專利名稱：脂肪油中有效成分的一種測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪油中有效成分的一種測定方法。
背景技術(shù)：
海狗系深海哺乳動(dòng)物，生活在北極圈以內(nèi)-50℃的高寒水域中，以名貴的鱈魚為食，皮下有厚厚的脂肪層，體內(nèi)富含ω-3多烯脂肪酸。以加拿大北部無污染海域海狗脂肪為原料提煉出的海狗脂肪油，其中含有三種重要的ω-3多烯脂肪酸-EPA(Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸)、DPA(Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸)和DHA(Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)，且總含量在20％以上。醫(yī)學(xué)界經(jīng)過多年的研究已經(jīng)證實(shí)，這三種脂肪酸對人體有多種獨(dú)特的生物學(xué)活性EPA具有改善血液循環(huán)、軟化血管、調(diào)整血脂、降低血壓和血糖以及抗炎作用；DHA和DPA具有營養(yǎng)大腦、促進(jìn)胎兒和兒童大腦發(fā)育、保護(hù)視力、調(diào)節(jié)免疫和抗癌作用，其中DHA又被稱作“腦黃金”。近期人們又發(fā)現(xiàn)它們對一些疾病具有治療作用EPA已被開發(fā)作為治療動(dòng)脈硬化和高血脂的藥物；還發(fā)現(xiàn)海狗油對II型糖尿病、脂肪肝和前列腺炎具有治療和預(yù)防作用。
人體自身不能合成ω-3多烯脂肪酸，只能從外界攝取，深海冷水魚油中雖然也還有ω-3多烯脂肪酸，但其與海狗油相比除含量一般較低外，還有以下重大區(qū)別1.海狗與人類同為哺乳類動(dòng)物，其體內(nèi)甘油脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人類相似，ω-3多烯脂肪酸一般位于甘油三脂的1、3位，而魚是低級冷血?jiǎng)游?，?3多烯脂肪酸位于甘油三脂的2位，要經(jīng)過人體肝臟代謝后才能利用。因此海狗油的ω-3多烯脂肪酸相比之下有更好的生物利用度，且不會(huì)增加肝臟負(fù)擔(dān)。
2.海狗油中還含有2-3％的角鯊烯，這也是魚油中沒有的，這種物質(zhì)有效抑制生物中不良膽固醇的吸收并加速其代謝，還具有防癌作用，另外對皮膚也有滋潤作用。
3.海狗油中不僅富含EPA和DHA，并且富含DPA，而大多數(shù)魚油中DPA含量很低。
4.海狗油中幾乎不含膽固醇，而大多數(shù)魚油卻含有較多膽固醇。
因此，海狗油相對于魚油具有更高的應(yīng)用價(jià)值，可幫助人們戰(zhàn)勝糖尿病、脂肪肝、冠心病等長期困擾人類的“現(xiàn)代文明病”。
海狗油等脂肪油中脂肪酸的含量測定多采用柱前衍生毛細(xì)管氣相色譜法，近年來HPLC測定法由于其外標(biāo)定量準(zhǔn)確、方法重現(xiàn)性良好、有足夠的分離度、儀器相對比較普及，并可以為中低壓液相制備提供依據(jù)等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而越來越受到重視。
脂肪油的堿催化轉(zhuǎn)酯化方法國內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道，但現(xiàn)有的操作步驟均較繁瑣，衍生后需進(jìn)行多次萃取，處理時(shí)間長，且耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，所以此方法還需進(jìn)一步改進(jìn)。對于海狗油來說，采用衍生方法中脂肪油的堿催化轉(zhuǎn)酯化方法，操作步驟繁瑣，要求衍生后進(jìn)行多次萃取，再合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，最后減壓吹干萃取劑再定容。按此步驟操作，每處理一個(gè)樣品約需4-6小時(shí)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且浪費(fèi)大量有機(jī)溶劑，不利人體健康，也破壞了環(huán)境。而且采用傳統(tǒng)樣品衍生方法，回收率低，僅83.6％左右，衍生化試劑也需現(xiàn)用現(xiàn)配，給操作帶來不便。因此目前海狗油等脂肪油中有效成分的測定方法還需進(jìn)一步改進(jìn)，才能更為準(zhǔn)確地測定脂肪油中的有效成分EPA、DHA和DPA的含量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供脂肪油中有效成分的一種測定方法，該方法采用柱前衍生反相HPLC法，簡化了樣品衍生化操作步驟，無需萃取，節(jié)省了時(shí)間和試劑，能保證完全酯化的衍生條件，采用適當(dāng)?shù)纳V分離條件，將目的組分與雜質(zhì)完全基線分離。
本發(fā)明的另一目的在于提供海狗油中有效成分的一種測定方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供脂肪油中有效成分的一種測定方法，包括以下步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油與含0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽以1∶30-100體積比混合搖勻，在0-60℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入酸終止反應(yīng)，用醇定容，過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液；2)色譜進(jìn)樣分析取衍生處理后的脂肪油，進(jìn)入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動(dòng)相甲醇水系統(tǒng)、乙腈四氫呋喃水系統(tǒng)或乙腈甲醇水系統(tǒng)，等梯度洗脫，
