專利名稱：穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒。
背景技術(shù)：
乙醇(酒精)存在于大部分酒精類飲料中，其代謝的速率主要取決于體內(nèi)酶的含量，具有較大的個(gè)體差異。眾所周知，少量飲酒可以促進(jìn)血液循環(huán)，但是大量酒精攝入則會導(dǎo)致酒精依賴，可造成精神和多器官功能損害，其中以對肝臟功能和精神功能的危害最為多見，也最為嚴(yán)重。乙醇的成癮性、濫用和依賴是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生問題之一，在西方國家，酒精相關(guān)性肝病已成為死亡的重要原因。因此血乙醇測定在急性乙醇中毒診斷及法醫(yī)學(xué)鑒定中起著舉足輕重的作用。生物樣品中乙醇的定量測定方法主要有化學(xué)比色法、酶終點(diǎn)比色法、均相酶免疫測定法、氣相色譜法和呼出氣乙醇分析法等。氣相色譜法被認(rèn)為是乙醇測定的參考方法。 氣相色譜法首先用NaCl飽和液在一封閉的容器中將血清或血樣稀釋，在封閉容器的上部是揮發(fā)的氣體。這樣取樣使標(biāo)本清潔，很小或沒有基質(zhì)影響。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以完成峰值的定量。缺點(diǎn)是儀器昂貴，手續(xù)復(fù)雜不便推廣。酶法自動(dòng)分析法分乙醇氧化酶法和乙醇脫氫酶法，氧化酶法試劑組成簡單，樣品不需預(yù)處理，但特異性差，甲醇對測定干擾大，可出現(xiàn)假陽性。乙醇脫氫酶對于乙醇是相對特異的，不會與甲醇、丙酮或異丙醇等起催化反應(yīng)，因此準(zhǔn)確度和精密度較高，并且其可在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行測定，速度快，與氣相色譜法相關(guān)性好，其原理如下
乙醇+輔酶I+ 乙醇脫誦 > 乙醛+還原型輔酶I+H+
根據(jù)乙醇被乙醇脫氫酶氧化生成乙醛的同時(shí)伴有輔酶I生成還原型輔酶I，產(chǎn)生的還原型輔酶I可直接在340 nm處比色檢測，利用還原型輔酶I的酶法同正在使用中的許多其他酶法相似，能在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器上完成，這在醫(yī)學(xué)上有合適的靈敏度。酶分析法具有特異性高，操作簡單快捷、準(zhǔn)確安全、可自動(dòng)化分析的優(yōu)點(diǎn)，但由于乙醇脫氫酶極不穩(wěn)定，高濃度在近中性純水中5°C時(shí)僅可穩(wěn)定存在幾天，在酸性(pH低于 6.0)和堿性(pH大于8. 5)溶液中不穩(wěn)定，并且重金屬和目前普遍使用的反應(yīng)促進(jìn)劑如鹽酸氨基脲、甘氨酸等對其有明顯抑制作用；此外，試劑中使用的輔酶I在該反應(yīng)條件下不穩(wěn)定；因此該試劑必須制成干粉試劑才能長期保存穩(wěn)定，復(fù)溶后也必須盡快使用，否則在保存過程中由于乙醇脫氫酶和輔酶I降解速度較快對試劑性能會造成很大影響，無法滿足臨床檢測需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種準(zhǔn)確度、精密度均較好，穩(wěn)定性好，2 8°C 避光保存至少可穩(wěn)定12個(gè)月，完全能滿足臨床檢驗(yàn)要求的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，該試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1各組分及濃度為
緩沖液(pH 8. 5-9. 5) 0. 05 0. 5 M (mol/L) 反應(yīng)促進(jìn)劑廣200 g/L
穩(wěn)定劑0. Γ10 g/L
防腐劑0. ΓΙΟ g/L ；
試劑2各組分及濃度為 緩沖液(pH 6. 0-7. 0) 0. 05 0. 5 M
β -輔酶I (又稱輔酶I或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)0. Γ10 g/L
乙醇脫氫酶0. 2 200 KU/L
復(fù)合穩(wěn)定劑0. Γ10 g/L
激活劑0. 1 100 g/L
防腐劑0. Γ10 g/L。本發(fā)明上述試劑1中的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液，磷酸鈉緩沖液等中的一種，優(yōu)選 4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液。本發(fā)明上述試劑1中的反應(yīng)促進(jìn)劑為丁二酸、鹽酸氨基脲、甘氨酸、雙苷肽、乙醛脫氫酶等中的一種或幾種(即兩種或者兩種以上的混合，混合的幾種組分之間的配比關(guān)系沒有要求)。本發(fā)明上述試劑1中的穩(wěn)定劑為吐溫20、吐溫80、布里杰_；35 (Brij-35),曲拉通 100 (曲拉通X-100)等非離子表面活性劑中的一種或幾種。