葉矮縮病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)?？顾君X葉矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法及其免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果1)提供的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗水稻齒葉矮縮病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA 和TAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)水稻齒葉矮縮病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)水稻齒葉矮縮病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間水稻作物及褐飛虱中的水稻齒葉矮縮病毒的檢測(cè)。
圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)水稻RRSV的靈敏度分析。感病水稻葉片分別從1 10， 倍比稀釋直到1:5120，CK-為健康水稻，1、2為同一樣品的重復(fù)；
圖2是dot-ELISA方法檢測(cè)水稻田間樣品中RRSV的結(jié)果，CK+為帶毒為感染了水稻齒葉矮縮病毒的水稻，CK-為健康水稻；
圖3是dot-ELISA方法檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)RRSV的靈敏度分析；
圖4是dot-ELISA方法檢測(cè)田間褐飛虱體內(nèi)RRSV的結(jié)果，1、2、3、4、5、6、7、8分別代表 8個(gè)田間褐飛虱樣品。
具體實(shí)施例方式分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，于2011年11月觀日，保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 5536，它能分泌抗水稻齒葉矮縮病毒的單克隆抗體。抗水稻齒葉矮縮病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_7，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與水稻齒葉矮縮病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法及其免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株大量分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單抗，且其特異性強(qiáng)、 效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測(cè)RRSV的高通量的免疫學(xué)方法及其免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒，可成功應(yīng)用于田間RRSV的檢測(cè)，從而為我國(guó)水稻齒葉矮縮病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警， 科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備 1.免疫原及檢測(cè)抗原的制備根據(jù)GeneBank中報(bào)道的水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)的衣殼蛋白基因(CP基因)序列 (登陸號(hào)EU523360 )設(shè)計(jì)特異性引物，RRSV-CP-F =^iTtrCGAATCATCACTGAACAAGTATTTGG 和 RRSV-CP-R :44^7TTCATACACCGGAACCGCTGG,下劃線分別為 BamHI 和 HindIII 酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)約為1500bp的CP基因，目的基因經(jīng)回收后插入到PMD-18T載體 (RRSV-CP-pMD18T)上并通過(guò)PCR和酶切篩選獲得pMD_18T_CP重組子，序列測(cè)定表明克隆到的CP基因與RRSV CP基因序列完全相同。重組質(zhì)粒pMD-18T-CP中的CP基因經(jīng)BamHI 和HindIII雙酶切后連接至原核表達(dá)載體PMAL-C2X上，獲得重組表達(dá)載體pMAL_C2X_CP，經(jīng) PCR、酶切和測(cè)序分析表明CP基因按正確的讀碼框插入原核表達(dá)載體，且堿基未發(fā)生突變。 重組質(zhì)粒PMAL-C2X-CP分別導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng) 0. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)之后發(fā)現(xiàn)帶有MBP標(biāo)簽的RRSV-CP-pMAL-ch能正確表達(dá)大小為SOKDa左右的重組蛋白，并利用MBP柱子純化，麥芽糖緩沖液洗脫，得到了濃度較高的純化蛋白。以純化的重組蛋白為免疫原及檢測(cè)抗原。2.免疫動(dòng)物
用表達(dá)的重組蛋白R(shí)RSV-CP免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠，lmg/ml純化的 RRSV的融合蛋白0. 5ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射 0. 2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0. 2ml每只，過(guò)3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在無(wú)血清的 RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無(wú)血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔的細(xì)胞板中， 37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時(shí)，以RRSV-CP檢測(cè)抗原為包被抗原，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲123個(gè)陽(yáng)性孔。選擇5個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得 1株能分泌抗RRSV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株4H5。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并能穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。5.單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)、水稻矮縮病毒(RDV)、水稻條紋病毒 (RSV)、南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)、水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻齒葉矮縮病毒 (RRSV)的病葉汁包被ELISA反應(yīng)板，以相應(yīng)的健康葉提取液作陰性對(duì)照，以水稻齒葉矮縮病毒為陽(yáng)性對(duì)照，用間接ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。間接ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后IOOul/ 孔包被ELISA板，4°C過(guò)夜或37°C 2小時(shí)，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用 1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3-6%牛血清封閉30_60min;加入單抗IOOul/孔，37°C1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說(shuō)明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)IOOul/孔，37°C 1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色， 2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2. 1為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4H5單抗對(duì)RRSV有特異性反應(yīng)，而與TuMV、TMV、ToMV, CMV、PVY、PVX、RDV, RSV, SRBSDV, RBSDV其他病毒均無(wú)特異性反應(yīng)。6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入 5-10 X IO5個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心 3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0. 06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min， 收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C條件下，流動(dòng)透析M小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-700C 保存。7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4H5單抗亞類為IgGl、kappa鏈。用常規(guī)間接ELISA 方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)在10 一7。