流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202～230nm，進(jìn)樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標(biāo)法測定脂肪酸的含量。
其中，所述的脂肪油為魚油、植物油或海狗油等含有三種多烯脂肪酸EPA、DPA和DHA的脂肪油，所測定脂肪油中的有效成分是指三種ω-3多烯脂肪酸EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可測定這三種脂肪酸中的一種或多種。本方法尤其適合海狗油中這三種ω-3多烯脂肪酸的測定。
其中，步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸終止反應(yīng)，用醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
進(jìn)一步地說，所述的衍生化處理方法為取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應(yīng)15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應(yīng)，用甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
衍生化反應(yīng)中所述的醇的堿金屬鹽可為甲醇鈉、乙醇鈉或甲醇鉀等，優(yōu)選為甲醇鈉，甲醇鈉在15天以內(nèi)催化衍生化能力基本無變化。其濃度為0.2-1.0mol/L，優(yōu)選為0.5-0.8mol/L。
終止反應(yīng)所用的酸為冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸等中的任意一種，定容所用的醇為甲醇、乙醇等。
為了使產(chǎn)品具有更好的穩(wěn)定性，定容時(shí)可加0.001％-0.005％的抗氧化劑，所述的抗氧化劑為2，6-二叔丁基對甲酚或?qū)αu基叔丁基茴香醚。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的衍生化處理在0-60℃下反應(yīng)5-30分鐘，為了便于操作，衍生化反應(yīng)更優(yōu)選在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)15分鐘。
本發(fā)明色譜儀所用的色譜柱可為Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm和LichrospherRP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。以RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型號為好。如Waters高效液相色譜儀，Lichrospher高效液相色譜儀，Mightsil高效液相色譜儀。優(yōu)選的，液相色譜儀為RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型號。
在選擇色譜儀的色譜條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)檢測波長在202～230nm之間均可，其中210nm處三種脂肪酸吸收較強(qiáng)且穩(wěn)定，精密度也符合藥典要求，故檢測波長選用210nm為佳。
本發(fā)明選擇甲醇水系統(tǒng)、乙腈四氫呋喃水系統(tǒng)或乙腈甲醇水系統(tǒng)三種系統(tǒng)中的任意一種作為流動(dòng)相進(jìn)行等梯度洗脫。經(jīng)反復(fù)調(diào)試，改變比例，最終發(fā)現(xiàn)乙腈甲醇水系統(tǒng)最好，在其比例為7∶1∶2流速逐漸提高至1.1-1.5ml/min，最后發(fā)現(xiàn)在流速為1.2ml/min時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最佳。所以流動(dòng)相優(yōu)選為乙腈甲醇水系統(tǒng)，三者比例為7∶1∶2，流速為1.2ml/min，同時(shí)柱溫選擇在15-45℃。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一目的提供海狗油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)色譜進(jìn)樣分析取衍生處理后的海狗油供試品溶液，進(jìn)入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動(dòng)相甲醇水系統(tǒng)、乙腈四氫呋喃水系統(tǒng)或乙腈甲醇水系統(tǒng)，等梯度洗脫，流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202-230nm，進(jìn)樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標(biāo)法測定脂肪酸的含量。
所述的衍生化處理方法優(yōu)選為取脂肪油100-120μl，置于10-200量瓶中，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應(yīng)15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.003％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
