專利名稱：Uplc-tqd聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種屬于藥物領域，尤其涉及一種同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的檢測方法。
背景技術：
萬古霉素是由一種鏈霉菌產(chǎn)生的、結(jié)構復雜的糖肽類抗生素，其分子式為 C66H74C1N9O24。主要用于葡萄球菌(包括耐青霉素和耐新青霉素株)、難辨梭狀芽胞桿菌等所致的系統(tǒng)感染和腸道感染，如心內(nèi)膜炎、敗血癥、偽膜性腸炎等。萬古霉素可抑制細菌細胞壁的合成，對金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌等作用強，對難辨校狀芽孢桿菌、炭疽桿菌、白喉桿菌等作用也良好。與其他抗生素無交叉耐藥性，極少耐藥菌株。妥布霉素是一種氨基糖苷類抗生素，分子式C18H37N509。妥布霉素能夠聯(lián)結(jié)在30S 和50S的聯(lián)結(jié)位置，阻礙70S復合物的形成，使mRNA不能翻譯成蛋白質(zhì)，導致細胞死亡。主要對革蘭陰性菌，如綠膿桿菌、大腸桿菌、克雷白桿菌、腸桿菌屬、變形桿菌、枸櫞酸桿菌有效。臨床主要用于敏感細菌引起的嚴重感染，如革蘭陰性菌特別是綠膿桿菌、大腸桿菌及肺炎桿菌等引起的燒傷感染、敗血癥、呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、膽囊膽道感染及軟組織嚴重感染等。萬古霉素可能發(fā)生以下不良反應，大多由于過量或快速滴注引起，并明顯與產(chǎn)品純度不夠有關。1.過敏反應與“紅頸綜合征”本品過敏反應發(fā)生率約為5%，主要表現(xiàn)為皮疹、發(fā)熱、寒戰(zhàn)及過敏樣反應。靜脈滴注過量或速度過快時可能發(fā)生“紅頸綜合征”，表現(xiàn)為紅斑，面頸部甚至胸部潮紅，藥物熱，低血壓，甚至發(fā)生休克樣反應。原因可能與組織胺大量釋放有關。2.腎損害過量用藥或腎功能不全時可能發(fā)生嚴重腎損害，表現(xiàn)為血尿、尿量過多或減少，甚至發(fā)生尿毒癥。3.耳毒性耳鳴，聽力減退，甚至聽力喪失引起不可逆耳聾。耳毒性可在早期產(chǎn)品純度存在問題時報道較多，現(xiàn)已少見。耳毒性可因合用其它有耳、 腎毒性藥物而加重。4.其它不良反應如靜脈炎；肌內(nèi)注射時局部疼痛，組織壞死；口服給藥治療偽膜性腸炎時可發(fā)生食欲減退，惡心嘔吐等消化道反應。妥布霉素常見的不良反應為眼局部的毒副作用與過敏反應，如眼瞼發(fā)癢與紅腫、 結(jié)膜紅斑，發(fā)生率低于3% ；局部應用其他氨基糖甙類抗生素也會出現(xiàn)這些不良反應。尚無應用妥布霉素出現(xiàn)其他不良反應的臨床報道。但是如果將眼用妥布霉素眼膏與氨基糖甙類抗生素全身聯(lián)合用藥，就應注意監(jiān)測血清中總的藥物濃度。創(chuàng)傷性骨髓炎通常由開放性骨折的術后感染，其次為閉合骨折切開復位或其他骨關節(jié)術后出現(xiàn)感染所致。因其病情復雜、病程漫長，并發(fā)、后遺癥多，臨床治療極為棘手，對病人的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重后果。目前顯微外科皮瓣植入合并抗生素應用是骨髓炎治療的主要手段，皮瓣植入與常規(guī)手術比具有創(chuàng)傷小、愈合快，并發(fā)后遺癥減少等優(yōu)點，載藥載體一次性給藥大大地降低了抗生素用量，在創(chuàng)傷性骨髓炎的治療中有很好的推廣應用價值。
目前萬古霉素含量測定的主要方法有分光光度法，高效液相法，固相萃取高效液相法，高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法，超高液相質(zhì)譜聯(lián)用技術等。妥布霉素的含量測定方法主要有濁度法，光度法，酸性染料比色法，高效液相蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)，高效液相柱前衍生化法，柱后衍生化高效液相色譜法，離子交換-脈沖積分安倍法，電噴霧離子阱質(zhì)譜法，高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法等。因此，對聯(lián)合應用萬古霉素及妥布霉素的骨髓炎患者聯(lián)合應用萬古霉素及妥布霉素的病，建立同時測定引流組織液樣本中的萬古霉素及妥布霉素含量的方法，能夠為藥物濃度檢測提供方法，達到提高藥物使用效率，降低毒副反應的目的。同時測定組織引流液中萬古霉素和妥布霉素含量的方法未見文獻報道及專利公開。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的檢測方法，為臨床藥物濃度監(jiān)測提供方案。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種應用超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(UPLC-TQD)，同時測定引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，該方法包括以下的步驟
