專利名稱：程序性死亡-1 (pd-1)的人單克隆抗體及使用抗pd-1抗體來治療癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及治療人類疾病和減少相關(guān)不良事件的免疫療法。更具體的說，本發(fā)明涉及使用抗ro-1抗體和使用包括抗CTLA-4抗體與抗ro-1抗體組合的聯(lián)合免疫療法來治療癌癥和/或減少與單獨(dú)使用此類抗體進(jìn)行的治療有關(guān)的不良事件的發(fā)生率或程度。本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年05月02日、中國申請(qǐng)?zhí)枮?00680023860. O、發(fā)明名稱為“程序性死亡-1 (PD-1)的人單克隆抗體及單獨(dú)使用或與其它免疫治療劑聯(lián)合使用抗ro-1抗體來治療癌癥的方法”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)程序性死亡I(PD-1)是⑶28受體家族的抑制性成員，該家族還包括⑶28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞上表達(dá)(Agata等人，同下；0kazaki 等人(2002) Curr. Opin. Tmmuno1. 14:391779-82; Bennett 等人(2003) JImmunol 170:711-8)o根據(jù)加入單克隆抗體后對(duì)提升T細(xì)胞增殖的功能性影響發(fā)現(xiàn)了家族最初的成員，CD28 和 ICOS (Hutloff 等人(1999)Nature397:263-266;Hansen 等人(1980)ImmunogenicslO:247-260)。通過在凋亡細(xì)胞中篩選差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)了 PD-1 (Ishida等人(1992)EMBOJl1:3887-95)。通過分別在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和THl細(xì)胞中篩選差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)了家族的其它成員，CTLA-4和BTLA。⑶28、ICOS和CTLA-4都具有能夠同型二聚化的不成對(duì)半胱氨酸殘基。相反，認(rèn)為I3D-1以單體形式存在，其缺少其它CD28家族成員中特有的不成對(duì)半胱氨酸殘基。 I3D-1基因是55kDa的I型跨膜蛋白，其為Ig基因超家族的一部分(Agata等人(1996) Int Immuno18:765-72) JD-1含有接近膜的免疫受體酪氨酸抑制基序(IHM)和遠(yuǎn)離膜的基于酪氨酸的轉(zhuǎn)換基序(ITSM) (Thomas,M. L. (1995) J Exp Medl81:1953-6; Vivier, E和 Daeron, M (1997) Immunol Todayl8:286-91 )。雖然與 CTLA-4 結(jié)構(gòu)類似，但 PD-1 缺少結(jié)合B7-1和B7-2所必需的MYPPPY基序?，F(xiàn)已鑒定了 PD-1的兩種配體，PD-Ll和PD-L2，其顯示出在結(jié)合 F1D-1 后下調(diào) T 細(xì)胞活化(Freeman 等人(2000)J Exp Medl92:1027-34; Latchman等人(2001) Nat Immunol2:261-8; Carter 等人(2002) Eur J Immuno132:634-43)。PD-Ll和H)-L2都是B7同源物，其與TO-1結(jié)合，但不與其它⑶28家族成員結(jié)合。I3D-1的一種配體，PD-Ll在多種人癌瘤中都很豐富(Dong等人(2002)Nat. MecL 8:787-9)。PD-1和PD-LI之間的相互作用導(dǎo)致滲入腫瘤的淋巴細(xì)胞減少、T細(xì)胞受體介導(dǎo)的增殖減少、及癌性細(xì)胞的免疫逃避(Dong 等人(2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank 等人(2005) Cancer Tmmuno1.1mmunother. 54:307-314; Konishi 等人(2004) Cl in. Cancer Res. 10:5094-100)?？梢酝ㄟ^抑制ro-1與ro-Li的局部相互作用來逆轉(zhuǎn)免疫抑制，而且當(dāng)ro-1與ro-L2的相互作用也被阻斷時(shí)效果累加(Iwai 等人(2002) Proc. Nat，1. Acad. Sc1. USA99:12293-7; Brown 等人(2003)J.1mmunol. 170:1257—66)。PD-1是在活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞上表達(dá)的⑶28家族的抑制性成員(Agata 等人，同上；0kazaki 等人(2002)Curr Opin Immunol 14:391779-82;Bennett等人(2003) J Immunoll70:711-8)o I3D-1缺陷型動(dòng)物形成多種自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病及伴有關(guān)節(jié)炎和腎炎的狼瘡樣綜合征(Nishimura等人(1999)Immunityll: 141-51; Nishimura 等人(2001) Science291:319-22)。此外，發(fā)現(xiàn) F1D-1在自身免疫性腦脊髓炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病(GVHD)、I型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起作用(Salama等人(2003) J Exp Medl98:71-78; Prokunina和Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genetl3: R143; Nielsen 等人(2004) Lupusl3:510)。在鼠B細(xì)胞腫瘤系中，H)-l的ITSM顯示出是阻斷BCR介導(dǎo)的Ca2+流通和下游效應(yīng)器分子的酪氨酸磷酸化所必需的(Okazaki等人(2001) PNAS98:13866-71)。因此，需要識(shí)別ro-1的試劑和使用此類試劑的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體，其與ro-1結(jié)合并表現(xiàn)出許多優(yōu)良特性。這些特性包括例如與人I3D-1高親和力結(jié)合，但缺少與人⑶28、CTLA-4或ICOS的基本的交叉反應(yīng)性。此外，本發(fā)明的抗體顯示出可調(diào)控免疫應(yīng)答。因此,本發(fā)明的另一方面涉及使用抗ro-1抗體調(diào)控免疫應(yīng)答的方法。具體而言，本發(fā)明提供了使用抗ro-1抗體在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法。在一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體表現(xiàn)出至少一項(xiàng)下列性質(zhì)(a)以IxKT7M或更小的Kd與人PD-1結(jié)合；(b)不 顯著與 CD28、CTLA-4 或 ICOS 結(jié)合；(c)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定法中增加T細(xì)胞增殖；(d)在MLR測定法中增加干擾素Y的產(chǎn)量；(e)在MLR測定法中增加IL-2的分泌；(f)與人ro-1和獼猴ro-1結(jié)合；(g)抑制 PD-Ll 和 / 或 PD-L2 與 PD-1 的結(jié)合；(h)刺激抗原特異性記憶應(yīng)答；(i)刺激抗體應(yīng)答；(j)抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長。所述抗體優(yōu)選為人抗體，雖然在可選的實(shí)施方式中抗體可以為例如鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體以5xl(T8或更小的Kd與人I3D-1結(jié)合，以IxKT8M或更小的Kd與人PD-1結(jié)合，以5x1 O^9M或更小的Kd與人PD-1結(jié)合，或以IxKT8M和IxIO^1OM之間的Kd與人ro-1結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體與參照抗體交叉競爭與ro-1的結(jié)合，該參照抗體包含(a)人重鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列；和
(b)人輕鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID N0s:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸序列。在多種實(shí)施方式中，所述參照抗體包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或所述參照抗體包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；或所述參照抗體包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；或所述參照抗體包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；或所述參照抗體包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列，或所述參照抗體包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列，或所述參照抗體包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人vH3-33基因的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VH4-39基因的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人vKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人Vk L15基因的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)人Vh3_33基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人Vk L6基因的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)人Vh4_39基因的重鏈 可變區(qū)；和(b)人Vk L15基因的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列；和輕鏈可變區(qū)，其包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列，其中(a)所述重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NOs: 29、30、31、32、33、34和35及其保守修飾的氨基酸序列；(b)所述輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NOs: 50、51、52、53、54、55和56及其保守修飾的氨基酸序列；且(C)所述抗體與人ro-1特異性結(jié)合。優(yōu)選的是，所述重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NOs: 22、23、24、25、26、27和28所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；所述輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQID N0s:43、44、45、46、47、48和49所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。優(yōu)選的是，所述重鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQ ID NOs: 15、16、17、18、19、20和21所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；所述輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID N0s:36、37、38、39,40,41和42所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。在又一方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)所述重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)所述輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID N0s:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸至少80%同源的氨基酸序列；(C)所述抗體以1x10_7M或更小的Kd與人ro-1結(jié)合；且(d)所述抗體不顯著 與人⑶28、CTLA-4或ICOS結(jié)合。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體另外還包含至少一項(xiàng)下列性質(zhì)(a)所述抗體在MLR測定法中增加T細(xì)胞的增殖；(b)所述抗體在MLR測定法中增加干擾素-Y的產(chǎn)量；或(c)所述抗體在MLR測定法中增加IL-2的分泌。另外/或者，所述抗體可以包含一種或多種其它的上述特征。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)重鏈可變區(qū)CDRl，其包含選自SEQ ID NOs: 15、16、17、18、19、20和21的氨基
酸序列；(b)重鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NOs: 22、23、24、25、26、27和28的氨基
酸序列；(c)重鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID N0s:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；(d)輕鏈可變區(qū)CDR1，其包含選自SEQ ID NOs:36、37、38、39、40、41和42的氨基
酸序列；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NOs: 43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列；和(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID N0s:50、51、52、53、54、55和56的氨基
酸序列；其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。一優(yōu)選的組合包括
(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO: 15 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQIDNO:22 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDNO:29 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO:36 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO:43 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDN0:50。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO: 16 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQIDNO:23 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDNO:30 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO:37 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO:44 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDN0:51。另一優(yōu)選的組合包括