更優(yōu)選的衍生化處理方法為取海狗油120μl，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，搖勻，室溫反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
其中，所測定海狗油中的有效成分是指三種ω-3多烯脂肪酸EPA-Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸；DPA-Docosapentaenoic Acid，二十二碳五烯酸和DHA-Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸，本方法可測定這三種脂肪酸中的一種或多種。
本發(fā)明的脂肪油中有效成份的一種測定方法是本發(fā)明技術(shù)人員多年對測定方法摸索的結(jié)果，具有以下優(yōu)點(diǎn)1.脂肪油的堿催化轉(zhuǎn)酯化方法國內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道，但操作步驟均較繁瑣，都要求衍生后進(jìn)行多次萃取，再合并萃取液用無水硫酸鈉干燥，最后減壓吹干萃取劑再定容。按此步驟操作，每處理一個(gè)樣品約需4-6小時(shí)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且浪費(fèi)大量有機(jī)溶劑，不利人體健康，也破壞了環(huán)境。本發(fā)明經(jīng)步驟優(yōu)化后，每處理一個(gè)樣品僅需0.5小時(shí)左右，且無需萃取，節(jié)省了大量時(shí)間和有機(jī)溶劑。
2.采用傳統(tǒng)樣品衍生方法，結(jié)果回收率僅83.6％左右，這與其操作步驟較多，樣品有損失有關(guān)，本發(fā)明簡化了操作步驟，提高了回收率，回收率接近100％。
3.現(xiàn)有的衍生化試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配，給操作帶來不便。本發(fā)明對衍生化試劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，證明其15天內(nèi)穩(wěn)定，節(jié)省了操作時(shí)間和試劑。
4.傳統(tǒng)樣品衍生方法要求10℃反應(yīng)10分鐘，操作不便。本發(fā)明對衍生時(shí)間和溫度進(jìn)行了考察，在室溫下即可進(jìn)行衍生化操作，找到了方便操作又能保證完全酯化的衍生條件。
5.本發(fā)明在對色譜條件進(jìn)行研究的過程中，對不同色譜柱進(jìn)行篩選，篩選出Lichrospher RP-18色譜柱，尋到了理想的色譜條件，最終將目的組分與雜質(zhì)完全基線分離。
6.本發(fā)明所述的測定方法為進(jìn)一步對海狗油純化打下了基礎(chǔ)。
圖1為海狗油衍生化程度考察，其中3為未衍生樣品，4為衍生樣品，5為未完全衍生樣品；圖2為樣品與樣品中加入對照品的光譜圖；圖3為Allsphere Octyl柱最佳分離色譜圖；圖4為Waters-C18柱最佳分離色譜圖；圖5為Lichrospher RP-18柱最佳分離色譜圖；圖6為甲醇水系統(tǒng)最佳分離色譜圖；圖7為乙腈四氫呋喃水系統(tǒng)最佳分離色譜圖；圖8為乙腈甲醇水系統(tǒng)最佳分離色譜圖；圖9為1.0ml/min流速下的色譜圖；圖10為室溫分離色譜圖；圖11為30℃分離色譜圖；圖12為空白試驗(yàn)與樣品對照色譜圖；圖13為Mightsil RP-18柱色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1本實(shí)施例所述的海狗油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油120μl，置于10ml量瓶中，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，搖勻，室溫反應(yīng)15分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.005％BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)取20μl衍生處理后的海狗油供試品溶液，進(jìn)入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱Lichrospher RP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；流動(dòng)相乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.2ml/min；柱溫45℃；檢測波長210nm；
進(jìn)樣量20μl；3)記錄色譜圖，測定EPA、DHA和DPA三種脂肪酸的含量。
采用本發(fā)明所述的測定方法測得樣品海狗油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA6.92％，回收率99.10％；DHA9.76％，回收率98.90％；DPA4.18％，回收率99.60％。
