專利名稱：一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分子領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1992年綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA序列被克隆以來，基于GFP的標(biāo)記技術(shù)迅 速發(fā)展。隨著GFP晶體結(jié)構(gòu)的解析，熒光蛋白突變導(dǎo)致理化特性改變的研究，以及新熒光蛋 白物種的發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白及其突變體作為報告分子或功能探針已被廣泛地用于生命科學(xué)的 研究中，例如基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位、生物分子之間相互作用、轉(zhuǎn)基因動物等。基于熒光蛋白的分子標(biāo)記技術(shù)，具有生物相容性好、可用于長時程動態(tài)監(jiān)測、以及 活細(xì)胞內(nèi)精確空間定位的特點，在活體和活細(xì)胞水平的生物分子動態(tài)研究中發(fā)揮了重要作 用。尤其是源自珊瑚蟲的紅色熒光蛋白(dRFP583)的發(fā)現(xiàn)，以及在此蛋白基礎(chǔ)上突變獲得 的一批成熟更快、熒光強度更強、光譜紅移的紅色熒光蛋白和遠(yuǎn)紅色熒光蛋白，如TagRFP、 mKate、Katushka, mLumin等，極大地促進了熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)在活體分子成像研究中的應(yīng) 用。然而，橙色、紅色和遠(yuǎn)紅色熒光蛋白(發(fā)射峰大于550nm)通常是以二聚體或四聚 體的形式存在。對于生物分子(如蛋白質(zhì)、離子、核酸分子等)功能研究而言，熒光蛋白的多 聚化很容易造成以熒光蛋白作為標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白非特異性地聚集，或影響其所標(biāo)記蛋白質(zhì) 的理化性質(zhì)，從而導(dǎo)致檢測的光學(xué)信號不能真實地反映生物分子信息。因此，可發(fā)生多聚化 的熒光蛋白不適合作為熒光標(biāo)記物用于目標(biāo)蛋白的運動、定位及相互作用研究。現(xiàn)階段針 對熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)的研究熱點之一，是如何獲得理化特性好的熒光蛋白單體。而對如何 將熒光蛋白突變體的多聚化性質(zhì)應(yīng)用于生物學(xué)研究中，關(guān)注較少，僅限于對活細(xì)胞的示蹤。靶向性多肽(targeting ρ印tide，簡稱TP)的鑒定通常是使用化學(xué)小分子染料對 多肽進行標(biāo)記，例如，用FITC標(biāo)記多肽進行細(xì)胞水平的光學(xué)成像鑒定，或Cy5. 5標(biāo)記多肽在 活動物體內(nèi)進行光學(xué)成像鑒定。以熒光蛋白作為靶向性多肽的報告分子，用于活細(xì)胞表面 的檢測或多肽特異性的鑒定，雖有報道，但并非主流方法。其原因在于，與熒光染料標(biāo)記方 法相比，熒光蛋白偶聯(lián)的多肽探針檢測靈敏度較低，且僅限于活細(xì)胞水平的研究應(yīng)用，尚未 見到用于活體分子成像的報道。研究表明，細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，其內(nèi)吞效率與配體的效價密切相關(guān)。針 對受體介導(dǎo)內(nèi)吞的這種特性，將靶向肽與納米載體進行共價偶聯(lián)，適當(dāng)增加納米載體表面 偶聯(lián)的靶向肽數(shù)目，由此產(chǎn)生的多價性質(zhì)使得受體介導(dǎo)納米載體內(nèi)吞的效率顯著提高。目 前尚無文獻報道利用熒光蛋白的多聚化特性形成具有多價效應(yīng)的多肽熒光探針。在根據(jù)多價效應(yīng)進行信號放大的方法中，生物素和親合素(ABC法)或鏈霉素和親 和素(SP法)的標(biāo)記方法應(yīng)用最為廣泛。但是ABC法和SP法都不適應(yīng)于內(nèi)源性生物素含 量較高的組織如肝臟、腎臟和脾臟，因此存在一定的局限性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種構(gòu)建多肽熒光探針的方法，此探針具有多價效應(yīng)、納米 尺寸效應(yīng)和廣泛生物組織適用性，可高靈敏度地用于活細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測或多肽特異 性的活體鑒定。