(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO: 17 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQIDNO:24 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDN0:31 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO:38 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO:45 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDN0:52。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO: 18 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQIDNO:25 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDNO:32 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO:39 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO:46 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDN0:53。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO: 19 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQIDNO:26 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDNO:33 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO:40 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO:47 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDN0:54。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO:20 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQIDNO:27 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQIDNO:34 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQIDNO:41 ；
(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQ ID NO:48 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:55。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID N0:21 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQ ID NO:28 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID NO:35 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO:42 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQ ID NO:49 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:56。
本發(fā)明其它優(yōu)選的抗體或其抗原結(jié)合部分包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列;和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID N0s:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸序列;其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。另一優(yōu)選的組合包括(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體可以為例如全長抗體，例如IgGl或IgG4同種型的全長抗體?；蛘?，所述抗體可以為抗體片段，諸如Fab或Fab’ 2片段，或單鏈抗體。本發(fā)明還提供了免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑，諸如細(xì)胞毒素或放射性同位素連接的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還提供了雙特異性分子，其包含與第二功能性模塊連接的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能性模塊具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。還提供了組合物，其含有本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，或免疫偶聯(lián)物，或雙特異性分子，及藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明還涵蓋編碼本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子，以及包含此類核酸的表達(dá)載體和包含此類表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供了包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述小鼠表達(dá)本發(fā)明的抗體，以及從這樣的小鼠制備的雜交瘤，其中所述雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。在又一方面，本發(fā)明提供了調(diào)控受試者中免疫應(yīng)答的方法，其包括給受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得受試者中的免疫應(yīng)答得到調(diào)控。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體增強(qiáng)、刺激或增加受試者中的免疫應(yīng)答。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包括給受試者施用治療有效量的抗ro-1抗體或其抗原結(jié)合部分。在該方法中優(yōu)選使用本發(fā)明的抗體，雖然其它抗ro-1抗體也能夠替代(或與本發(fā)明的抗ro-1抗體聯(lián)合)使用。例如，在抑制腫瘤生長的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗ro-1抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中傳染病的方法，其包括給受試者施用治療有效量的抗ro-1抗體或其抗原結(jié)合部分。在該方法中優(yōu)選使用本發(fā)明的抗體，雖然其它抗ro-1抗體也能夠替代(或與本發(fā)明 的抗ro-1抗體聯(lián)合)使用。例如，在治療傳染病的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗ro-1抗體。此外，本發(fā)明提供了增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給受試者施用(i)抗原；和(ii)抗ro-1抗體或其抗原結(jié)合部分，使得受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答得到增強(qiáng)?？乖梢允抢缒[瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原或來自病原體的抗原。在該方法中優(yōu)選使用本發(fā)明的抗體，雖然其它抗ro-1抗體也能夠替代(或與本發(fā)明的抗ro-1抗體聯(lián)合)使用。例如，在增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗ro-1抗體。本發(fā)明還提供了根據(jù)本文所提供的抗ro-1抗體的序列制備“二代”抗ro-1抗體的方法。例如，本發(fā)明提供了制備抗ro-1抗體的方法，其包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NOs: 15、16、17、18、19、20和21的CDRl序列，和/或選自SEQ ID NOs: 22、23、24、25、26、27和28的CDR2序列；和/或選自SEQ ID NOs: 29、30、31、32、33、34和35的CDR3序列;或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自 SEQ ID N0s:36、37、38、39、40、41 和 42 的 CDRl 序列，和 / 或選自 SEQ ID NOs:43,44、45、46、47、48 和 49 的 CDR2 序列，和 / 或選自 SEQ ID N0s:50、51、52、53、54、55 和 56 的CDR3序列；(b)改變選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列的至少一個(gè)可變區(qū)抗體序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基以創(chuàng)建至少一個(gè)經(jīng)改變的抗體序列；和(C)將經(jīng)改變的抗體序列表達(dá)成蛋白質(zhì)。下面的詳述和實(shí)例用于表明本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，不應(yīng)作為限制。本申請(qǐng)中所引用的所有參考文獻(xiàn)、GenBank條目、專利和已公開的專利申請(qǐng)都通過參考清楚的引入。本發(fā)明涉及下述各項(xiàng)。1.分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體與ro-1結(jié)合且其中所述抗體展現(xiàn)出至少一種下述性質(zhì)a)以IxlO-7M或更小的Kd與人PD-1結(jié)合；b)不顯著與 CD28、CTLA-4 或 ICOS 結(jié)合；c)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定法中增加T細(xì)胞增殖；d)在MLR測定法中增加干擾素Y的產(chǎn)量；或e)在MLR測定法中增加白介素-2(IL_2)的分泌。2.項(xiàng)I的抗體，其為IgGl或IgG4同種型的全長抗體。3.項(xiàng)I的抗體，其為抗體片段或單鏈抗體。4.項(xiàng)I的抗體，其中所述抗體以5x10_8M或更小的Kd與人I3D-1結(jié)合。5.項(xiàng)I的抗體，其中所述抗體以1x10_8M或更小的Kd與人I3D-1結(jié)合。6.項(xiàng)I的抗體，其中所述抗體以5x10_9M或更小的Kd與人I3D-1結(jié)合。7.項(xiàng)I的抗體，其中所述抗體以1x10_8M至IxKTkiM的Kd與人TO-1結(jié)合。8.分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體與參照抗體交叉競爭與PD-1的結(jié)合，該參照抗體包含a)包含選自S EQ ID NO: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和b)包含選自SEQ ID N0:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。9.項(xiàng)8的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列。10.項(xiàng)8的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列。11.項(xiàng)8的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。12.項(xiàng)8的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。13.項(xiàng)8的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。14.項(xiàng)8的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。15.項(xiàng)8的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述人輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。16.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自AVH3_33基因的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。17.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人Vh4_39基因的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。18.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自AVk L6基因的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。19.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自AVk L15基因的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。20.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含
a)人Vh3_33基因的重鏈可變區(qū)；和b)人Vk L6基因的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。21.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含a)人Vh4_39基因的重鏈可變區(qū)；和b) L15基因的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。22.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含⑶R1XDR2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)；及含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中a)所述重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO: 29、30、31、32、33、34和35及其保守修飾形式的氨基酸序列；b)所述輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55和56及其
保守修飾形式的氨基酸序列；且c)所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。23.項(xiàng)22的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID N0:22、23、24、25、26、27和28 所示氨基酸序列及其保守修飾形式的氨基酸序列；所述輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID N0:43、44、45、46、47、48和49所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。24.項(xiàng)23的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQ ID N0:15、16、17、18、19、20和21所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；所述輕鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQ ID N0:36、37、38、39、40、41和42所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。25.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中a)所述重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；b)所述輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID N0:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸至少