實(shí)施例2本實(shí)施例所述的海狗油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油80μl，置于50ml量瓶中，加入0.8mol/L甲醇鈉6ml，搖勻，40℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.3ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.003％BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)取30μl衍生處理后的海狗油供試品溶液，進(jìn)入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱LichrospherRP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；流動(dòng)相甲醇∶水＝3∶2，等梯度洗脫；流速1.3ml/min；柱溫30℃；檢測波長202nm；進(jìn)樣量30μl；3)記錄色譜圖，測定EPA、DHA和DPA三種脂肪酸的含量采用本實(shí)施例所述的測定方法測得樣品海狗油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA7.06％，回收率99.70％；DHA9.829％，回收率98.70％；DPA 4.29％，回收率99.50％。
實(shí)施例3本實(shí)施例所述的海狗油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油100μl，置于100ml量瓶中，加入1.0mol/L甲醇鈉8ml，搖勻，50℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.5ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.001％BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)取50μl衍生處理后的海狗油供試品溶液，進(jìn)入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；流動(dòng)相乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.3ml/min；柱溫15℃；檢測波長220nm；進(jìn)樣量50μl；3)記錄色譜圖，測定EPA、DHA和DPA三種脂肪酸的含量。
采用本實(shí)施例所述的測定方法測得樣品海狗油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA7.15％，回收率97.90％；DHA9.75％，回收率99.60％；DPA4.21％，回收率99.30％。
實(shí)施例4本實(shí)施例所述的鯡魚油有效成分的測定方法，包括以下步驟1)鯡魚油的衍生化處理取鯡魚油90μl，置于200ml量瓶中，加入0.6mol/L乙醇鈉5ml，搖勻，10℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.35ml鹽酸終止反應(yīng)，用含0.002％2，6一二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的鯡魚油供試品溶液；2)取40μl衍生處理后的鯡魚油供試品溶液，注入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為色譜柱Waters SymmetryShield RP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；流動(dòng)相乙腈四氫呋喃水系統(tǒng)＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.4ml/min；柱溫40℃；檢測波長230nm；進(jìn)樣量40μl；3)記錄色譜圖，測定EPA和DHA兩種脂肪酸的含量。
采用本實(shí)施例所述的測定方法測得樣品鯡魚油中三種多烯脂肪酸的百分含量(W/W)為EPA 6.828％，回收率99.80％；DHA 6.35％，回收率98.50％。
實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例在于研究脂肪油—海狗油的衍生化處理方法。
1.試劑及樣品樣品海狗油，產(chǎn)自加拿大TerraNova漁業(yè)有限公司。
試劑2，6-二叔丁基對甲酚(BHT)、金屬鈉、金屬鉀、冰醋酸、無水乙醚、正己烷、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、乙醇、酚酞、鹽酸、丙酮、三乙胺均為國產(chǎn)分析純；高純氮?dú)?，F(xiàn)isher公司產(chǎn)品；α-溴代苯乙酮，色譜純，Wako公司產(chǎn)品。
2.衍生化方法的選擇2.1α-溴代苯乙酮衍生法取海狗油20μl，精確稱定，加入2ml2.0％氫氧化鉀-乙醇置5ml離心管中，氮?dú)饷芊?00℃皂化30分鐘。冷卻至室溫后以酚酞為指示劑、鹽酸乙醇(4∶1)中和，離心取上清液，氮?dú)獯蹈?，再加?00μlα-溴代苯乙酮的丙酮溶液(10mg/ml)及100μl三乙胺的丙酮溶液(10mg/ml)，充氮密封后沸水浴5分鐘。冷卻后加入160μl冰醋酸的丙酮溶液(2mg/ml)，再次沸水浴5分鐘。所得反應(yīng)液0.45μm濾膜過濾，氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入0.15ml甲醇溶液，取5μl進(jìn)樣。
本衍生法由于在脂肪酸鏈羧基端引入了苯環(huán)結(jié)構(gòu)，使得被測物在254nm處有很強(qiáng)的吸收，故幾種目的組分HPLC的檢測限可達(dá)0.25ng，此方法衍生步驟繁瑣，操作費(fèi)時(shí)，且回收率難以保證。
2.2堿催化一步轉(zhuǎn)酯化法取海狗油約0.2g，精密稱定，溶于4ml四氫呋喃，與新制0.5mol/L甲醇鈉溶液8ml混合，10℃反應(yīng)約10分鐘，加入0.4ml冰醋酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液用20ml蒸餾水稀釋后，以50ml乙醚分三次萃??；合并萃取液，用無水Na2SO4及KHCO3干燥后，減壓抽干，甲醇定容至100ml，0.2μm濾膜過濾，進(jìn)樣20μl。