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法是利 用基因重組技術(shù)，將靶向肽序列同時融合到熒光蛋白的氨基端和羧基端，或分別融合到熒 光蛋白的氨基端或羧基端，構(gòu)建成多肽熒光探針；所述熒光蛋白能發(fā)生四聚化。 進一步地，所述多肽熒光探針具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)。一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的應(yīng)用，所述多肽熒光探針可 用于靈敏地檢測活細(xì)胞表面標(biāo)志物。一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的應(yīng)用，所述多肽熒光探針可 用于多肽特異性的活體鑒定。本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明構(gòu)建出的具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針，可以用于活細(xì)胞 表面標(biāo)志物的靈敏檢測以及特異性多肽的活體鑒定，具有高效、直接、經(jīng)濟等特點。由于熒 光蛋白的多聚化特性，使得多肽熒光探針與細(xì)胞受體之間存在一種多價效應(yīng)，極大提高探 測靈敏度，因此只要能發(fā)生四聚化的熒光蛋白，都在此專利技術(shù)應(yīng)用范圍內(nèi)。此外，基于四 聚體熒光蛋白的多肽探針具有納米尺寸(> 7nm)，使之在生物活體內(nèi)的靶向運輸和分布優(yōu) 于小分子化學(xué)探針。與一般的生物素和親合素(ABC法)或鏈霉素和親和素(SP法)的標(biāo) 記方法相比，ABC法和SP法能使探針達(dá)到4價效應(yīng)，而本專利中基于四聚化熒光蛋白的多 肽探針可以實現(xiàn)8價效應(yīng)；而且ABC法與SP法對于有些內(nèi)源性生物素含量較高的組織如肝 臟、腎臟和脾臟不是很適用，而本專利方法可用于一切活細(xì)胞、組織、以及整體動物。本發(fā)明 的多肽熒光探針只需一次構(gòu)建，低成本大量擴增，且純化簡單。同時本發(fā)明的多價效應(yīng)探針 使用只需一步，而ABC法與SP法制備的多價效應(yīng)探針使用時是二步法。
圖1為熒光蛋白偶聯(lián)的多肽探針與活細(xì)胞表面標(biāo)志物相互作用的示意圖。(a)基 于單體熒光蛋白的多肽探針，其單價作用難以誘導(dǎo)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞，(b)基于多聚化熒光蛋 白的多肽探針，及其多價效應(yīng)導(dǎo)致的高效受體介導(dǎo)內(nèi)吞。圖2為等摩爾濃度fRFP，fRFP-TP和TP_fRFP_TP的相對熒光強度光譜圖。圖 3 為 fRFP，fRFP-TP 和 TP_fRFP-TP 的 10 % SDS-PAGE 凝膠電泳圖。(a) SDS-PAGE 凝膠電泳的白光圖像，(b) SDS-PAGE凝膠電泳的熒光圖像。圖4為fRFP，fRFP-TP,TP-fRFP-TP和白蛋白(BSA)的快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC) 圖。圖5為激光共聚焦顯微成像比較fRFP，fRFP-TP和TP_TP_fRFP-TP進入 SK0V-3 (ErbB2+)細(xì)胞或 IfepG2 (ErbB2")細(xì)胞的效率。(a) fRFP 與 SK0V-3 孵育，(b) fRFP-TP 與 SK0V-3 孵育，(c)TP-fRFP-TP 與 SK0V-3 孵育，(d) TP-fRFP-TP 與 IfepG2 孵育。標(biāo)尺= 20mmo
圖6為使用ErbB2_和ErbB2+共存的NIH3T3細(xì)胞進行激光共聚焦顯微成像，驗證 TP-fRFP-TP探針的特異性，標(biāo)尺=10_。
具體實施方式