1)對照品的配制
精密稱取萬古霉素、妥布霉素對照品，分別置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的對照品溶液，備用；
2)內(nèi)標溶液的配制
精密稱取阿替洛爾對照品，置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標溶液，備用；
3)樣品溶液制備
精密量取骨髓炎患者術后引流組織液，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的阿替洛爾內(nèi)標溶液，渦旋混勻，精密加入乙腈沉淀蛋白，充分渦旋，高速離心后，分離上清液；上清液中加入適量二氯甲烷，充分渦旋，進行液液萃取，高速離心，定量吸取上清液，加等量純水稀釋，即得樣品溶液，備用；
4)流動相溶液的配制
精密量取色譜純乙腈，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸乙腈溶液，作為流動相A相，備用；精密量取純水，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸水溶液，作為流動相B相，備用；
5)色譜條件的設置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為2. 1 X IOOmm，填料內(nèi)徑為1. 7 μ m的色譜柱；柱溫為45°C，流動相流速為0. 3ml/min ；取步驟1)的對照品溶液與步驟2)的內(nèi)標溶液，定量進樣，進行梯度洗脫；采用二極管整列檢測器進行色譜峰檢測；
6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化
選擇三重四級桿質(zhì)譜儀，正離子模式下，采用MRM掃描模式，萬古霉素m/z :725-144 ；妥布霉素 m/z =468-324 ；阿替洛爾 m/z :267-74 ；
取步驟1)對照品溶液、步驟2)的內(nèi)標溶液，定量進樣，進行質(zhì)譜分析，并由此得到對照品及內(nèi)標物的標準質(zhì)譜7)樣品測定
取步驟3)的樣品溶液，分別定量進樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測定，分別得到萬古霉素、妥布霉素對照品、阿替洛爾內(nèi)標物以及樣品的總離子流圖，樣品圖譜中，與萬古霉素、妥布霉素對照品以及阿替洛爾內(nèi)標物相同保留時間處，為引流液樣品中的待測萬古霉素與妥布霉素，以及定量加入的阿替洛爾內(nèi)標物；
8)梯度濃度對照品溶液的配制
精密吸取步驟1)的對照品溶液，置于容量瓶中，加純水，稀釋成梯度濃度的萬古霉素對照品溶液以及妥布霉素對照品溶液，備用；
9)標準曲線制備
取骨髓炎患者空白組織液多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度對照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標樣品溶液，在步驟7)的條件下進行測定；以萬古霉素峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值對萬古霉素濃度進行線性回歸，得到回歸方程，為萬古霉素的標準曲線y=35. 522x+0. 1351，r=0. 9981 ；以妥布霉素峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值對妥布霉素濃度進行線性回歸，得到回歸方程，為妥布霉素的標準曲線y=16. 593x-0. 0327， r=0. 9959 ；其中y為被測物峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值，χ為被測物質(zhì)量濃度； 10)數(shù)據(jù)分析計算
記錄萬古霉素，妥布霉素和阿替洛爾的峰面積，計算萬古霉素與內(nèi)標阿替洛爾峰面積的比值和妥布霉素與內(nèi)標阿替洛爾峰面積的比值，分別代入各自的標準曲線，計算出萬古霉素和妥布霉素的質(zhì)量濃度；即為組織引流液中兩種藥物的局部濃度。作為進一步改進，上述的步驟5)中流動相梯度洗脫程序如下0-1. OOmin， 5%A 相和 95%B 相；1. 00min-4. OOmin, 40%A 相和 60%B 相；4. 00min-4. 50min,99%A 相和 1%B 相；4. 50min-6. 50min,99%A 相和 1%B 相；6. 50min-7. OOmin, 5%A 相和 95%B 相； 7. OOmin-lO. OOmin, 5%A相和95%B相，進行梯度洗脫。作為進一步改進，上述的步驟6)的質(zhì)譜參數(shù)條件如下毛細管電壓3KV，提取電壓 30V,錐孔電壓3V，源溫度150°C，去溶劑溫度400°C，去溶劑氣750L/hr，錐孔氣50L/hr，碰撞氣流速0. 15mL/min ；妥布霉素二級質(zhì)譜碰撞能20V，MRM掃描時間0. 