該方法操作相對簡便，且利用脂肪酸中多個(gè)雙鍵較強(qiáng)的遠(yuǎn)紫外端(210nm)吸收，幾種目的組分HPLC的檢測限約7-8ng，可很好的滿足定量要求，故采用此方法作進(jìn)一步的研究。
3.衍生化步驟的研究原方法操作步驟較多，回收率較低，僅83％左右。分析衍生反應(yīng)機(jī)理及各反應(yīng)物和產(chǎn)物性質(zhì)并結(jié)合反相分離的特點(diǎn)，認(rèn)為反應(yīng)產(chǎn)生的少量鹽在反相柱上基本不保留，對分離無影響，而水在流動(dòng)相中本來就有，也不必除去；另外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海狗油酯化后可溶于甲醇，衍生前加入四氫呋喃也沒必要。故將方法改為衍生完后直接定容進(jìn)樣，步驟如下取海狗油80-120μl，置于瓶中，加入0.5-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應(yīng)5-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm-0.3μm膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
經(jīng)多次重復(fù)，并和原方法對比，結(jié)果證明本發(fā)明方法完全可行，對目的組分的分離無任何影響，且大大簡化了操作步驟，省去了四氫呋喃溶劑的添加，及萃取步驟，同時(shí)卻能保證較高的樣品回收率，并節(jié)省了大量有機(jī)溶劑。
4.溫度對衍生化反應(yīng)的影晌由于各文獻(xiàn)報(bào)道的衍生反應(yīng)溫度各不相同，故對樣品衍生溫度進(jìn)行考察取海狗油6份各120μl分別置10ml棕色容量瓶中，精密稱定，均分三組，平行操作，按優(yōu)化好步驟衍生，反應(yīng)溫度分別為第一組冰浴(0℃)，第二組室溫(15℃)，三組60℃水浴。衍生10分鐘后終止反應(yīng)，各進(jìn)樣兩次，考察溫度對衍生化反應(yīng)的影響。
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度對反應(yīng)速率有一定影響冰浴組樣品油滴最早消失，室溫組其次，60℃水浴組最饅，說明低溫可加速該衍生反應(yīng)，但10分鐘后油滴都消失。另外不斷振搖可明顯加速衍生反應(yīng)，這是由于振搖可使海狗油滴破裂為小油滴，增大了油與衍生化試劑的接觸面積，加快了反應(yīng)的進(jìn)行。
表1溫度對衍生化反應(yīng)的影響結(jié)果
由表1可知，溫度在0℃到60℃之間變化對衍生化反應(yīng)結(jié)果影響較小，經(jīng)初步統(tǒng)計(jì)分析，其中EPA甲酯(EPAM)變異較大，故以其峰面積為考察指標(biāo)，對各衍生溫度下結(jié)果進(jìn)行方差分析，比較各組之間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見表2和表3。
表2不同反應(yīng)溫度對EPAM峰面積影響結(jié)果表
表3不同反應(yīng)溫度對EPAM峰面積影響方差分析表
由于F0.05(2.9)＝4.26，方差分析計(jì)算所得F＝0.7955＜F0.05(2.9)，P＞0.05，所以三組數(shù)據(jù)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明盡管衍生溫度不同，最后反應(yīng)都達(dá)到一個(gè)共同的平衡。溫度可選擇在在0-60℃之間，為了便于操作，衍生化反應(yīng)優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。
5.衍生化試劑甲醇鈉穩(wěn)定性考察因有的文獻(xiàn)報(bào)道甲醇鈉不穩(wěn)定，須現(xiàn)用現(xiàn)配，給試驗(yàn)帶來較大不便；而有的文獻(xiàn)卻說甲醇鈉可室溫放置數(shù)月而保持穩(wěn)定，故考察甲醇鈉的穩(wěn)定性。
配制0.5mol/L甲醇鈉溶液7份，分別室溫(約15℃左右)放置1、2、3、5、10、15、30天。取海狗油7份，精密稱定，平行操作，分別加入7種放置不同時(shí)間的甲醇鈉進(jìn)行衍生。各進(jìn)樣兩次，以DHA為考察對象，以峰面積除以取樣量的商為指標(biāo)，考察衍生化試劑穩(wěn)定性。
由表5可見，甲醇鈉在15天以內(nèi)催化衍生化能力基本無變化，峰面積/取樣量僅下降約1％；到第30天略有下降，峰面積/取樣量僅下降約4.5％，故甲醇鈉配好后最少可用15天。
表5甲醇鈉室溫放置對催化能力的影響
6.衍生化完全程度考察取海狗油及衍生化樣品點(diǎn)于硅膠G薄層板(110℃活化1h)上，石油醚(沸程30～60℃)-乙醚(9∶1)展開，噴0.02％Rhodamin6G乙醇液，于紫外燈(365nm)下觀察(見圖1)。脂肪酸甲酯的Rf值大于甘油三酯，衍生后樣品中甘油三酯點(diǎn)的消失，說明衍生化完全。
圖中4衍生完后樣品中甘油三酯斑點(diǎn)已完全消失，樣品衍生完全。
7.樣品衍生化方法的確立綜上可知，樣品衍生化方法為取海狗油80-120μl，置于瓶中，加入0.5-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應(yīng)5-30分鐘，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.001％-0.005％2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm-0.3μm膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