實施例1本實施例選用的是遠(yuǎn)紅熒光蛋白KatuShkaS158A (簡稱fRFP)，該熒光蛋白優(yōu)良的 光學(xué)特性參數(shù)(例如，熒光亮度高、熒光光譜> 620nm)，使之無論是在活細(xì)胞還是在活體動 物的光學(xué)成像研究中均有非常大的應(yīng)用價值。其具體構(gòu)建步驟如下1)利用基因重組技術(shù)將靶向性多肽(targeting peptide,簡稱TP)序列 LTVSPffYLTVSPffY分別偶聯(lián)到fRFP的氨基端或羧基端，形成fRFP-TP或TP-fRFP，或同時偶 聯(lián)到氨基和羧基端，形成TP-fRFP-TP。由于Katushka的多聚化特性，使得此熒光蛋白-多 肽復(fù)合體成為具有多價效應(yīng)的探針。熒光蛋白偶聯(lián)的多肽探針與活細(xì)胞表面標(biāo)志物相互作 用時，細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的單價或多價探針內(nèi)吞的示意圖，如圖1所示。質(zhì)粒pRSET-f RFP-TP，pRSET-TP-fRFP-TP 構(gòu)建過程如下以 pRSET_KatushkaS158A 為模板，PCR 擴增出 KatushkaS 158A-GGGS-LTVSP WYLTVSPff(上游弓丨物CGGGATCCCGATGGTGGGTGAGGATAGCGTGCTGATCACC，下游弓丨物R1， CGTAAGATACCAAGGAGACACGGT CAGGCTACCGCCTCCGCTGTGCCCCAGTTTGCTAGG ；R2, CCCAAGCTTTTA ATACCAAGGGCTAACCGTAAGATACCAAGGAGACACGGTCGGC)與 LTVSPWYLTVSPWY_GGGS_KatushkaS1 58A-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY (上游引物F1，GGTATCTTACGGTTAGCCCTTGGTATGGAGGCGGTAGCATGGTGGGTGAGGAT AGCGTG ；F2, CGCGGATCCCCTGACCGTGTCTCCTTGGTATCTTACGGTTAGCCCTTGGTATGGAGG, Rl, CGTAA GATACCAAGGAGACACGGTCAGGCTACCGCCTCCGCTGTGCCCCAGTTTGTAGG ； R2，CCCAAGCTTTTAATACCA AGGGCTAACCGTAAGATACCAA GGAGACACGGTCAGGC)，擴增后的 PCR 片段切膠回收后，用 BamHI/ HindIII雙酶切，然后酶聯(lián)入pRSET載體(BamHI/Hindlll)中，構(gòu)建質(zhì)粒pRSET-fRFP-TP和 pRSET-TP-fRFP-TPο2)等摩爾濃度fRFP、fRFP_TP和TP_fRFP_TP的相對熒光強度及熒光光譜圖，如圖 2所示。實驗結(jié)果表明，TP與fRFP偶聯(lián)后影響了 fRFP的熒光強度。3)多肽探針的10% SDS-PAGE凝膠電泳和FPLC分析與鑒定。10% SDS-PAGE凝膠 電泳結(jié)果，如圖3所示，表明fRFP，fRFP-TP與TP-fRFP-TP均為四聚體。如圖4所示，fRFP, fRFP-TP和TP-fRFP-TP的FPLC結(jié)果，精確地鑒別了由于fRFP上偶聯(lián)TP的效價不同而導(dǎo) 致的三種蛋白質(zhì)的分子量差異，與BSA (7nm)相比較可知，fRFP-TP和TP-fRFP-TP的納米尺 寸大于7nm。因而，此類多肽探針具有納米顆粒的尺寸效應(yīng)，在生物體內(nèi)不會立即從腎臟排 出，預(yù)計其體內(nèi)循環(huán)的半衰期將長于小分子化學(xué)探針，有助于在腫瘤組織局部的蓄積。
4)等摩爾濃度的fRFP、fRFP-TP和TP-fRFP-TP分別與SK0V-3細(xì)胞孵育2h，激光 共聚焦顯微成像結(jié)果，如圖5所示，證實具有多價(八價)性質(zhì)的TP-fRFP-TP能最有效地 被ErbB2+細(xì)胞攝取。 5)NIH3T3(ErbB2-)細(xì)胞轉(zhuǎn)染ErbB2_mCitrine質(zhì)粒后，僅部分細(xì)胞表達(dá) ErbB2-mCitrine,即ErbB2陽性與陰性細(xì)胞共存。TP-fRFP-TP與此細(xì)胞群孵育后，僅高表達(dá)ErbB2的NIH3T3細(xì)胞可以特異攝取TP-fRFP-TP，而NIH3T3本身未檢測到fRFP信號，如圖 6所示。6)純化的遠(yuǎn)紅色熒光蛋白靶向肽TP-fRFP-TP過濾除菌后，尾靜脈注射荷瘤裸鼠， 可用于腫瘤的整體熒光成像。實施例2本實施例選用的是紅熒光蛋白DsRed，激發(fā)和發(fā)射峰波長分別為557納米和579納 米。將ErbB2受體靶向肽LTVSPWY重組在四聚體熒光蛋白DsRed的羧基端和氨基兩端，形 成 LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY(簡稱 TP-DsRed-TP)。ErbB2 受體 陽性腫瘤細(xì)胞株SK0V-3細(xì)胞可高效攝入TP-DsRed-TP。