80%同源的氨基酸序列；c)所述抗體以1x10_7M或更小的Kd與人I3D-1結(jié)合；且d)所述抗體不顯著與人⑶28、CTLA-4或ICOS結(jié)合。26.項(xiàng)25的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步包含至少一種下述性質(zhì)a)所述抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定法中增加T細(xì)胞的增殖；b)所述抗體在MLR測定法中增加干擾素-Y的產(chǎn)量；或c)所述抗體在MLR測定法中增加白介素-2 (IL-2)的分泌。27.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含a)包含選自SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20和21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含選自SEQ ID N0:22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2 ；c)包含選自SEQ ID N0:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含選自SEQ ID N0:36、37、38、39、40、41和42的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含選自SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含選自SEQ ID N0:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3 ；其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。28.項(xiàng)27的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO: 15的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含SEQ ID NO:22的重鏈可變區(qū)CDR2 ；c)包含SEQ ID NO:29的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含SEQ ID NO:36的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含SEQ ID NO:43的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含SEQ ID NO:50的輕鏈可變區(qū)CDR3。29.項(xiàng)27的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO: 16的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)CDR2 ；c)包含SEQ ID NO:30的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含SEQ ID NO:37的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含SEQ ID NO:44的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含SEQ ID NO:51的輕鏈可變區(qū)CDR3。30.項(xiàng)27的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO: 17的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含SEQ ID NO:24的重鏈可變區(qū)CDR2 ；c)包含SEQ ID NO:31的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含SEQ ID NO:38的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含SEQ ID NO:45的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含SEQ ID NO:52的輕鏈可變區(qū)CDR3。31.項(xiàng)27的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO: 18的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含SEQ ID NO:25的重 鏈可變區(qū)CDR2 ；c)包含SEQ ID NO:32的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含SEQ ID NO:39的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含SEQ ID NO:46的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含SEQ ID NO:53的輕鏈可變區(qū)CDR3。32.項(xiàng)27的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO: 19的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含SEQ ID NO:26的重鏈可變區(qū)CDR2 ；
c)包含SEQ ID NO:33的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含SEQ ID NO:40的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含SEQ ID NO:47的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含SEQ ID NO:54的輕鏈可變區(qū)CDR3。33.項(xiàng)27的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:20的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含SEQ ID NO:27的重鏈可變區(qū)CDR2 ；c)包含SEQ ID NO:34的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含SEQ ID NO:41的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含SEQ ID NO:48的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含SEQ ID NO:55的輕鏈可變區(qū)CDR3。34.項(xiàng)27的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)CDRl ；b)包含SEQ ID NO:28的重鏈可變區(qū)CDR2 ；
c)包含SEQ ID NO:35的重鏈可變區(qū)CDR3 ；d)包含SEQ ID NO:42的輕鏈可變區(qū)CDRl ；e)包含SEQ ID NO:49的輕鏈可變區(qū)CDR2 ;和f)包含SEQ ID NO:56的輕鏈可變區(qū)CDR3。35.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含a)包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);和b)包含選自SEQ ID N0:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。36.項(xiàng)35的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。37.項(xiàng)35的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。38.項(xiàng)35的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和b)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。39.項(xiàng)35的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和b)包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。40.項(xiàng)35的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和b)包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。41.項(xiàng)35的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
b)包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。42.項(xiàng)35的抗體，其包含a)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和b)包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。43.組合物，其包含項(xiàng)1-36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，及藥學(xué)可接受的載體。44.免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑相連的項(xiàng)1-36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。45.組合物，其包含項(xiàng)44的免疫偶聯(lián)物及藥學(xué)可接受的載體。46.項(xiàng)44的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素。47.組合物，其包含項(xiàng)46的免疫偶聯(lián)物及藥學(xué)可接受的載體。
48.項(xiàng)44的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是放射性同位素。49.組合物，其包含項(xiàng)48的免疫偶聯(lián)物及藥學(xué)可接受的載體。50.雙特異性分子，其包含與第二功能性模塊相連的項(xiàng)I 一 36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，該第二功能性模塊具有與所述抗體或其抗原結(jié)合部分不同的結(jié)合特異性。51.組合物，其包含項(xiàng)50的雙特異性分子及藥學(xué)可接受的載體。52.分離的核酸分子，其編碼項(xiàng)I 一 36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。53.包含項(xiàng)52的核酸分子的表達(dá)載體。54.包含項(xiàng)53的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。55.包含人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述小鼠表達(dá)項(xiàng)1- 36任一項(xiàng)的抗體。56.從項(xiàng)55的小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生所述抗體。57.調(diào)控受試者中免疫應(yīng)答的方法,其包括給受試者施用項(xiàng)I 一 36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得受試者中的免疫應(yīng)答得到調(diào)控。58.抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長的方法,其包括給受試者施用治療有效量的抗PD-1抗體或其抗原結(jié)合部分。59.項(xiàng)58的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。60.項(xiàng)58的方法，其中所述抗體是人源化抗體。61.項(xiàng)58的方法，其中所述抗體是完全人的抗體。62.項(xiàng)58的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是選自黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳癌、結(jié)腸癌和肺癌的癌癥的腫瘤細(xì)胞。63.項(xiàng)58的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是選自骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病，其包括急性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、兒童期實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的贅生物、原發(fā)性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊髓軸腫瘤、腦干膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤、環(huán)境誘發(fā)的癌癥，其包括石棉所誘發(fā)的那些、和所述癌癥的組合的癌癥的腫瘤細(xì)胞。64.抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包括以有效抑制腫瘤細(xì)胞生長的量給受試者施用項(xiàng)I 一 36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分。65.治療受試者中傳染病的方法，其包括給受試者施用項(xiàng)I 一 36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得受試者中的傳染病得到治療。66.項(xiàng)65的方法，其中所述傳染病選自HIV、流行性感冒、皰疹、賈第蟲病、瘧疾、利什曼病、以下病毒引起的致病感染肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、皰疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-1I和CMV、埃巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、細(xì)小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒，以下細(xì)菌引起的致病感染衣原體、立克次氏體、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和conococc1、克雷伯氏菌、變形菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團(tuán)菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風(fēng)、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病和萊姆氏病細(xì)菌，以下真菌引起的致病感染假絲酵母(白色假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等)、新型隱球酵母、曲霉(煙曲霉、黑曲霉等)、毛霉目的屬(毛霉屬、犁頭霉屬、根霉屬)、申克氏孢子絲菌、皮炎芽酵母、巴西副球孢子菌、粗球孢菌和莢膜組織胞漿菌，及以下寄生蟲引起的致病感染痢疾內(nèi)變形蟲、結(jié)腸腸袋蟲、福納氏蟲、棘變形蟲、吸吮賈第蟲、隱孢子蟲、卡氏肺囊蟲、間日瘧原蟲、田鼠巴貝蟲、布魯斯錐蟲、克魯茲錐蟲、多氏利什曼蟲、鼠弓漿蟲和巴西日?qǐng)A線蟲。67.增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括給受試者施用(i)抗原；和