最佳樣品衍生化方法為取海狗油120μl，精密稱定，置100ml棕色容量瓶中，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，不斷振搖，室溫反應(yīng)約15分鐘，加入0.2ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.005％/BHT的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例在于研究液相色譜儀的色譜條件。
1.儀器及試劑儀器島津(Shimadzu)201OA高效液相色譜儀、紫外雙波長檢測器、Class-VP色譜工作站；Waters515泵、996型二極管陣列檢測器、Millennium32色譜工作站；MiIlipore超純水制備機(jī)。
試劑高純氮?dú)?；甲醇、乙腈色譜純，F(xiàn)isher公司產(chǎn)品；三氟乙酸，色譜純，Merck公司產(chǎn)品；α-溴代苯乙酮，色譜純，Wako公司產(chǎn)品；EPA甲酯(EPAM)標(biāo)準(zhǔn)液(9.99mg/ml)、DHA甲酯(DHAM)標(biāo)準(zhǔn)液(9.81mg/ml)、DPA甲酯(DPAM)標(biāo)準(zhǔn)液(9.94mg/ml)，Supelco公司產(chǎn)品。
2.目的峰的確認(rèn)利用相同條件下對照品和樣品保留時(shí)間對照法和樣品中加入對照品峰面積增大法對樣品中的目的組分進(jìn)行了確認(rèn)。
由圖2可見，在相同色譜條件下樣品中1號峰和EPAM對照品保留時(shí)間相同，2號峰和DHAM對照品保留時(shí)間相同，3號峰和DPAM保留時(shí)間相同。在樣品中分別加入EPAM、DHAM和DPAM對照品，則1號、2號、3號峰分別增高，由此可見樣品中1、2、3號峰分別為EPAM、DHAM和DPAM。后應(yīng)用二極管陳列檢測器，通過光譜比對也驗(yàn)證了該結(jié)果。
3.檢測波長的選擇樣品衍生后進(jìn)液相色譜儀，用二極管陳列檢測器記錄色譜圖，從3D圖中提取三種脂肪酸的光譜圖；以吸光系數(shù)和精密度為指標(biāo)，選擇合適的檢測波長。
由光譜圖可見，三種脂肪酸的極大吸收波長均為196.9nm，接近紫外末端，吸收值不穩(wěn)定，故精密度較差，日內(nèi)精密度RSD達(dá)3％以上；且大部分物質(zhì)在196.6nm都有較強(qiáng)吸收，基線噪音較大。經(jīng)嘗試發(fā)現(xiàn)210nm處三種脂肪酸吸收較強(qiáng)且穩(wěn)定，精密度也符合藥典要求，故檢測波長選用210nm。
4.測試濃度和取樣量的選擇為減少系統(tǒng)誤差，使定量更準(zhǔn)確，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，確定樣品測定濃度約為0.1-0.3mg/ml左右；預(yù)定目的組分含量為5～10％，初步確定取樣量為120μl，定容至100ml。
5.色譜柱的選擇根據(jù)目的組分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和理化性質(zhì)，對以下三種色譜柱進(jìn)行考察(1)Allsphere Octyl(C8)，3μm，100，4.6mm×150mm；(2)Waters SymmetryShieldRP-18，5μm，100，3.9mm×150mm；(3)Lichrospher RP-18，5μm，100，4.6mm×250mm。
我們開始選用Allsphere Octyl柱，在乙腈-甲醇-水系統(tǒng)下反復(fù)調(diào)整各相比例，目的組份最好只能達(dá)到如圖3的分離程度，于是換為Waters-C18柱。
由于Waters-C18柱為短柱，故出峰較快，柱效較低(見圖4)，仍不能將目的組分基線分離。
最后換用Lichrospher RP-18柱，找到了最佳分離條件(見圖5)。三種脂肪酸與雜質(zhì)均完全基線分離，分離度均大于1.5，且峰對稱性良好，故優(yōu)選用LichrospherRP-18柱。
6.流動(dòng)相的調(diào)整對以下三種流動(dòng)相體系進(jìn)行考察(1)甲醇∶水系統(tǒng)；(2)乙腈∶四氫呋喃∶水系統(tǒng)；(3)乙腈∶甲醇∶水系統(tǒng)。(見圖6-8)經(jīng)反復(fù)調(diào)試，改變比例，最終發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)(3)最好，在其比例為7∶1∶2時(shí)可使樣品基線分離，三種目的組分與前后雜質(zhì)峰的分離度都大于1∶7，峰對稱性因子介于1到1.14之間，故選之。
7.流速的選擇在1.0ml/min流速下，目的組分出峰較晚，最后的DPAM要42分鐘才能出峰(見圖9)。這不僅浪費(fèi)流動(dòng)相，更使峰形展寬，分離度下降，影響定量準(zhǔn)確性。因此，將流速逐漸提高至1.1-1.5ml/min，最后發(fā)現(xiàn)在流速為1.2ml/min時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最佳，故選用該流速。
8.柱溫的選擇分別考察樣品在室溫、30℃、45℃時(shí)的分離效果，室溫(約20℃)及30℃時(shí)峰形展寬，分離變差，見圖10、11。原因可能是由于溫度較低時(shí)三種脂肪酸甲酯在固定相的溶解度發(fā)生變化，其與固定相的吸附解析過程時(shí)間變長，故峰展寬。經(jīng)試驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)45℃分離最佳。
9.色譜條件的確立與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)綜上可知，最佳色譜條件為色譜柱Lichrospher RP-18，5μm，100A，4.6mm×250mm；流動(dòng)相乙腈∶甲醇∶水＝7∶1∶2，等梯度洗脫；流速1.2ml/min；柱溫45℃；檢測波長210nm；進(jìn)樣量20μl。