4 Imin ；阿替洛爾二級質(zhì)譜碰撞能22V，MRM掃描時間2. 5 3. 5min ；萬古霉素二級質(zhì)譜碰撞能15V，MRM掃描時間 3. 3 4min。作為進一步改進，上述的步驟8)定量稀釋成濃度梯度為10mg/mL、5mg/mL、2. 5mg/ mL、lmg/mL、0. 5mg/mL、0. lmg/mL 的萬古霉素對照品溶液和 lmg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、 0. lmg/mL,0. 05mg/mL、0. 025mg/mL的妥布霉素對照品溶液。作為進一步改進，上述的步驟9)中取0. 4mL骨髓炎患者空白組織液6份，編號 1 6號，1號加入0. lmg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 025mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;2號加入0. 5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 05mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;3號加入lmg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. Olmg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;4號加入2. 5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 25mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;5號加入5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 5mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50μ L ;6號加入lOmg/mL的萬古霉素對照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L0本發(fā)明由于采用了上述的技術方案及步驟，具有以下的特點
1、方法先進性
超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術是目前國內(nèi)較先進的分析檢測手段，與傳統(tǒng)的液相色譜、氣相色譜、光譜分析方法比，聯(lián)用三重四級桿質(zhì)譜儀，采用MRM掃描模式，大大提高方法靈敏度及準確度。本發(fā)明首次采用該技術同時測定骨髓炎患者組織液中萬古霉素和妥布霉素的含量，方法先進可行，能夠為該聯(lián)用技術開展多組分化合物的同時定量測定應用提供實驗依據(jù)；
2、方法快捷高效，低損耗
采用超高效液相色譜技術，所有化合物在^iin內(nèi)完成分析檢測，快捷方便；流動相流速0. 3ml/min，進樣量2μ L，大大減少流動相消耗，所需的樣品量極少；能夠滿足大批量樣品檢測的需要，最終實現(xiàn)臨床應用；
3、臨床應用前景及作用良好
藥物濃度檢測作為臨床安全、合理用藥的重要手段，能夠提供體內(nèi)藥物濃度數(shù)據(jù)。本方法建立的方法能夠為萬古霉素及妥布霉素的藥物濃度監(jiān)測提供切實可行的方法，臨床應用前景良好，能夠為臨床合理用藥，提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費用，發(fā)揮積極的作用。
圖1為對照品紫外色譜圖與質(zhì)量色譜圖。圖2為樣品紫外色譜圖與質(zhì)量色譜圖。圖3為妥布霉素質(zhì)譜圖。圖4為萬古霉素質(zhì)譜圖。圖5為內(nèi)標物阿替洛爾質(zhì)譜圖。圖6為妥布霉素標準曲線圖。圖7為萬古霉素標準曲線圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的具體實施方式
做一個詳細的說明。超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，該方法包括以下的步驟。
1)對照品的配制
精密稱取萬古霉素對照品lOOmg、妥布霉素對照品10mg，分別置于IOmL容量瓶中，加入純水溶解，分別定量配成質(zhì)量濃度為lOmg/mL的萬古霉素對照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對照品溶液，備用。2)內(nèi)標溶液的配制
精密稱取阿替洛爾對照品5. Omg，置于IOmL容量瓶中，加入純水溶解，精密吸取上述溶液0. anl，置于IOmL容量瓶中，加入純水溶解，配成質(zhì)量濃度為0. Olmg/mL的阿替洛爾內(nèi)標溶液，備用。
3)樣品溶液制備