(ii)項(xiàng)1-36任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，使得受試者中對(duì)抗原的免疫應(yīng)答得到增強(qiáng)。68.項(xiàng)67 的方法，其中所述抗原是腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原或來自病原體的抗原。69.治療過度增殖性疾病的方法，該方法包括a)給受試者施用抗I3D-1抗體，和b)給受試者施用抗CTLA-4抗體。70.項(xiàng)69的方法，其中所述抗I3D-1抗體以亞治療劑量施用。71.項(xiàng)69的方法，其中所述抗CTLA-4抗體以亞治療劑量施用。72.項(xiàng)69的方法，其中所述抗I3D-1抗體和所述抗CTLA-4抗體各自以亞治療劑量施用。73.項(xiàng)69的方法，其中所述抗I3D-1抗體和所述抗CTLA-4抗體序貫施用。74.項(xiàng)73的方法，其中先施用所述抗I3D-1抗體后施用所述抗CTLA-4抗體。75.項(xiàng)73的方法，其中先施用所述抗CTLA-4抗體后施用所述抗I3D-1抗體。76.項(xiàng)73的方法，其中所述抗I3D-1抗體和所述抗CTLA-4抗體同時(shí)施用。77.項(xiàng)73的方法，其中將所述抗I3D-1抗體和所述抗CTLA-4抗體混合成單一組合物并同時(shí)施用。78.項(xiàng)73的方法，其包括給受試者施用(a)含有抗TO-1抗體和藥學(xué)可接受載體的組合物及(b)含有抗CTLA-4抗體和藥學(xué)可接受載體的組合物。79.項(xiàng)69至78任一項(xiàng)的方法，其中所述過度增殖性疾病是癌癥。
80.項(xiàng)79的方法，其中所述癌癥是結(jié)腸癌。81.項(xiàng)68至79任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。82.項(xiàng)68至79任一項(xiàng)的方法，其中所述抗I3D-1抗體是人序列抗體。83.項(xiàng)82的方法，其中所述抗I3D-1人序列抗體是單克隆抗體。84.項(xiàng)83的方法，其中所述抗I3D-1人序列單克隆抗體是17D8、2D3、4H1、5C4、4A1U7D3 或 5F4。85.項(xiàng)68至79任一項(xiàng)的方法，其中所述抗CTLA-4抗體是人序列抗體。86.項(xiàng)85的方法，其中所述抗CTLA-4人序列抗體是單克隆抗體。87.項(xiàng)86的方法，其中所述抗CTLA-4人序列單克隆抗體是IODl (MDX-010)。88.改變與用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病有關(guān)的不良事件的方法，該方法包括(a)給受試者施用抗I3D-1抗體，和(b)給受試者施用亞治療劑量的抗CTLA-4抗體。89.項(xiàng)86的方法，其中所述抗I3D-1抗體以亞治療劑量施用。90.項(xiàng)88的方法，其中 所述抗I3D-1抗體和所述抗CTLA-4抗體序貫施用。91.項(xiàng)90的方法，其中先施用所述抗ro-1抗體后施用所述抗CTLA-4抗體。92.項(xiàng)90的方法，其中先施用所述抗CTLA-4抗體后施用所述抗I3D-1抗體。93.項(xiàng)88的方法，其中所述抗I3D-1抗體和所述抗CTLA-4抗體同時(shí)施用。94.項(xiàng)88的方法，其中將所述抗I3D-1抗體和所述抗CTLA-4抗體混合成單一組合物并同時(shí)施用。95.項(xiàng)88的方法，其包括給受試者施用(a)含有抗H)_l抗體和藥學(xué)可接受載體的組合物及(b)含有抗CTLA-4抗體和藥學(xué)可接受載體的組合物。96.項(xiàng)88至95任一項(xiàng)的方法，其中所述過度增殖性疾病是癌癥。97.項(xiàng)96的方法，其中所述癌癥是結(jié)腸癌。98.項(xiàng)88至95任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。99.項(xiàng)88至95任一項(xiàng)的方法，其中所述抗I3D-1抗體是人序列抗體。100.項(xiàng)99的方法，其中所述抗ro-1人序列抗體是單克隆抗體。101.項(xiàng)100的方法，其中所述抗I3D-1人序列單克隆抗體是17D8、2D3、4H1、5C4、4A1U7D3 或 5F4。102.項(xiàng)88至95任一項(xiàng)的方法，其中所述抗CTLA-4抗體是人序列抗體。103.項(xiàng)102的方法，其中所述抗CTLA-4人序列抗體是單克隆抗體。104.項(xiàng)103的方法，其中所述抗CTLA-4人序列單克隆抗體是IODl (MDX-010)。105.制備抗ro-1抗體的方法，其包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20和 21 的 CDRl 序列，選自 SEQ ID NO: 22、23、24、25、26、27 和 28 的 CDR2 序列，和選自 SEQ IDN0:29、30、31、32、33、34和35的CDR3序列；或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQID N0:36、37、38、39、40、41 和 42 的 CDRl 序列，選自 SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48 和 49的 CDR2 序列，和選自 SEQ ID NO:50、51、52、53、54、55 和 56 的 CDR3 序列；(b)改變至少一個(gè)可變區(qū)抗體序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，以創(chuàng)造至少一個(gè)經(jīng)改變的抗體序列；和(c)將經(jīng)改變的抗體序列表達(dá)成蛋白質(zhì)。附圖簡述
圖1A顯示17D8人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:57)和氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 15)、CDR2 (SEQ ID NO: 22)和 CDR3 (SEQID NO:29)區(qū)域，并且指出V、D和J種系衍生化。圖1B顯示17D8人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:64)和氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 36)、CDR2 (SEQ ID NO: 43)和 CDR3 (SEQID NO:50)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖2A顯示2D3人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO: 58)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 16)、CDR2 (SEQ ID NO: 23)和 CDR3 (SEQID NO:30)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖2B顯示2D3人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:65)和氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 37)、CDR2 (SEQ ID NO: 44)和 CDR3 (SEQID N0:51)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖3A顯示4H1人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO: 59)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 17)、CDR2 (SEQ ID NO: 24)和 CDR3 (SEQID N0:31)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。
圖3B顯示4H1人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:66)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 10) o 其中標(biāo)示出 CDR1(SEQ ID NO: 38)、CDR2 (SEQ ID NO:45)和CDR3 (SEQ ID NO: 52)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖4A顯示5C4人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:60)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 18)、CDR2 (SEQ ID NO: 25)和 CDR3 (SEQID NO:32)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖4B顯示5C4人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:67)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 11) o 其中標(biāo)示出 CDR1(SEQ ID NO: 39)、CDR2 (SEQ ID NO:46)和CDR3 (SEQ ID NO: 53)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖5A顯示4A11人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:61)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 19)、CDR2 (SEQ ID NO: 26)和 CDR3 (SEQID NO:33)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖5B顯示4A11人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:68)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 12) o 其中標(biāo)示出 CDR1(SEQ ID NO: 40)、CDR2 (SEQ ID NO: 47)和CDR3 (SEQ ID NO: 54)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖6A顯示7D3人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:62)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 20)、CDR2 (SEQ ID NO: 27)和 CDR3 (SEQID NO:34)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖6B顯示7D3人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:69)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 13) o 其中標(biāo)示出 CDR1(SEQ ID NO:41)、CDR2 (SEQ ID NO:48)和CDR3 (SEQ ID NO: 55)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。
圖7A顯示5F4人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:63)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)。其中標(biāo)示出 CDRl (SEQ ID NO: 21)、CDR2 (SEQ ID NO: 28)和 CDR3 (SEQID NO:35)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖7B顯示5F4人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID N0:70)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 14) o 其中標(biāo)示出 CDR1(SEQ ID NO:42)、CDR2 (SEQ ID NO:49)和CDR3 (SEQ ID NO: 56)區(qū)域，并且指出V和J種系衍生化。圖8顯示17D8、2D3、4H1、5C4和7D3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人種系VH3_33氨基酸序列(SEQ ID NO:71)的比對(duì)結(jié)果。圖9顯示17D8、2D3和7D3的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人種系Vk L6氨基酸序列(SEQ ID NO:73)的比對(duì)結(jié)果。圖10顯示4H1和5C4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人種系Vk L6氨基酸序列(SEQID NO:73)的比對(duì)結(jié)果。圖11顯示4A11和5F4的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人種系VH4_39氨基酸序列(SEQ ID NO:72)的比對(duì)結(jié)果。圖12顯示4A11和5F4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人種系Vk L15氨基酸序列(SEQ ID NO:74)的比對(duì)結(jié)果。圖13A - 13B顯示流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證明針對(duì)人H)-l的人單克隆抗體5C4和4H1與用全長人I3D-1轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合。圖13A顯示5C4的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)繪圖。圖13B顯示4H1的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)繪圖。細(xì)線表示與CHO細(xì)胞的結(jié)合，粗線表示與CHO hPD-1細(xì)胞的結(jié)合。圖14顯示的圖表證明針對(duì)人I3D-1的人單克隆抗體17D8、2D3、4H1、5C4和4A11與PD-1特異性結(jié)合，但不與 CD28家族其它成員結(jié)合。圖15A - 15C顯示流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證明針對(duì)人H)-l的人單克隆抗體4H1和5C4與細(xì)胞表面上的I3D-1結(jié)合。圖15A顯示與活化的人T細(xì)胞的結(jié)合。圖15B顯示與獼猴T細(xì)胞的結(jié)合。圖15C顯示與表達(dá)I3D-1的CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。圖16A - 16C顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明針對(duì)人I3D-1的人單克隆抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測定法中促進(jìn)T細(xì)胞增殖、IFN- y分泌和IL-2分泌。圖16A的條線圖顯示濃度依賴性的T細(xì)胞增殖。圖16B的條線圖顯示濃度依賴性的IFN-Y分泌。圖16C的條線圖顯示濃度依賴性的IL-2分泌。圖17A - 17B顯示流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證明針對(duì)人H)-l的人單克隆抗體阻斷了 ro-Li和ro-L2與表達(dá)ro-1的cho轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合。圖17A的圖表顯示對(duì)ro-Li結(jié)合的抑制。圖17B的圖表顯示對(duì)ro-L2結(jié)合的抑制。