其具體構(gòu)建步驟如下1)質(zhì)粒 pRSET-LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSPWYL TVSPWY 構(gòu)建過程如 下以 pDsRed-Express 為模板，PCR 擴增出 LTVSPWYLTVSPff-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSP WYLTVSPW(上游引物F1，CGCGGATCCCTTTTGTGATGGTTTCTATGCTTGTTATAAAGATGTTGGTGG, F2, CTATGCTTGTTATAAAGATGTTGGTGGTGGTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCA ；下游引物R1 :CCCAAG CTTGTAGACAAGTATTGTGCATACTTTGGTGA CTGTTTCGGTG, R2 TACTTTGGTGACTGTTTCGGTGGTGGTCA GGAA CAGGTGG TGGCG GCC)2)純化的TP-DsRed-TP過濾除菌后，與SK0V-3細(xì)胞孵育2h，激光共聚焦顯微成像 結(jié)果證實具有ErbB2靶向性。實施例3本實施例選用的是綠色熒光蛋白ZsGreen，成熟后為四聚體，激發(fā)和發(fā)射峰波長分 別為493納米和505納米。將ErbB2受體靶向肽LTVSPWY重組在ZsGreen羧基端和氨基兩 端，形成 LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-ZsGreen-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY (簡稱 TP-ZsGreen-TP)。具 體實施途徑與實施例2相同。TP-ZsGreen-TP同樣有多價效應(yīng)，SK0V-3細(xì)胞可通過細(xì)胞表 面的ErbB2受體高效介導(dǎo)多肽探針的攝入。除上述三個實施例中提到的三種四聚體熒光蛋 白外，其它四聚體熒光蛋白ZsYellowl和AmCyanl也可用于制備具有多價效應(yīng)的多肽探針。上述三個實施例所述的基因重組是指利用不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片 段的交換和重新組合，形成新DNA分子的過程。以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā) 明進行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)可理解，并可對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修 改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要 求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法是利用基因重組技術(shù)，將靶向性多肽序列分別融合到熒光蛋白的氨基端、羧基端、或氨基和羧基兩端，構(gòu)建成多肽熒光探針；所述熒光蛋白能發(fā)生四聚化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的構(gòu)建方法， 其特征在于，所述多肽熒光探針具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)。
3.一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽 熒光探針可用于高靈敏地檢測活細(xì)胞表面標(biāo)志物。
4.一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，所述多肽 熒光探針可用于特異性多肽的活體鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)的多肽熒光探針的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物分子領(lǐng)域。該構(gòu)建方法是利用基因重組技術(shù)，將多肽熒光探針序列分別融合到熒光蛋白的氨基端、羧基端、或氨基和羧基兩端，構(gòu)建成多肽熒光探針；所述熒光蛋白能發(fā)生四聚化。利用該方法構(gòu)建出來的多肽熒光探針具有多價效應(yīng)和納米尺寸效應(yīng)，并且可用于高靈敏地檢測活細(xì)胞表面標(biāo)志物以及特異性多肽的活體鑒定。
文檔編號G01N21/64GK101876658SQ20091031036
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者張智紅, 駱海明, 駱清銘 申請人:華中科技大學(xué)