實(shí)驗(yàn)例3本實(shí)驗(yàn)例目的在于對于本發(fā)明所述液相色譜條件方法學(xué)驗(yàn)證。
1.線性范圍精密量取EPA甲酯標(biāo)準(zhǔn)液0.4ml、DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)液0.4ml、DPA甲酯標(biāo)準(zhǔn)液0.2ml置10ml棕色容量瓶中，異丙醇定容，作為混標(biāo)溶液；將此混標(biāo)液用異丙醇連續(xù)作7次倍比稀釋，得8種不同濃度的系列混標(biāo)液；分別取20μl進(jìn)樣，以峰面積對進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸，考察線性。
結(jié)果顯示三種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y與其濃度X呈良好線性，線性方程見下表6表6各組分線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)
2.精密度取配好的系列混標(biāo)液高、中低三個(gè)濃度，各連續(xù)進(jìn)樣5針，計(jì)算日內(nèi)精密度，各連續(xù)三天進(jìn)樣，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見下表7表7精密度試驗(yàn)結(jié)果
3.檢測限及定量限將混標(biāo)溶液用異丙醇連續(xù)倍比稀釋后進(jìn)樣，測出的三種脂肪酸甲酯的信號與空白樣品測出的噪音信號進(jìn)行比較，以信噪比約為3∶1時(shí)，相應(yīng)濃度確定檢測限，以信噪比約為10∶1時(shí)，相應(yīng)濃度確定定量限，結(jié)果見表9。
表9各組份檢測限及定量限
4.專屬性4.1空白試驗(yàn)取空白樣品進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察其他成分對樣品分析有無干擾。
圖12中上面為樣品色譜圖，下面為空白試驗(yàn)色譜圖，對比可以看出冰醋酸、醋酸鈉、BHT出峰時(shí)間較早，對樣品分析均無干擾。
4.2峰純度檢查樣品衍生后進(jìn)液相色譜儀，用二極管陳列檢測器記錄色譜圖，計(jì)算峰純度，見表10。
色譜工作站計(jì)算的三種脂肪酸甲酯色譜峰的純度角均小于其純度閾值，表明三者均為純物質(zhì)峰。
表10三種脂肪酸甲酯純度角計(jì)算結(jié)果
5.耐用性5.1樣品測試液穩(wěn)定性考察樣品測試液配好后4℃放置，分別于0、2、4、8、12、24小時(shí)各取20μl進(jìn)樣2次，考察其穩(wěn)定性。
由下表11可見，樣品測試液隨放置時(shí)間的延長，目的組分含量有下降趨勢，但變化不大，在24小時(shí)內(nèi)三種主成分含量的RSD均小于5％，故可以認(rèn)為樣品測試液在4℃放置24小時(shí)是穩(wěn)定的。但樣品測試液長時(shí)間放置不穩(wěn)定，室溫放置更會(huì)加速其降解，因此樣品衍生后應(yīng)及時(shí)測定。
表11衍生化產(chǎn)物4℃放置穩(wěn)定性考察結(jié)果
5.2不同儀器及色譜柱對分離的影響將島津(Shimadzu)2010A高效液相色譜儀換為Waters高效液相色譜儀，將LichrospherRP-18色譜柱換為同類型的Mightsil RP-18柱(5μm，100A，4.6mm×250mm)，考察方法耐用性。
圖13為用Mightsil RP-18柱得到的結(jié)果，可見樣品在兩個(gè)色譜柱均可得良好分離；峰純度檢查在Waters高效液相色譜儀上進(jìn)行，結(jié)果也顯示方法耐用性良好。
6.準(zhǔn)確度將三種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液用異丙醇作10倍稀釋；準(zhǔn)確稱取已準(zhǔn)確定量的海狗油9份各12μl，置10ml棕色容量瓶中，分別定量加入EPAM和DHAM標(biāo)準(zhǔn)稀釋液1.2、1.0、0.8ml，加入DPAM標(biāo)準(zhǔn)稀釋液0.6、0.5、0.4ml；每種濃度3份，衍生后定容進(jìn)樣，測定三種脂肪酸的含量，以加標(biāo)液測定平均值為M，原樣品液含量平均值為P，加標(biāo)量為A，照下式計(jì)算回收率∶回收率＝(M-P)/A×100％表12EPA甲酯加標(biāo)回收率計(jì)算結(jié)果表
表13DHA甲酯加標(biāo)回收率計(jì)算結(jié)果表
表14DPA甲酯加標(biāo)回收率計(jì)算結(jié)果表
實(shí)驗(yàn)例4本實(shí)驗(yàn)例為海狗油有效成分含量的分析。
準(zhǔn)確稱取海狗油5份，按上述步驟操作，外標(biāo)法測定三種脂肪酸的含量，由外標(biāo)法首先算得海狗油中脂肪酸相應(yīng)甲酯的含量，要求得脂肪酸含量，尚需進(jìn)行以下折算EPA含量＝EPAM含量×302.450/316.478＝EPAM含量×0.95567DHA含量＝DHAM含量×328.487/342.515＝DHAM含量×0.95904DPA含量＝DPAM含量×330.530/344.531＝DPAM含量×0.95936表15樣品中三種多烯脂肪酸百分含量(W/W)結(jié)果表
權(quán)利要求