圖18顯示流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證明針對(duì)人ro-1的人單克隆抗體不促進(jìn)T細(xì)胞凋亡。圖19顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在用CMV溶胞物和抗ro-1刺激PBMC時(shí)，抗TO-1HuMab對(duì)來自CMV陽性供體的PBMC的IFNy分泌的濃度依賴性影響。圖20顯示小鼠模型系統(tǒng)中腫瘤生長實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證明用抗H)-l抗體在體內(nèi)治療小鼠腫瘤可抑制腫瘤生長。圖21A - 21D顯示有植入MC38結(jié)腸腫瘤細(xì)胞(PD_L1_)并在同一天用下述療法之一進(jìn)行治療的小鼠個(gè)體中各時(shí)間的腫瘤體積⑷小鼠IgG (對(duì)照)，⑶抗CTLA-4抗體，(C)抗I3D-1抗體，和(D)抗CTLA-4抗體及抗I3D-1抗體。如實(shí)施例13中所述，小鼠在第3、6和10天接受后續(xù)抗體治療，監(jiān)控腫瘤體積達(dá)60天。圖22顯示圖21中所示小鼠腫瘤體積的平均值。圖23顯示圖21中所示小鼠腫瘤體積的中間值。圖24A - 24D顯示有植入MC38結(jié)腸腫瘤細(xì)胞(PD-L1—)并在一周后用下述療法之一進(jìn)行治療的小鼠個(gè)體中各時(shí)間的腫瘤體積⑷小鼠IgG (對(duì)照)，⑶抗CTLA-4抗體，(C)抗I3D-1抗體，和(D)抗CTLA-4抗體及抗ro-1抗體。在進(jìn)行治療的第一天，腫瘤體積為大約315mm3。如實(shí)施例14中所述，小鼠在第3、6和10天接受后續(xù)抗體治療。圖25顯示圖24中所示小鼠腫瘤體積的平均值。圖26顯示圖24中所示小鼠腫瘤體積的中間值。圖27A - 27H顯示有植入MC38結(jié)腸腫瘤細(xì)胞(PD-LD (第_7天)然后在植入后第0、3、6和10天(如實(shí)施例15所述)用下述療法之一進(jìn)行治療的小鼠個(gè)體中各時(shí)間的腫瘤體積均值(A)小鼠IgG作為對(duì)照(20mg/kg, X20), (B)抗F1D-1抗體(10mg/kg)及小鼠IgG(10mg/kg) (P10X10), (C)抗 CTLA-4 抗體(10mg/kg)及小鼠 IgG(10mg/kg) (C10X10), (D)抗CTLA-4抗體及抗PD-1抗體(各10mg/kg) (C10P10)，(E)抗CTLA-4抗體及抗PD-1抗體(各3mg/kg) (C3P3)，和(F)抗CTLA-4抗體及抗F1D-1抗體(各lmg/kg) (C1P1)。兩組小鼠如下所述用各抗體依次進(jìn)行治療(G)抗CTLA-4抗體(10mg/kg,第0天)、抗CTLA-4抗體(10mg/kg,第 3 天)、抗 F1D-1 抗體(10mg/kg,第 6 天)及抗 PD-1 抗體(10mg/kg,第 10 天)(C10C10P10P10)，和(H)抗PD-1抗體(10mg/kg,第0 天)、抗PD-1抗體(10mg/kg,第3天)、抗CTLA-4抗體(10mg/kg,第 6 天)及抗 CTLA-4 抗體(10mg/kg,第 10 天)(P10P10C10C10)。圖28顯示圖27A — 27H中所示小鼠腫瘤體積的平均值。圖29顯不圖27A — 27H中所不小鼠腫瘤體積的中間值。圖30A - 30F顯示有植入SA1/N纖維肉瘤細(xì)胞(PD_L1_)并在一天后用下述療法之一進(jìn)行治療的小鼠個(gè)體中各時(shí)間的腫瘤體積=(A)PBS(媒介對(duì)照)，⑶小鼠IgG(抗體對(duì)照，10mg/kg)，(C)抗 F1D-1 抗體(10mg/kg), (D)抗 CTLA-4 抗體(10mg/kg), (E)抗 CTLA-4抗體(0. 2mg/kg),和(F)抗 PD-1 抗體(10mg/kg)及抗 CTLA-4 抗體(0. 2mg/kg)。如實(shí)施例16中所述，小鼠在第4、7和11天接受后續(xù)抗體治療，監(jiān)控腫瘤體積達(dá)41天。圖31顯示圖29中所示小鼠腫瘤體積的平均值。圖32顯示圖29中所示小鼠腫瘤體積的中間值。圖33A - 33J顯示有植入SA1/N纖維肉瘤細(xì)胞(PD-LD然后在植入后第7、10、13和17天(如實(shí)施例17中所述)用下述療法之一進(jìn)行治療的小鼠個(gè)體中各時(shí)間的腫瘤體積(A) PBS (媒介對(duì)照)，(B)小鼠 IgG (抗體對(duì)照，10mg/kg), (C)抗 CTLA-4 抗體(0. 25mg/kg),
(D)抗 CTLA-4 抗體(0. 5mg/kg)，(E)抗 CTLA-4 抗體(5mg/kg)，(F)抗 PD-1 抗體(3mg/kg)，(G)抗 PD-1 抗體(10mg/kg)，(H)抗 PD-1 抗體(10mg/kg)及抗 CTLA-4 抗體(0. 25mg/kg)，(I)抗 PD-1 抗體(10mg/kg)及抗 CTLA-4 抗體(0. 5mg/kg)，和(F)抗 PD-1 抗體(3mg/kg)及抗CTLA-4抗體(0. 5mg/kg)。進(jìn)行治療的第一天,腫瘤體積為約110mm3。圖34顯示圖33A — 33J中所示小鼠腫瘤體積的平均值。圖35顯示圖33A — 33J中所示小鼠腫瘤體積的中間值。
圖36A - 36B顯示有植入SAl/N纖維肉瘤細(xì)胞(PD-LD然后在植入后第10、13、16和19天(如實(shí)施例17中所述)用下述療法之一進(jìn)行治療的小鼠個(gè)體中各時(shí)間的腫瘤體積⑷小鼠IgG (抗體對(duì)照，10mg/kg)或⑶抗F1D-1抗體(10mg/kg)及抗CTLA-4抗體(lmg/kg)。在進(jìn)行治療的第一天，腫瘤體積為約250mm3。圖37顯示圖36A — 36B中所示小鼠腫瘤體積的平均值。圖38顯示圖36A — 36B中所示小鼠腫瘤體積的中間值。圖39顯示從圖33A - 33J和36A — 36B所示腫瘤體積計(jì)算得出的腫瘤抑制百分比的平均值和中間值。圖40A — 40D顯示有皮下植入RENCA腎臟腺癌細(xì)胞(PD-Ll+) (Murphy和Hrushesky (1973) J. Nat，1. Cancer Res. 50:1013-1025)(第-12 天)然后在植入后第 0、3、6和9天用下述療法之一進(jìn)行腹膜內(nèi)治療的BALB/c小鼠中的腫瘤體積(A)小鼠IgG (抗體對(duì)照，20mg/kg), (B)抗 F1D-1 抗體(10mg/kg), (C)抗 CTLA-4 抗體(10mg/kg),和(D)抗 F1D-1抗體(10mg/kg)與抗CTLA-4抗體(10mg/kg)的組合。在進(jìn)行治療的第一天，腫瘤體積為約II5mm3o圖41顯示抗mPD-1抗體4H2以劑量依賴的方式阻斷小鼠H)-L2-Fc融合蛋白與小鼠ro-1 (mPD-1)的結(jié)合。通過ELISA測量FITC標(biāo)記的驢抗大鼠IgG的熒光來檢測結(jié)合。MFI (平均熒光強(qiáng)度)越強(qiáng)，結(jié)合越多。圖42顯示通過ELISA測定的抗mPD-1抗體對(duì)固定化mPD-l_Fc融合蛋白的結(jié)合曲線。圖43顯示大鼠抗mPD-1抗體4H2. B3對(duì)表達(dá)mPD_l的CHO細(xì)胞的結(jié)合曲線。采用偶聯(lián)有FITC的驢抗大鼠IgG檢測結(jié)合，通過FACS測量(MFI)。圖44顯示在抗mPD-1抗體4H2. B3的濃度逐漸增加時(shí)mPD-Ll_hFc融合蛋白對(duì)表達(dá)mPD-1的CHO細(xì)胞的結(jié)合曲線。采用偶聯(lián)有FITC的山羊抗人IgG檢測結(jié)合，通過FACS測量(MFI)。圖45顯示與嵌合大鼠小鼠抗mPD-1抗體4H2相比，大鼠抗mPD-1抗體4H2.B3對(duì)表達(dá)mPD-1的CHO細(xì)胞的結(jié)合曲線。圖46顯示在大鼠抗mPD-1抗體4H2. B3或嵌合大鼠小鼠抗mPD_l抗體4H2的濃度逐漸增加時(shí)mPD-Ll-hFc融合蛋白對(duì)表達(dá)mPD-1的CHO細(xì)胞的結(jié)合曲線。圖47顯示先用抗PDl抗體治療然后用SA1/N纖維肉瘤細(xì)胞(PD-LD再次刺激的無腫瘤小鼠的平均腫瘤體積。還顯示有植入SA1/N纖維肉瘤細(xì)胞的未實(shí)驗(yàn)小鼠(對(duì)照，沒有先刺激或治療)的平均腫瘤體積。圖48顯示無腫瘤的存活小鼠個(gè)體中各時(shí)間的腫瘤體積，該小鼠在植入MC38結(jié)腸腫瘤細(xì)胞(PD-Lr)并用抗ro-1抗體或抗PDl與抗CTLA-4抗體的組合治療后，用超過最初處理10倍的MC38結(jié)腸腫瘤細(xì)胞再次刺激。還顯示有植入MC38結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的未實(shí)驗(yàn)小鼠(對(duì)照，沒有先刺激或治療)的平均腫瘤體積。圖49顯示圖48中所示小鼠腫瘤體積的平均值。圖50顯示有植入CT26結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的小鼠個(gè)體中各時(shí)間的平均腫瘤體積。
圖51A - 51B顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明針對(duì)人I3D-1的人單克隆抗體促進(jìn)含有T調(diào)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)物中T細(xì)胞的增殖和IFN y的分泌。圖51A的條線圖顯示濃度依賴性的T細(xì)胞增殖，其使用HuMAb5C4 ;圖51B的條線圖顯示濃度依賴性的IFNy分泌，其使用HuMAb5C4。圖52A - 52B顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明針對(duì)人I3D-1的人單克隆抗體促進(jìn)含有活化的T細(xì)胞的培養(yǎng)物中T細(xì)胞的增殖和IFN y的分泌。圖52A的條線圖顯示濃度依賴性的T細(xì)胞增殖，其使用HuMAb5C4 ；圖52B的條線圖顯示濃度依賴性的IFN y分泌，其使用HuMAb5C4。圖53顯示抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)測定法的結(jié)果，其證明人單克隆抗PD-1抗體以ADCC濃度依賴性的方式殺死活化的人T細(xì)胞，其與抗H)-l抗體的Fe區(qū)有關(guān)。圖54顯示補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測定法的結(jié)果，其證明人單克隆抗I3D-1抗體不以CDC濃度依賴性的方式殺死活化的人T細(xì)胞。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式在一方面，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體，其與ro-1特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體展現(xiàn)出一種或多種優(yōu)良的功能特性，諸如與人PD-1高親和力結(jié)合，缺少與CD28家族其它成員的交叉反應(yīng)性，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中刺激T細(xì)胞增殖、IFN- Y和/或IL-2分泌的能夠，抑制一種或多種ro-1配體(例如ro-Li和/或ro-L2)結(jié)合的能力，與獼猴ro-1交叉反應(yīng)的能力，刺激抗原特異性記憶應(yīng)答的能力，刺激抗體應(yīng)答的能力和/或抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的能力。另外/或者，本發(fā)明的抗體源自特定的重鏈和輕鏈種系序列和/或包含特定的結(jié)構(gòu)特征，諸如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。在另一方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合I3D-1的單克隆抗體與特異性結(jié)合CTLA-4的單克隆抗體的聯(lián)合使用。本發(fā)明提供了例如分離的抗體、制備此類抗體的方法、包含此類抗體的免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子、及含有本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥用組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及使用抗ro-1抗體抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長的方法。如本文所證明的，抗ro -1抗體能夠抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長。本發(fā)明還涉及使用所述抗體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以及治療諸如癌癥或傳染病的疾病，或者刺激保護(hù)性自身免疫應(yīng)答或刺激抗原特異性免疫應(yīng)答(例如通過共施用抗ro-1和目標(biāo)抗原)的方法。為使本發(fā)明更易于理解，首先定義某些術(shù)語。別的定義將在整個(gè)詳述中闡明。術(shù)語“程序性死亡1”、“程序性細(xì)胞死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD_1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hro-1”可互換使用，包括人ro-1的變體、同種型(isoform)、物種同系物，及與PD-1具有至少一個(gè)共同表位的類似物。完整的ro-1序列可以根據(jù)GenBank編號(hào)U64863查到。術(shù)語“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA_4抗原”和“CD152”(參見例如 Murata (1999) Am. J. Pathol. 155:453-460)可互換使用，包括人 CTLA-4的變體、同種型、物種同系物，及與CTLA-4具有至少一個(gè)共同表位的類似物(參見例如Balzano (1992) Int. J. Cancer Supp1. 7:28-32)。完整的 CTLA-4 核酸序列可以根據(jù) GenBank編號(hào)L15006查到。術(shù)語“免疫應(yīng)答”指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞，和由上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，其導(dǎo)致?lián)p害、破壞或消除侵襲人體的病原體、感染病原體的細(xì)胞或組織、癌性細(xì)胞，或在自身免疫或病理性炎癥時(shí)的正常人細(xì)胞或組織?！靶盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”指在信號(hào)從細(xì)胞的一部分到細(xì)胞的另一部分的傳送過程中起作用的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生物化學(xué)關(guān)系。在用于本文時(shí)，短語“細(xì)胞表面受體”包括例如能夠接收信號(hào)并將該信號(hào)傳送穿過細(xì)胞質(zhì)膜的分子和分子復(fù)合物。本發(fā)明的“細(xì)胞表面受體”的實(shí)例為ro-1受體。術(shù)語“抗體”在用于本文時(shí)包括完整的抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈?！翱贵w”指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文中簡寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1、CH2和Ch3構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文中簡寫為')和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域，Q構(gòu)成。Vh和\區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為高變性區(qū)域，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其散布在更保守的區(qū)域中，稱為框架區(qū)(FR)。每條％和'由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR構(gòu)成，其從氨基端到羧基端以下列順序排列FRl、OTRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白對(duì)宿主組織或因子的結(jié)合，其包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。