本發(fā)明上述試劑2中的緩沖液為羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液等中的一種，優(yōu)選羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液，PH 6. 0-7. 0。上述的復(fù)合穩(wěn)定劑為谷胱甘肽、半胱氨酸、蔗糖、海藻糖或血清白蛋白中的一種或幾種與酶復(fù)合穩(wěn)定劑M03 (ES-W03)，酶復(fù)合穩(wěn)定劑M07 (ES-W07),酶復(fù)合穩(wěn)定劑M08 (ES-W08)中的一種組成的(即復(fù)合穩(wěn)定劑是從谷胱甘肽、半胱氨酸、蔗糖、海藻糖或血清白蛋白中的一種或幾種再與酶復(fù)合穩(wěn)定劑M03，酶復(fù)合穩(wěn)定劑M07，酶復(fù)合穩(wěn)定劑M08中的一種一起混合使用)。上述的激活劑為巰基乙醇、二巰基蘇糖醇、半胱氨酸和乙二酸四乙酸二鈉中的一種或幾種(即兩種或者兩種以上的混合，混合的幾種組分之間的配比關(guān)系沒有要求)。本發(fā)明的防腐劑為疊氮鈉或proclin系列防腐劑(如Proclin300)等。本發(fā)明試劑1和試劑2的配制方法為常規(guī)方法，即按照上述配方比例，分別將試劑 1和試劑2所述的各組分分別加入蒸餾水后各自混合攪勻即可。本發(fā)明試劑盒測定樣本中的乙醇的測試條件如下溫度30-37 °C ；比色杯光徑為 1. 0 cm。檢測主波長340 nm。應(yīng)用本發(fā)明乙醇測定試劑盒測定樣本中乙醇的方法如下樣品(校準(zhǔn)管以校準(zhǔn)品做樣品)加試劑1混勻，30-37°C孵育3-5 min后讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻， 30-37°C反應(yīng)5 min后，讀取吸光度Al，ΔΑ = A1-A0。其中樣本用量2 μ ，試劑1用量200μ ，試劑2用量50 μι。
本發(fā)明試劑盒測定樣本中乙醇含量按以下公式進(jìn)行計(jì)算
乙醇濃度遍定-Μ空白xC標(biāo)準(zhǔn) a I 準(zhǔn)—空白 t^
本發(fā)明的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)及顯著進(jìn)步主要表現(xiàn)在
(1)本發(fā)明通過在試劑2中添加復(fù)合穩(wěn)定劑，保護(hù)了乙醇脫氫酶和輔酶I在PH 6. 0-7. 0 緩沖液中的穩(wěn)定性，本發(fā)明試劑2-8°C保存至少可穩(wěn)定12個(gè)月，完全能滿足臨床檢驗(yàn)要求。(2)本發(fā)明通過在試劑2中添加激活劑，一定程度上規(guī)避了反應(yīng)促進(jìn)劑對乙醇脫氫酶的抑制作用。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。本發(fā)明的檢測原理如下根據(jù)乙醇被乙醇脫氫酶氧化生成乙醛的同時(shí)伴有輔酶I 生成還原型輔酶I，產(chǎn)生的還原型輔酶I可直接在340 nm處比色檢測，吸光度變化率與樣本中的乙醇濃度成正比。實(shí)施例1
試劑1各組分及濃度為 磷酸鈉緩沖液(pH 8. 5) 0. IM 鹽酸氨基脲 2 g/L 吐溫201 g/L
Proclin3000. 1 g/L ；
試劑2各組分及濃度為
三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(PH 6.0) 0. 05 M
輔酶 I0. 5 g/L
乙醇脫氫酶 20 KU/L
海藻糖(復(fù)合穩(wěn)定劑)10 g/L
ES-W03 (復(fù)合穩(wěn)定劑)10 g/L
巰基乙醇(激活劑)2 g/L
Proclin300 0· 2 g/L。試劑1和試劑2的配制方法為常規(guī)方法，即試劑1和試劑2所述組分分別加入蒸餾水后各自混合攪勻即可。實(shí)施例2
試劑1各組分及濃度為
三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(PH 9.5)0. 05 M 雙苷肽5 g/L
吐溫 8010 g/L
Proclin300 0. 2 g/L ；試劑2各組分及濃度為
3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液(pH 6.5) 0. 1 M 輔酶I 5 g/L 乙醇脫氫酶 50 KU/L 半胱氨酸(復(fù)合穩(wěn)定劑)5 g/L ES-W07 (復(fù)合穩(wěn)定劑)1 g/L 二巰基蘇糖醇(激活劑) 10 g/L 疊氮鈉 0. 1 g/L。實(shí)施例2試劑盒的制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3
試劑1各組分及濃度為
4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液(pH 9.5) 0. 1 M
甘氨酸 10 g/L
布里杰-35 5 g/L
疊氮鈉 0. 1 g/L
試劑2各組分及濃度為
羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液(pH 7.0) 0. 1 M
輔酶I5 g/L