精密量取骨髓炎患者術后引流組織液0. 5mL，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2) 的阿替洛爾內(nèi)標溶液25 μ L，渦旋混勻，精密加入乙腈0. 5mL沉淀蛋白，充分渦旋，14000r/ min高速離心Smin后，分離上清液；上清液中加入0. 5mL 二氯甲烷，充分渦旋，進行液液萃取，14000r/min高速離心8min，吸取上清液200 μ L，加等量純水稀釋，即得樣品溶液，備用。4)流動相溶液的配制
精密量取色譜純乙腈，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸乙腈溶液，作為流動相A相，備用；精密量取純水，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸水溶液，作為流動相B相，備用。5)色譜條件的設置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為2. IXlOOmm，填料內(nèi)徑為 1. 7 μ m的色譜柱；柱溫為4 5 °C，流動相流速為0. 3mL/m i η ；取步驟1)的對照品溶液與步驟2)的內(nèi)標溶液，進樣2 μ L，優(yōu)化的流動相梯度洗脫程序0-1.00min，5%A相和 95%B 相；1.00min-4.00min，40%A 相和 60%B 相；4. OOmin-4. 50min，99%A 相和 1%B 相；4. 50min-6. 50min,99%A 相和 1%B 相；6. 50min-7. 00min,5%A 相和 95%B 相； 7. OOmin-lO. OOmin, 5%A相和95%B相，進行梯度洗脫；采用二極管整列檢測器進行色譜峰檢測。6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化
選擇三重四級桿質(zhì)譜儀(Waters TQD)，正離子模式下，采用MRM掃描模式，萬古霉素m/ ζ 725 144 ；妥布霉素m/z :468 324 ；阿替洛爾m/z :267 74。取步驟1)對照品溶液、步驟2)的內(nèi)標溶液，分別進樣2 μ L，在優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)條件下(毛細管電壓3KV，提取電壓30V，錐孔電壓3V，源溫度150°C，去溶劑溫度400°C，去溶劑氣750L/hr，錐孔氣50L/hr，碰撞氣流速0. 15mL/min。妥布霉素二級質(zhì)譜碰撞能20V，MRM 掃描時間0. 4 Imin ；阿替洛爾二級質(zhì)譜碰撞能22V，MRM掃描時間2. 5 3. 5min ；萬古霉素二級質(zhì)譜碰撞能15V，MRM掃描時間3. 3 ％iin。)進行質(zhì)譜分析，由此得到對照品及內(nèi)標物的標準質(zhì)量色譜圖。7)樣品測定
取步驟3)的樣品溶液，分別進樣2 μ L，在步驟5)與步驟6)的條件下，測定，分別得到萬古霉素、妥布霉素對照品、阿替洛爾內(nèi)標物以及樣品的質(zhì)量色譜圖(mass chromatogram), 樣品色譜中，與萬古霉素、妥布霉素對照品以及阿替洛爾內(nèi)標物相同保留時間處，為引流液樣品中的待測萬古霉素與妥布霉素，以及定量加入的阿替洛爾內(nèi)標物；且各物質(zhì)質(zhì)譜圖與標準品質(zhì)譜圖一致。8)梯度濃度對照品溶液的配制
各精密吸取步驟1)的對照品溶液，置于容量瓶中，加純水，定量稀釋成濃度梯度為 10mg/mL、5mg/mL、2. 5mg/mL、lmg/mL、0. 5mg/mL、0. lmg/mL 的萬古霉素對照品溶液以及 lmg/ mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、0. lmg/mL、0. 05mg/mL、0. 025mg/mL 的妥布霉素對照品溶液，配對備用。9)標準曲線制備
取0. 4mL骨髓炎患者空白組織液6份，編號1 6號，1號加入0. lmg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 025mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;2號加入0. 5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 05mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;3號加入lmg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 01mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;4號加入2. 5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 25mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;5號加入5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 5mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;6號加入10mg/mL的萬古霉素對照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L。