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術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)在用于本文時(shí)指一個(gè)或多個(gè)保留了與抗原(例如ro-1)特異性結(jié)合的能力的抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段行使。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由\、VH、Cl和Cm結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通過鉸鏈區(qū)二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fd片段，由VdP Cm結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature341:544-546),由Vh結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，八和Vh由分開的基因編碼，但是可以使用重組方法通過合成的接頭將它們連接，從而使它們能夠制備成單個(gè)蛋白鏈，其中 '和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv (scFv);參見例如 Bird 等人(1988) Science242:423-426;和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sc1.USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意圖涵蓋在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。這些抗體片段可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，可以以與完整抗體相同的方式對(duì)片段篩選功用。“分離的抗體”在用于本文時(shí)意圖指基本沒有具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如與ro-1特異性結(jié)合的分離的抗體基本沒有與ro-1以外的其它抗原特異性結(jié)合的抗體)。但是，與ro-1特異性結(jié)合的分離的抗體與其它抗原諸如來自其它物種的ro-1分子具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本沒有其它細(xì)胞材料和/或化學(xué)藥品?！皢慰寺】贵w”或“單克隆抗體組合物”在用于本文時(shí)指單一分子組合物的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展現(xiàn)出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。術(shù)語“人抗體”在用于本文時(shí)意圖包括可變區(qū)中的框架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列的抗體。此外,如果抗體包含恒定區(qū),那么恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可以包含不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)的或位點(diǎn)特異的誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。但是，術(shù)語“人抗體”在用于本文時(shí)不想包括將源自另一哺乳動(dòng)物物種諸如小鼠的CDR序列嫁接到人框架序列中所獲得的抗體。術(shù)語“人單克隆抗體”指展示出單一結(jié)合特異性的抗體，其可變區(qū)中的框架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。在一種實(shí)施方式中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與永生化細(xì)胞融合的得自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞，其基因組包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因。術(shù)語“重組人抗體”在用于本文時(shí)包括所有通過重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的人抗體，諸如(a)從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文將進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從通過轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞，例如從轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(C)從重組的、組合的人抗體庫中分離的抗體，和(d)通過涉及將人免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列剪接的任何其它手段制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的抗體。此類重組人抗體的可變區(qū)中的框架區(qū)和⑶R區(qū)源自人種系免疫球蛋白序列。但是在某些實(shí)施方式中，可以對(duì)此類重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或者在使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞突變)，如此使得重組抗體的Vh和 '區(qū)的氨基酸序列雖然源自且與人種系vn和vL序列有關(guān)，但不天然存在于體內(nèi)人抗體種系全集(repertoire)中。在用于本文時(shí)，“同種型(isotype)”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(例如IgM 或 IgGl )。短語“識(shí)別抗原的抗體”和“對(duì)抗原特異的抗體”在本文中可以與術(shù)語“與抗原特異性結(jié)合的抗體”互換使用。術(shù)語“人抗體衍生物”指人抗體的任何改良形式，例如抗體與另一試劑或抗體的偶聯(lián)物。術(shù)語“人源化抗體”意圖指將源自另一哺乳動(dòng)物物種，諸如小鼠種系的CDR序列嫁接到人框架序列上獲得的抗體?？梢栽谌丝蚣苄蛄兄羞M(jìn)行別的框架區(qū)修飾。術(shù)語“嵌合抗體”意圖指可變區(qū)序列源自一種物種而恒定區(qū)序列源自另一種物種的抗體，諸如可變區(qū)序列源自 小鼠抗體而恒定區(qū)序列源自人抗體的抗體。在用于本文時(shí)，“與人ro-1特異性結(jié)合”的抗體意圖指以1x10_7M或更小，更優(yōu)選5x10_8M或更小，更優(yōu)選1x10_8M或更小，更優(yōu)選5x10_9M或更小的Kd與人I3D-1結(jié)合的抗體。術(shù)語“Kass。?！被颉癒a”在用于本文時(shí)意圖指特定抗體一抗原相互作用的結(jié)合速率(association rate),術(shù)語“Kdis”或“Kd”在用于本文時(shí)意圖指特定抗體一抗原相互作用的解離速率(dissociation rate)。術(shù)語“KD”在用于本文時(shí)意圖指解離常數(shù),其由Kd與Ka的比值(即Kd/Ka)獲得，以摩爾濃度(M)表示。抗體的Kd值可以使用本領(lǐng)域公知的方法測定。一種優(yōu)選的測定抗體Kd的方法使用表面等離振子共振(surface p lasmon resonance),更優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，例如Biacore 系統(tǒng)。在用于本文時(shí)，術(shù)語IgG抗體的“高親和力”指抗體對(duì)靶抗原具有10_8M或更小，更優(yōu)選10_9M或更小，甚至更優(yōu)選ΙΟ,Μ或更小的KD。但是，“高親和力”結(jié)合對(duì)于其它抗體同種型可能有所不同。例如，IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指抗體具有KT7M或更小，更優(yōu)選IO-8M或更小，甚至更優(yōu)選10_9M或更小的KD。術(shù)語“治療”或“療法”指為了以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式治療、治愈、減輕、緩解、改變、補(bǔ)救、改善、改進(jìn)或影響疾患(例如疾病)、疾患的癥狀，或預(yù)防或延緩癥狀、并發(fā)癥、生化指標(biāo)的發(fā)作，或以其它方式阻滯或抑制疾病、疾患或病癥的進(jìn)一步發(fā)展而施用活性劑?！安涣际录?AE)在用于本文時(shí)指與使用藥物治療有關(guān)的任何不利的和通常不是故意，甚至是不希望出現(xiàn)的征候(包括異常的化驗(yàn)所見)、癥狀或疾病。例如，不良事件可能與應(yīng)答治療引起的免疫系統(tǒng)的激活或免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如T細(xì)胞)的擴(kuò)增有關(guān)。藥物治療可以具有一種或多種相關(guān)AE，每種AE可以具有相同或不同水平的嚴(yán)重程度。提及能夠“改變不良事件”的方法表示該治療方案降低了與使用不同治療方案有關(guān)的一種或多種AE的發(fā)生率和/或嚴(yán)重性。在用于本文時(shí)，“過度增殖性疾病”指細(xì)胞生長超出正常水平的疾患。例如，過度增殖性疾病或病癥包括惡性疾病(例如食道癌、結(jié)腸癌、膽癌)和非惡性疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、良性增生、良性前列腺肥大)。在用于本文時(shí)，“亞治療劑量”表示治療化合物(例如抗體)的劑量低于單獨(dú)施用該治療化合物用于治療過度增殖性疾病(例如癌癥)時(shí)慣?；虻湫偷膭┝俊＠?，亞治療劑量的CTLA-4抗體為少于約3mg/kg (即抗CTLA-4抗體的已知?jiǎng)┝?的單劑抗體。使用可選的(例如“或”)應(yīng)理解為表示可選項(xiàng)的任一項(xiàng)、全部兩項(xiàng)或其任意組合。在用于本文時(shí)，“一個(gè)”或“一種”應(yīng)當(dāng)理解為指“一個(gè)或多個(gè)”或“一種或多種”任何述及或列舉的成分。在用于本文時(shí)，“約”或“基本含有”表示在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員判定的對(duì)特定值可以接受的誤差范圍內(nèi)，其部分取決于 如何測量或測定該值，即測量系統(tǒng)的限制。例如，“約”或“基本含有”按照本領(lǐng)域?qū)嵺`可以表示I倍或超過I倍標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)?；蛘?，“約”或“基本含有”可以表示多至20%的范圍。此外，特別對(duì)于生物學(xué)系統(tǒng)或方法，該術(shù)語可以表示多至一個(gè)數(shù)量級(jí)或多至某值的5倍。當(dāng)本申請(qǐng)或權(quán)利要求中給出特定值時(shí)，除非另有說明，“約”或“基本含有”的含義應(yīng)認(rèn)為是在該特定值可接受的誤差范圍內(nèi)。如本文中所述，除非另有說明，任何濃度范圍、百分比范圍、比率范圍或整數(shù)范圍都應(yīng)理解為包括所述范圍內(nèi)的任意整數(shù)值，而且在合適的時(shí)候包括其分?jǐn)?shù)(諸如整數(shù)的十分之一和百分之一)。在用于本文時(shí)，術(shù)語“受試者”包括任何人類或非人動(dòng)物。術(shù)語“非人動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，諸如非人靈長類、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。除非標(biāo)明，術(shù)語“患者”或“受試者”可以互換使用。本發(fā)明的各個(gè)方面將在下述分部中進(jìn)一步詳細(xì)描述?？筆D-1 抗體本發(fā)明抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，所述抗體與F1D-1特異性結(jié)合(例如與人ro-ι結(jié)合且可以與來自其它物種諸如獼猴的ro-1交叉反應(yīng))。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體以高親和力，例如以ixio_7M或更小的Kd與ro-1結(jié)合。本發(fā)明的抗ro-1抗體優(yōu)選展現(xiàn)出一種或多種下列特征(a)以IxlO-7M或更小的Kd與人ro-Ι結(jié)合；(b)不顯著與 CD28、CTLA-4 或 ICOS 結(jié)合；(c)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定法中增加T細(xì)胞增殖；(d)在MLR測定法中增加干擾素-Y的產(chǎn)量；(e)在MLR測定法中增加IL-2的分泌；(f)與人ro-1和獼猴ro-1結(jié)合；(g)抑制ro-Li和/或ro-L2與ro-1的結(jié)合；(h)刺激抗原特異性記憶應(yīng)答；⑴刺激抗體應(yīng)答；
(j)抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長。優(yōu)選的是，所述抗體以5xlO_8M或更小的Kd與人I3D-1結(jié)合，以1x10_8M或更小的Kd與人PD-1結(jié)合，以5xlO_9M或更小的Kd與人PD-1結(jié)合，或以IxKT8M和ΙχΙΟ,Μ之間或更小的Kd與人ro-1結(jié)合。本發(fā)明的抗體可展現(xiàn)出上述特征的任意組合，諸如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)上述特征。評(píng)估抗體對(duì)ro-Ι的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測定法是本領(lǐng)域公知的，包括例如ELISA、Western印跡和RIA?？贵w的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如結(jié)合親和力)也可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定法來評(píng)估，諸如通過Biacore分析。實(shí)施例中詳細(xì)描述了適于評(píng)估任何上述特征的測定法。單克隆抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和 5F4本發(fā)明優(yōu)選的抗體是人單克隆抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4，其分離及結(jié)構(gòu)表征如實(shí)施例1和2中所述。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的Vh氨基酸序列分別如 SEQ ID N0s:l、2、3、4、5、6 和 7 中所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和 5F4 的 Vl氨基酸序列分別如SEQ ID N0s:8、9、10、ll、12、13和14中所示。倘若這些抗體中每個(gè)都能與ro-Ι結(jié)合，那么Vh和\序列可以“混合和匹配”以創(chuàng)造本發(fā)明的其它抗ro-1結(jié)合分子?？梢允褂蒙衔暮蛯?shí)施例中所述的結(jié)合測定法(例如ELISA)來測試ro-Ι與此類“混合和匹配”抗體的結(jié)合。優(yōu)選的是，當(dāng)Vh和\鏈混合和匹配時(shí)，來自特定VhZvl配對(duì)的Vh序列用結(jié)構(gòu)類似的Vh序列替換。同樣的，優(yōu)選來自特定VH/VL配對(duì)的\序列用結(jié)構(gòu)類似的\序列替換。