二、免疫學(xué)檢測(cè)方法及其試劑盒
1.用單抗建立間接抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測(cè)病毒 ACP-ELISA方法的操作步驟
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)按1: 30 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液或按 150 ul碳酸鹽緩沖液每頭褐飛虱加入后搗爛的上清IOOul/孔加入ELISA板，RRSV病葉或攜帶RRSV的褐飛虱為陽(yáng)性對(duì)照，相應(yīng)健康葉或非帶毒褐飛虱為陰性對(duì)照，37°C 2h，或4°C 包被過(guò)夜；
(2)PBST洗滌后，用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后IOOul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)或辣根過(guò)
氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗(Sigma)，IOOul/孔，37
°C,lh ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物或TMB底物IOOul/孔，室溫30min；
(6 )用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色或藍(lán)色的孔為陽(yáng)性，或用
2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)0D405或
450值，以P/N> 2. 1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
ACP-ELISA方法檢測(cè)靈敏度檢測(cè)
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對(duì)病葉從1 :10至5120作倍比稀釋或單頭褐飛虱進(jìn)行倍比稀釋50uL/頭至12800uL/頭，分別以相應(yīng)稀釋度的健康葉汁液作陰性對(duì)照，進(jìn)行上述ACP-ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對(duì)1 :10 320倍稀釋的病葉汁液及單頭褐飛虱稀釋到3200uL/頭時(shí)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到1 :320，對(duì)褐飛虱的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1600 uL/頭，表明ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。
2.檢測(cè)RRSV的TAS-ELISA檢測(cè)方法
2.1. TAS-ELISA方法的操作流程
1)抗RRSV的兔抗血清(表達(dá)的純化重組RRSVCP蛋白免疫兔子獲得)100ul/孔包被聚苯乙烯板，37 0C，2-4h或4°C，包被過(guò)夜；
2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3%BSA或3-6%牛血清封閉200ul/孔， 于 37°C 封閉 30-60min ；
3)加入檢測(cè)樣品IOOul/孔。以RRSV病葉或攜帶RRSV的褐飛虱為陽(yáng)性對(duì)照，以相應(yīng)的健康樣品或非帶RRSV的褐飛虱作陰性對(duì)照，37°C l-2h ；
4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水IOOul/孔，37°Cl-2h ；
5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP或HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma)IOOul/孔， 370C l-2h ；
6)PBST洗滌后加PNPP底物或TMB底物于室溫顯色5-30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色或藍(lán)色的孔為陽(yáng)性，2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè) 405nm或450nm的OD值，以P/N> 2. 1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。2. 2. TAS-ELISA檢測(cè)方法最適條件的確定
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即首先橫向分別加用包被緩沖液從1 : 100至1 10M00倍比稀釋的RRSV兔抗血清；第二步加入RRSV病葉汁(1 10)或褐飛虱勻漿液 (150ul/只)；第三步縱向分別加用封閉液從1 : 5至1 : 2048000倍比稀釋單抗腹水；第四步加入AP標(biāo)或HRP記的兔抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說(shuō)明書1 : 10000倍稀釋， ’第五步PNPP或TMB底物顯色(按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作)。結(jié)果為褐飛虱的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1 5000、1 8000。2. 3. TAS-ELISA方法檢測(cè)靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將RRSV病葉汁或褐飛虱勻漿液用PBS倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測(cè)定，結(jié)果為TAS-ELISA檢測(cè)病葉和褐飛虱的靈敏度分別達(dá)到 1:1250倍稀釋(w/v，g /mL)和1600 uL/頭，說(shuō)明本方法具有很好的靈敏度。3. dot-ELISA方法的建立及田間檢測(cè)應(yīng)用
3.1 dot-ELISA檢測(cè)水稻中RRSV方法的建立及其田間樣品檢測(cè)
將水稻葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1 10 30 (w/v, g /mL)加入0. 01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ 1上清點(diǎn)到NC膜上，同時(shí)設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育3(T60 min; PBST洗膜4 5次，每次 3 min; 66 μ L NBT 禾口 33 μ L BCIP 底物(Promega)加入到 10 ml 底物緩沖液(0. 1 mol/ L Tris CU0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、ρΗ9· 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)^ ο用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)水稻病葉的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明4H5單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)RRSV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)水稻葉片稀釋到1:320 mCw/v, g/mL)時(shí)，以4H5單抗建立的dot-ELISA檢測(cè)仍呈現(xiàn)紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:320倍稀釋(圖1)。用建立的dot-ELISA方法對(duì)2010、2011年采自福建福州、貴州荔波、浙江金華、 云南施甸縣等水稻田間疑似發(fā)病水稻樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50個(gè)水稻檢測(cè)樣品中有 21個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)(圖2)，陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的 dot-ELISA陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到RRSV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染RRSV。說(shuō)明該dot- ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于水稻樣品中水稻齒葉矮縮病毒的檢測(cè)。3. 2 dot-ELISA檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)RRSV方法的建立及其田間樣品檢測(cè)