按照步驟3)方法操作，得到梯度加標樣品溶液；在步驟7)的條件下進行測定。以萬古霉素峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值對萬古霉素濃度進行線性回歸，得到回歸方程，為萬古霉素的標準曲線y=35. 522χ+0. 1351 (r=0. 9981)； 以妥布霉素峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值對妥布霉素濃度進行線性回歸，得到回歸方程， 為妥布霉素的標準曲線y=16. 593x-0. 0327 (r=0. 9959)。其中y為被測物峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值，χ為被測物質(zhì)量濃度。
10)數(shù)據(jù)分析計算
記錄萬古霉素，妥布霉素和阿替洛爾的峰面積，計算萬古霉素與內(nèi)標阿替洛爾峰面積的比值和妥布霉素與內(nèi)標阿替洛爾峰面積的比值，分別代入各自的標準曲線，計算出萬古霉素和妥布霉素的質(zhì)量濃度。即為組織引流液中兩種藥物的局部濃度。
權利要求
1.超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)對照品的配制精密稱取萬古霉素、妥布霉素對照品，分別置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的對照品溶液，備用；2)內(nèi)標溶液的配制精密稱取阿替洛爾對照品，置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標溶液，備用；3)樣品溶液制備精密量取骨髓炎患者術后引流組織液，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的阿替洛爾內(nèi)標溶液，渦旋混勻，精密加入乙腈沉淀蛋白，充分渦旋，高速離心后，分離上清液；上清液中加入適量二氯甲烷，充分渦旋，進行液液萃取，高速離心，定量吸取上清液，加等量純水稀釋，即得樣品溶液，備用；4)流動相溶液的配制精密量取色譜純乙腈，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸乙腈溶液，作為流動相A相，備用；精密量取純水，定量加入色譜純甲酸，配制成體積濃度為0. 1%的甲酸水溶液，作為流動相B相，備用；5)色譜條件的設置選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為2. 1 X IOOmm，填料內(nèi)徑為1. 7 μ m的色譜柱；柱溫為45°C，流動相流速為0. 3ml/min ；取步驟1)的對照品溶液與步驟2)的內(nèi)標溶液，定量進樣，進行梯度洗脫；采用二極管整列檢測器進行色譜峰檢測；6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化選擇三重四級桿質(zhì)譜儀，正離子模式下，采用MRM掃描模式，萬古霉素m/z :725-144 ；妥布霉素 m/z =468-324 ；阿替洛爾 m/z :267-74 ；取步驟1)對照品溶液、步驟2)的內(nèi)標溶液，定量進樣，進行質(zhì)譜分析，并由此得到對照品及內(nèi)標物的標準質(zhì)譜圖；7)樣品測定取步驟3)的樣品溶液，分別定量進樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測定，分別得到萬古霉素、妥布霉素對照品、阿替洛爾內(nèi)標物以及樣品的總離子流圖，樣品圖譜中，與萬古霉素、妥布霉素對照品以及阿替洛爾內(nèi)標物相同保留時間處，為引流液樣品中的待測萬古霉素與妥布霉素，以及定量加入的阿替洛爾內(nèi)標物；8)梯度濃度對照品溶液的配制精密吸取步驟1)的對照品溶液，置于容量瓶中，加純水，稀釋成梯度濃度的萬古霉素對照品溶液以及妥布霉素對照品溶液，備用；9)標準曲線制備取骨髓炎患者空白組織液多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度對照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標樣品溶液，在步驟7)的條件下進行測定；以萬古霉素峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值對萬古霉素濃度進行線性回歸，得到回歸方程，為萬古霉素的標準曲線y=35. 522x+0. 1351，r=0. 9981 ；以妥布霉素峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值對妥布霉素濃度進行線性回歸，得到回歸方程，為妥布霉素的標準曲線y=16. 593x-0. 0327， r=0. 9959 ；其中y為被測物峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值，χ為被測物質(zhì)量濃度； 10)數(shù)據(jù)分析計算記錄萬古霉素，妥布霉素和阿替洛爾的峰面積，計算萬古霉素與內(nèi)標阿替洛爾峰面積的比值和妥布霉素與內(nèi)標阿替洛爾峰面積的比值，分別代入各自的標準曲線，計算出萬古霉素和妥布霉素的質(zhì)量濃度；即為組織引流液中兩種藥物的局部濃度。