因此，在一方面，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列;和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID N0s:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸序列;其中所述抗體與ro-1，優(yōu)選人ro-1特異性結(jié)合。優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；或(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；或(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；或(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；或(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；或(a)重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的重鏈和輕鏈 CDRU CDR2 和 CDR3,或其組合的抗體。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和 5F4 的 Vh CDRl的氨基酸序列分別如 SEQ ID NOs: 15, 16、17、18、19、20 和 21 所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和 5F4 的乂11 CDR2 的氨基酸序列分別如 SEQ ID NOs: 22、23、24、25、26、27 和 28 所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和 5F4 的 Vh CDR3 的氨基酸序列分別如 SEQ ID NOs:29,30、31、32、33、34 和 35 所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和 5F4 的 Vk CDRl 的氨基酸序列分別如 SEQ ID N0s:36、37、38、39、40、41 和 42 所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和5F4 的 VKCDR2 的氨基酸序列分別如 SEQ ID NOs:43、44、45、46、47、48 和 49 所示。17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 和 5F4 的 Vk CDR3 的氨基酸序列分別如 SEQ ID N0s:50、51、52、53、54、55 和 56 所示。使用 Kabat 系統(tǒng)標(biāo)示出 CDR 區(qū)(Kabat，E. A.等人(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242)。倘若這些抗體中每個(gè)都能與Η)-1結(jié)合且抗原結(jié)合特異性主要由⑶R1、⑶R2和CDR3區(qū)提供，那么Vh CDRU CDR2和CDR3序列和Vk CDRU CDR2和CDR3序列可以“混合和匹配”(即來自不同抗體的⑶R可以混合和匹配，雖然每個(gè)抗體必需包含Vh⑶R1、⑶R2和⑶R3&VK⑶R1XDR2和⑶R3)以創(chuàng)造本發(fā)明的其它抗ro-1結(jié)合分子?？梢允褂蒙衔暮蛯?shí)施例中所述的結(jié)合測定法(例如ELISA、Biac0re分析)來測試TO-1與此類“混合和匹配”抗體的結(jié)合。優(yōu)選的是，當(dāng)混合和匹配Vh⑶R序列時(shí)，來自特定Vh序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列用結(jié)構(gòu)類似的⑶R序列替換。同樣的，當(dāng)混合和匹配Vk⑶R序列時(shí)，來自特定Vk序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列用結(jié)構(gòu)類似的⑶R序列替換。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見的是，可以將一個(gè)或多個(gè)Vh和/或\ CDR區(qū)序列用來自本文關(guān)于單克隆抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4所公開的⑶R序列的結(jié)構(gòu)類似序列替換以創(chuàng)造新的Vh和Vl序列。因此，在另一方面，本發(fā)明提供 了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含(a)重鏈可變區(qū)CDRl，其包含選自SEQ ID NOs: 15、16、17、18、19、20和21的氨基酸序列；(b)重鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NOs: 22、23、24、25、26、27和28的氨基
酸序列；(c)重鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID N0s:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；(d)輕鏈可變區(qū)CDRl，其包含選自SEQ ID NOs: 36、37、38、39、40、41和42的氨基
酸序列；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NOs:43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列；和(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID N0s:50、51、52、53、54、55和56的氨基
酸序列；其中所述抗體與ro-1，優(yōu)選人ro-1特異性結(jié)合。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體包含(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO: 15 ；
(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQ ID NO:22 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID NO:29 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO:36 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQ ID NO:43 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:50。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體包含(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO: 16 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQ ID NO:23 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID NO:30 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO:37 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQ ID NO:44 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:51。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體包含(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO: 17 ；(b)重鏈可變 區(qū) CDR2，其包含 SEQ ID NO:24 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:31 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO:38 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQ ID NO:45 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:52。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體包含(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO: 18 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQ ID NO:25 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID NO:32 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO:39 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQ ID NO:46 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:53。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體包含(a)重鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO: 19 ；(b)重鏈可變區(qū) CDR2，其包含 SEQ ID NO:26 ；(c)重鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID NO:33 ；(d)輕鏈可變區(qū) CDRl，其包含 SEQ ID NO:40 ；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQ ID NO:47 ;和(f)輕鏈可變區(qū) CDR3，其包含 SEQ ID N0:54。具有特定種系序列的抗體在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人vh3-33基因的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1，優(yōu)選人ro-1特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人vh4-39基因的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1，優(yōu)選人ro-1特異性結(jié)合。在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人vK L6基因的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1，優(yōu)選人ro-1特異性結(jié)合。在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或源自人Vk LI5基因的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體與ro-1，優(yōu)選人ro-1特異性結(jié)合。在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體(a)包含產(chǎn)自或源自人VH3_33或4-39基因的重鏈可變區(qū)(該基因分別編碼SEQ IDNO:71或73中所示的氨基酸序列)；(b)包含產(chǎn)自或源自人Vk L6或L15基因的輕鏈可變區(qū)(該基因分別編碼SEQ IDNO:72或74中所示的氨基酸序列)；且(C)與ro-Ι特異性結(jié)合。Vh和Vk分別為Vh3-33和Vk L6的抗體的實(shí)例為17D8、2D3、4H1、5C4和7D3。Vh和Vk分別為Vh4-39和Vk L15的抗體的實(shí)例為4A11和5F4。在用于本文時(shí)，如果人抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)得自使用特定人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)，那么所述抗體包含“產(chǎn)自”或“源自”所述種系序列的可變區(qū)。此類系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或用目標(biāo)抗原篩選噬菌體展示的人免疫球蛋白基因庫。鑒定“產(chǎn)自”或“源自”人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以通過比較人抗體的氨基酸序列與人種系免 疫球蛋白的氨基酸序列，然后選擇在序列上與人抗體序列最接近(即最大％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。由于例如天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或故意引入的定點(diǎn)突變，“產(chǎn)自”或“源自”特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與種系序列相比可以包含氨基酸差異。然而，所選人抗體通常與人種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，而且包含在與其它物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比時(shí)將人抗體鑒定為人的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體可以與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列具有至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常，源自特定人種系序列的人抗體與人種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列之間的氨基酸差異不超過10個(gè)。在某些情況下，人抗體與種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列之間的氨基酸差異可以不超過5個(gè)，或甚至不超過4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或I個(gè)。同源抗體在又一方面，本發(fā)明抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)所包含的氨基酸序列與本文所述的優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源，且其中所述抗體保留了本發(fā)明抗ro-1抗體的期望的功能特性。例如，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)所述重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)所述輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID N0s:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；且