1.脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，包括以下步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油與含0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽以1∶30-100體積比混合搖勻，在0-60℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入酸終止反應(yīng)，用醇定容，過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液；2)色譜進(jìn)樣分析取衍生處理后的脂肪油，進(jìn)入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動(dòng)相甲醇水系統(tǒng)、乙腈四氫呋喃水系統(tǒng)或乙腈甲醇水系統(tǒng)，等梯度洗脫，流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202～230nm，進(jìn)樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標(biāo)法測定脂肪酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，基中，步驟1)脂肪油的衍生化處理取脂肪油80-120μl，加入0.2-1.0mol/L醇的堿金屬鹽4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml酸終止反應(yīng)，用醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的衍生化處理方法為取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應(yīng)15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應(yīng)，用甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的醇的堿金屬鹽可為甲醇鈉、乙醇鈉或甲醇鉀，優(yōu)選為甲醇鈉；定容所用的醇為甲醇或乙醇；所述的終止反應(yīng)所用的酸為冰醋酸、甲酸、三氟乙酸或硫酸中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，定容時(shí)可加0.001％-0.005％的抗氧化劑，所述的抗氧化劑為2，6-二叔丁基對甲酚或?qū)αu基叔丁基茴香醚。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的衍生化處理方法為取脂肪油100-120μl，加入0.5-0.8mol/L的甲醇鈉4-6ml，搖勻，室溫反應(yīng)15-30分鐘，至小油滴完全消失，再加入0.2-0.4ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.003％-0.005％ 2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的脂肪油供試品溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的液相色譜儀為RP-18型，5μm，100，4.6mm×250mm型號。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一種所述的脂肪油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的流動(dòng)相為乙腈甲醇水系統(tǒng)，三者比例為7∶1∶2，流速為1.2ml/min。
9.海狗油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，包括以下步驟1)海狗油的衍生化處理取海狗油80-120μ1，加入0.2-1.0mol/L甲醇鈉4-8ml，搖勻，在0-60℃下反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.2-0.5ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.001％-0.005％ 2，6-二叔丁基對甲酚的醇定容，0.2μm-0.3μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液；2)色譜進(jìn)樣分析取衍生處理后的海狗油供試品溶液，進(jìn)入液相色譜儀，所述的色譜儀的色譜條件為流動(dòng)相甲醇水系統(tǒng)、乙腈四氫呋喃水系統(tǒng)或乙腈甲醇水系統(tǒng)，等梯度洗脫，流速1.1-1.5ml/min，柱溫15-45℃，檢測波長202-230nm，進(jìn)樣量5～50μl；3)記錄色譜圖，用外標(biāo)法測定脂肪酸的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的海狗油中有效成分的一種測定方法，其特征在于，所述的衍生化處理方法為取海狗油120μl，加入0.5mol/L甲醇鈉4ml，搖勻，室溫反應(yīng)至小油滴完全消失，再加入0.2ml冰醋酸終止反應(yīng)，用含0.005％ 2，6-二叔丁基對甲酚的甲醇定容，0.2μm濾膜過濾，得衍生處理過的海狗油供試品溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了脂肪油中有效成分的一種測定方法，該方法采用柱前衍生反相HPLC法，簡化了樣品衍生化操作步驟，無需萃取，節(jié)省時(shí)間和試劑，衍生化反應(yīng)完全，采用適當(dāng)?shù)纳V分離條件，將目的組分與雜質(zhì)完全基線分離。
文檔編號G01N30/06GK1758060SQ200410080429
公開日2006年4月12日 申請日期2004年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月9日
發(fā)明者徐康森, 王召, 樂嘉靜, 李湛君 申請人:中國藥品生物制品檢定所