單頭褐飛虱放入1. 5 mL的印pendorf的離心管中，并加入100 μ L PBS (0. 01mol/L, pH7. 4)，用牙簽搗爛褐飛虱后、5000 rpm離心3 min，取3 μ L上清點(diǎn)到NC膜上，膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測(cè)水稻中RRSV方法相同，不同的只是二抗為適度稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，顯色底物是HRP的顯色底物，即TMB顯色底物。同時(shí)設(shè)非帶毒和帶毒的褐飛虱作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)褐飛虱的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明4H5單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:4000和1:5000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)RRSV的dot-ELISA方法，檢測(cè)結(jié)果表明攜帶RRSV的褐飛虱呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，而無(wú)毒的褐飛虱沒(méi)有任何顯色反應(yīng)，即建立的dot-ELISA方法能特異性地檢測(cè)褐飛虱體內(nèi)的RRSV。靈敏度分析表明，當(dāng)單頭褐飛虱加800 μ L PBS時(shí)，以4Η5單抗建立的dot-ELISA檢測(cè)仍呈現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)褐飛虱的靈敏度達(dá)到1 :800稀釋(頭/yL)(圖3)。 用建立的dot-ELISA方法對(duì)2010、2011年采自福建福州、貴州荔波、云南施甸縣等水稻發(fā)病田間的褐飛虱、人工飼喂獲毒的和無(wú)毒的褐飛虱進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，110頭褐飛虱檢測(cè)樣品中有61頭產(chǎn)生藍(lán)色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，而無(wú)毒的褐飛虱沒(méi)有產(chǎn)生任何藍(lán)色斑點(diǎn)(圖 4)。陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到RRSV 特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染RRSV。說(shuō)明該dot- ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于褐飛虱樣品中水稻齒葉矮縮病毒的檢測(cè)。
3. 3水稻齒葉矮縮病毒dot-ELISA檢測(cè)試劑盒(檢測(cè)水稻和褐飛虱樣品)
1)試劑盒主要成分
RRSV單克隆抗體1管0. 2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗1管0. 1 ml
HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗1管0. 1 ml
NBT/BCIP底物各1瓶分別為2 ml和Iml
TMB底物1瓶10 ml
陽(yáng)性對(duì)照1 (含RRSV水稻葉片汁液)1管2 ml
陽(yáng)性對(duì)照2 (帶毒RRSV褐飛虱勻漿液)1管2ml
陰性對(duì)照1 (健康水稻葉片汁液)1管2 ml
陰性對(duì)照2 (非帶毒褐飛虱勻漿液)1管2 ml抗體稀釋液(IOX)I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張 2)檢測(cè)水稻樣品的操作步驟
a.將水稻葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30(w/v, g /mL)加入0.01 mol/ L PBS (pH7. 4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ 1上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照， 室溫干燥10 20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1:5000倍稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；
f.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 8000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
g.PBST洗膜4 5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0. 1 mol/L Tris C1、0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(紫色)，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。3)檢測(cè)白背飛虱樣品的操作步驟
a.單頭褐飛虱放入1.5mL的印pendorf的離心管中，并加入50 100 μ L PBS (0. 01mol/L，pH7. 4)，用牙簽搗爛褐飛虱后、5000 rpm離心3 min，取3 μ L上清點(diǎn)到NC膜上，同時(shí)設(shè)置帶毒和非帶毒的褐飛虱分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，室溫干燥10 20 min;
b.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
c.NC膜放入1:4000倍稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；
d.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
e.PBST洗膜4 5次，每次3 min;膜放入TMB底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
f.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(藍(lán)色)，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。4)保存及有效期
于2 8 °C避光保存，有效期12個(gè)月。5)緩沖液配方
磷酸鹽緩沖液(PBS，0. 01 mol/L, pH7. 4)NaCl8 gKCl0.2 gKH2PO40.2 gNa2HPO4* 12H203g疊氮化鈉0. 2 g
加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7. 4，定容至1000 ml
ELISA 洗滌液(0. 01 mol/L PBST)
1000 ml 0. 01mol/L PBS 中力口 0. 5 ml Tween-20
ELISA封閉液
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
權(quán)利要求
1.一種分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CGMCC No. 5536，其特征在于能分泌抗水稻齒葉矮縮病毒的單克隆抗體。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗水稻齒葉矮縮病毒的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_7，抗體類型及亞類為IgGl、kappa 鏈，該單克隆抗體能與水稻齒葉矮縮病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。
3.—種如權(quán)利要求2所述的抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用，其特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法及其免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌抗水稻齒葉矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。以純化的RRSV重組外殼蛋白為抗原免疫BALB/C小鼠，獲得1株穩(wěn)定傳代并分泌抗RRSV的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞4H5，其保藏號(hào)為CGMCCNo.5536。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞株4H5分泌的單抗與RRSV衣殼蛋白有特異性反應(yīng)。4H5單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-7，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。利用4H5單抗建立的檢測(cè)褐飛虱和水稻中RRSV的dot-ELISA檢測(cè)方法，當(dāng)單頭褐飛虱稀釋到800μL時(shí)，病葉1:320倍稀釋(w/v,g/mL)時(shí)仍能檢測(cè)到病毒。建立的dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、特異、靈敏地檢測(cè)田間褐飛虱及水稻樣品中的RRSV病毒。抗RRSV單抗的制備及其檢測(cè)方法的建立為該水稻病毒病的診斷、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102533665SQ20121000416
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳建祥, 周雪平, 董靜云 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)