2.根據(jù)權利要求1所述的超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟5)中流動相梯度洗脫程序如下 0-1. 00min，5%A 相和 95%Β 相；1. 00min-4. OOmin，40%A 相和 60%B 相；4. 00min-4. 50min,99%A 相和 1%B 相；4. 50min-6. 50min,99%A 相和 1%B 相；6. 50min-7. OOmin, 5%A 相和 95%B 相； 7. OOmin-lO. OOmin, 5%A相和95%B相，進行梯度洗脫。
3.根據(jù)權利要求1所述的超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟6)的質(zhì)譜參數(shù)條件如下毛細管電壓3KV，提取電壓30V，錐孔電壓3V，源溫度150°C，去溶劑溫度400°C，去溶劑氣750L/hr，錐孔氣50L/hr，碰撞氣流速0. 15mL/min ；妥布霉素二級質(zhì)譜碰撞能20V，MRM掃描時間0. 4 Imin ；阿替洛爾二級質(zhì)譜碰撞能22V，MRM掃描時間2. 5 3. 5min ；萬古霉素二級質(zhì)譜碰撞能15V, MRM掃描時間3. 3 4min。
4.根據(jù)權利要求1所述的超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟8)定量稀釋成濃度梯度為IOmg/ mL、5mg/mL、2. 5mg/mL、lmg/mL、0. 5mg/mL、0. lmg/mL 的萬古霉素對照品溶液和 lmg/mL、 0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、0. lmg/mL、0. 05mg/mL、0. 025mg/mL 的妥布霉素對照品溶液。
5.根據(jù)權利要求1所述的超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，其特征在于步驟9)中取0. 4mL骨髓炎患者空白組織液6份，編號1 6號，1號加入0. lmg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 025mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;2號加入0. 5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 05mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;3號加入lmg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. Olmg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;4號加入2. 5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 25mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L ;5號加入5mg/mL的萬古霉素對照品溶液和0. 5mg/mL的妥布霉素對照品溶液各50μ L ;6號加入lOmg/mL的萬古霉素對照品溶液和lmg/mL的妥布霉素對照品溶液各50 μ L0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種屬于藥物領域，尤其涉及一種同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的檢測方法。超高液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術同時測定組織引流液中萬古霉素與妥布霉素含量的方法，該方法包括以下的步驟1)對照品的配制；2)內(nèi)標溶液的配制；3)樣品溶液制備；4)流動相溶液的配制；5)色譜條件的設置；6)質(zhì)譜條件的優(yōu)化；7)樣品測定；8)梯度濃度對照品溶液的配制；9)標準曲線制備；10)數(shù)據(jù)分析計算。本發(fā)明具有以下的特點1、方法先進性；2、方法快捷高效，低損耗；3、臨床應用前景及作用良好。
文檔編號G01N30/02GK102539573SQ20121000385
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權日2012年1月9日
發(fā)明者吳人杰, 壽旦, 張春, 沈立鋒, 董宇 申請人:浙江省中醫(yī)藥研究院