乙醇脫氫酶50 KU/L
谷胱甘肽(復(fù)合穩(wěn)定劑)2 g/L
ES-W08 (復(fù)合穩(wěn)定劑) 2 g/L
半胱氨酸(激活劑) 10 g/L
乙二酸四乙酸二鈉(激活劑)1 g/L
Proclin3000. 1 g/L。實(shí)施例3試劑盒的制備方法同實(shí)施例1。對照例1
按實(shí)施例3進(jìn)行配制，但不添加復(fù)合穩(wěn)定劑谷胱甘肽和ES-W08。對照例2
按實(shí)施例3進(jìn)行配制，但不添加激活劑乙二酸四乙酸二鈉。
實(shí)施例所用的原料，除另有說明外，均為市售工業(yè)品。本發(fā)明試劑盒測定樣本中的乙醇的測試條件如下溫度30-37 °C ；比色杯光徑為 1. 0 cm。檢測主波長340 nm。應(yīng)用本發(fā)明乙醇測定試劑盒測定樣本中乙醇的方法如下樣品(校準(zhǔn)管以校準(zhǔn)品做樣品)加Rl混勻，30-37°C孵育3-5 min后讀取吸光度AO，立即加入R2混勻，30_37°C反應(yīng)5 min后，讀取吸光度Al，ΔΑ = A1-A0。其中樣本用量2 μ ，試劑1用量200 μ ，試劑2 用量50 μ 。
本發(fā)明試劑盒測定樣本中乙醇含量按以下公式進(jìn)行計(jì)算
權(quán)利要求
1. 一種穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于該試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1各組分及濃度為 緩沖液(pH 8. 5-9. 5) 0. 05 0. 5 M 反應(yīng)促進(jìn)劑廣200 g/L穩(wěn)定劑0. Γ10 g/L防腐劑0. ΓΙΟ g/L ；試劑2各組分及濃度為緩沖液(pH 6. 0-7.0)0.05 0. 5 Mβ-輔酶I0.Γιο g/L乙醇脫氫酶0.2"。200 KU/L復(fù)合穩(wěn)定劑0.Γ10 g/L激活劑0.1g 100 g/L防腐劑0.Γ10 g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑1中的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、磷酸鈉緩沖液中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑1中的緩沖液為4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑1中的反應(yīng)促進(jìn)劑為丁二酸、鹽酸氨基脲、甘氨酸、雙苷肽、乙醛脫氫酶中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑1中的穩(wěn)定劑為吐溫20、吐溫80、布里杰-35、曲拉通100中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑2中的緩沖液為羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑2中的緩沖液為羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑2中所述的復(fù)合穩(wěn)定劑為谷胱甘肽、半胱氨酸、蔗糖、海藻糖或血清白蛋白中的一種或幾種與酶復(fù)合穩(wěn)定劑M03，酶復(fù)合穩(wěn)定劑M07，酶復(fù)合穩(wěn)定劑M08中的一種混合使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于試劑2中所述所述的激活劑為巰基乙醇、二巰基蘇糖醇、半胱氨酸、乙二酸四乙酸二鈉中的一種或幾種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，其特征在于所述的防腐劑為疊氮鈉或proclin系列防腐劑2。
全文摘要
本發(fā)明公開一種穩(wěn)定的乙醇測定液體試劑盒，該試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1為緩沖液(pH8.5-9.5)0.05~0.5M，反應(yīng)促進(jìn)劑1~200g/L，穩(wěn)定劑0.1~10g/L，防腐劑0.1~10g/L；試劑2為緩沖液(pH6.0-7.0)0.05~0.5M，β-輔酶I 0.1~10g/L，乙醇脫氫酶 0.2~200KU/L，復(fù)合穩(wěn)定劑0.1~10g/L，激活劑0.1g~100g/L，防腐劑0.1~10g/L。本發(fā)明的試劑盒具有準(zhǔn)確度、精密度均較好，穩(wěn)定性好，2～8℃避光保存至少可穩(wěn)定12個(gè)月，完全能滿足臨床檢驗(yàn)要求的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N21/31GK102495220SQ20111034726
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者沃燕波, 鄒炳德 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司