所述抗體展現(xiàn)出一種或多種下述特性(c)所述抗體以1x10_7M或更小的Kd與人H)_l結(jié)合；(d)所述抗體不顯著與人⑶28、CTLA-4或ICOS結(jié)合；(e)所述抗體在MLR測定法中增加T細(xì)胞的增殖；(f)所述抗體在MLR測定法中增加干擾素-Y的產(chǎn)量；(g)所述抗體在MLR測定法中增加IL-2的分泌；(h)所述抗體與人ro-1和獼猴ro-1結(jié)合；⑴所述抗體抑制ro-Li和/或ro-L2與ro-1的結(jié)合；(j)所述抗體刺激抗原特異性記憶應(yīng)答；(k)所述抗體刺激抗體應(yīng)答；(I)所述抗體抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長。在其它實(shí)施方式中，Vh和/或\氨基酸序列可以與上述序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。Vh和\區(qū)與上述序列的Vh和\區(qū)具有高(即80%或更高)同源性的抗體可以通過誘變(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ ID N0s:57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的核酸分子，然后使用本文所述的功能測定法對(duì)所編碼的改變后的抗體測試所保留的功能(即上述(c)到(I)所示的功能)獲得。在用于本文時(shí)，兩氨基酸序列之間的百分比同源性等于兩序列之間的百分比同一性。兩序列間的百分比同一性為序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即％同源性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)xlOO)，其中需考慮產(chǎn)生兩序列的最優(yōu)比對(duì)需要引入的缺口數(shù)和每個(gè)缺口的長度。如下述非限制性實(shí)施例所示，可以使用數(shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩序列間百分比同一性的測定。可以使用E. Meyers 和 ff. Miller 的算法(Comput. Appl. Biosc1. , 4:11-17 (1988))測定兩氨基酸序列間的百分比同一性，該算法已收入到ALIGN程序(版本2. O)中，其使用PAM120殘基權(quán)重表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4。此外，可以使用Needleman和Wunsch的算法(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970))測定兩氨基酸序列間的百分比同一性，該算法已摻入到GCG軟件包(可在www. gcg. com獲得)中的GAP程序中，其使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。另外/或者，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作“查詢序列”對(duì)公用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索以例如鑒定相關(guān)序列。此類搜索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol. 215:403-10的XBLAST程序(版本2. O)進(jìn)行?？梢圆捎肵BLAST程序以得分=50，詞長=3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索以獲得與本發(fā)明抗體分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較的含缺口的比對(duì)結(jié)果，如 Altschul 等人(1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402 所述使用Gapped BLAST。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用各程序(例如XBLAST和 NBLAST)的缺省參數(shù)。(參見 www. ncb1. nlm. nih. gov)。具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方式中，本發(fā) 明的抗體包含含有⑶R1XDR2和⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和含有⑶R1XDR2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些⑶R序列中的一個(gè)或多個(gè)包含基于本文所述優(yōu)選抗體(例如17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4)的特定氨基酸序列或其保守修飾，且其中所述抗體保留了本發(fā)明抗ro-1抗體的期望的功能特性。因此，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)所述重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NOs: 29、30、31、32、33、34和35所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)所述輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NOs: 50、51、52、53、54、55和56所示氨基酸序列及其保守突變的氨基酸序列；且所述抗體展現(xiàn)出一種或多種下述特性(c)所述抗體以1χ1(Γ7Μ或更小的Kd與人Η)_1結(jié)合；(d)所述抗體不顯著與人⑶28、CTLA-4或ICOS結(jié)合；(e)所述抗體在MLR測定法中增加T細(xì)胞的增殖；(f)所述抗體在MLR測定法中增加干擾素-Y的產(chǎn)量；(g)所述抗體在MLR測·定法中增加IL-2的分泌；(h)所述抗體與人ro-1和獼猴ro-1結(jié)合；⑴所述抗體抑制ro-Li和/或ro-L2與ro-1的結(jié)合；(j)所述抗體刺激抗原特異性記憶應(yīng)答；(k)所述抗體刺激抗體應(yīng)答；(I)所述抗體抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID N0s:22、23、24、25、26、27和28所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；所述輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID N0s:43、44、45、46、47、48和49所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQ ID N0s:15、16、17、18、19、20和21所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；所述輕鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQ ID N0s:36、37、38、39、40、41和42所示氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。在用于本文時(shí)，術(shù)語“保守序列修飾”意圖指氨基酸修飾不會(huì)顯著影響或改變含有該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征。此類保守修飾包括氨基酸的取代、添加和缺失。修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)引入到本發(fā)明的抗體中。保守氨基酸取代指氨基酸殘基用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領(lǐng)域中對(duì)具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已有詳細(xì)說明。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，可以用來自同一側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基替換本發(fā)明抗體CDR區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并使用本文所述的功能測定法對(duì)改變后的抗體測試保留的功能(即上述(c)至(I)所示的功能)。與本發(fā)明的抗ro-1抗體結(jié)合相同表位的抗體在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的任何ro-1單克隆抗體結(jié)合人ro-1上相同表位的抗體(即能夠與本發(fā)明的任何單克隆抗體交叉競爭與ro-1的結(jié)合的抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于交叉競爭研究的參照抗體可以是單克隆抗體17D8(具有分別如SEQID NOs:l和8所示的'序列)或單克隆抗體2D3(具有分別如SEQ ID N0s:2和9所示的Vh和Vl序列)或單克隆抗體4H1 (具有分別如SEQ ID NOs:3和10所示的Vh和Vl序列)或單克隆抗體5C4 (具有分別如SEQ ID N0s:4和11所示的V1^P'序列)或單克隆抗體4A11 (具有分別如SEQ ID NOs:5和12所示的Vh和Vl序列)或單克隆抗體7D3 (具有分別如SEQ ID NOs: 6 13所示的Vh和Vl序列)或單克隆抗體5F4 (具有分別如SEQ ID NOs: 7和14所示的vH和\序列)。此類交叉競爭性抗體可以根據(jù)它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)ro-1結(jié)合測定法中與17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4交叉競爭的能力進(jìn)行鑒定。例如，可使用BIAcore分析、ELISA測定法或流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來證明與本發(fā)明抗體的交叉競爭。受試抗體抑制例如17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4與人H)-1結(jié)合的能力證明了受試抗體能夠與17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3 或 5F4 競爭與人 PD-1 的結(jié)合，因此與 17D8、2D3、4H1、5C4 或 4A11 結(jié)合人I3D-1上的相同表位。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，與17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4結(jié)合人ro-1上的相同表位的抗體是人單克隆抗體。此類人單克隆抗體可以如實(shí)施例中所述的進(jìn)行制備和分離。工程改造的和修飾的抗體本發(fā)明的抗體進(jìn)一步可以使用具有一個(gè)或多個(gè)本文所公開的Vh和/或\序列的抗體作為起始材料來工程改造修飾后的抗體進(jìn)行制備，其中所述修飾后的抗體可以具有與起始抗體不同的特性?？贵w可以通過修飾一個(gè)或全部兩個(gè)可變區(qū)(即V1^P/或')中，例如一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)中和/或一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)殘基來進(jìn)行工程改造。另外/或者，抗體可以通過修飾恒定區(qū)中的殘基以例如改變抗體的效應(yīng)器功能來進(jìn)行工程改造。可以進(jìn)行的一類可變區(qū)工程改造是⑶R嫁接。抗體與靶抗原相互作用主要是通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基。因?yàn)檫@個(gè)原因，抗體個(gè)體間CDR中的氨基酸序列的差異比CDR外序列的大。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大部分抗體一抗原相互作用，所以有可能通過構(gòu)建表達(dá)載體來表達(dá)模擬特定天然存在抗體性質(zhì)的重組抗體，該表達(dá)載體包含來自特定天然存 在抗體的CDR序列，其嫁接到來自具有不同特性的不同抗體的框架序列上(參見例如 Riechmann, L.等人(1998)Nature332:323-327; Jones, P.等人(1986) Nature321: 522-525 ; Queen, C.等人(1989) Proc. Natl. Acad. See.U. S. A. 86:10029-10033; Winter 的美國專利 No. 5，225，539 及 Queen 等人的美國專利 Nos. 5，530，101; 5，585，089; 5，693，762 和 6，180，370)。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其所含重鏈可變區(qū)包含的CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQ ID NOs: 15、16、17、18、19、20
21,SEQ ID N0s:22、23、24、25、26、27和28，及SEQ ID N0s:29、30、31、32、33、34和35 的氨基酸序列，其所含輕鏈可變區(qū)包含的⑶R1XDR2和⑶R3序列分別包含選自SEQ ID NOs:36,37、38、39、40、41 和 42，SEQ ID NOs:43、44、45、46、47、48 和 49，及 SEQ ID N0s:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列。因此，此類抗體包含單克隆抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3或5F4的Vh和VfDR序列，但可以包含與這些抗體不同的框架序列。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(可以通過互聯(lián)網(wǎng)在謂I mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase上獲得)和Kabat, E. A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Departmentof Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;Tomlinson,1. M.等人
(1992)〃The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groupsof Vh Segments with Different Hypervariable Loops^J. Mol. Biol. 227:776-798;和Cox, J. P. L.等人(1994)〃A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals aStrong Bias in their Usage〃Eur. J.1mmunol. 24:827-836 中找到；其每一篇的內(nèi)容均通過參考清楚的收入。作為另一實(shí)例，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到。例如，下列在HCo7HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的重鏈種系序列可以通過附帶的 GenBank 編號(hào)獲得1-69 (NG_0010109，NT_024637 和 BC070333)，3_33 (NG_0010109 和NT_024637)和 3_7 (NG_0010109 和 NT_024637)。作為另一實(shí)例，下列在 HCol2HuMAb 小鼠中發(fā)現(xiàn)的重鏈種系序列可以通過附帶的GenBank編號(hào)獲得1_69 (NG_0010109，NT_024637和 BC070333), 5-51 (NG_00 10 109 和 ΝΤ_024637)，4_34 (NG_0O I O I O 9 和NT_024637)，3-30. 3(AJ556644)和 3-23 (AJ406678)。本發(fā)明抗體中所用的優(yōu)選的框架序列是那些與本發(fā)明所選抗體所使用的框架序列結(jié)構(gòu)類似的框架序列，例如與本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體所用的VH3-33框架序列(SEQ IDNO: 71)和 / 或 VH4-39 框架序列(SEQ ID NO: 73)和 / 或 Vk L6 框架序列(SEQ ID NO: 72)和MVk L15 框架序歹Ij (SEQ ID NO: 74)類似。Vh CDR1、CDR2 和 CDR3 序列及 Vk CDR1、CDR2和CDR3序列可以嫁接到框架區(qū)上，其具有與衍生該框架序列的種系免疫球蛋白基因中所發(fā)現(xiàn)的序列相同的序列，或者CDR序列可以嫁接到與種系序列相比包含一處或多處突變的框架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些情況中在框架區(qū)中突變殘基對(duì)于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有益的(參見例如Queen等人的美國專利Nos. 5，530，101; 5，585，089; 5，693，762 和 6，180，370)。另一類可變區(qū)修飾是突變Vh和/或Vk⑶R1、⑶R2和/或⑶R3區(qū)中的氨基酸殘基以改進(jìn)目的抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)。可以通過定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變來導(dǎo)入突變，對(duì)抗體結(jié)合或其它感興趣的功能特性的影響可以通過本文所述的和實(shí)施例中所提供的體外或體內(nèi)測定法進(jìn)行評(píng)測。優(yōu)選導(dǎo)入(如上所述的)保守修飾。突變可以是氨基酸的取代、添加或缺 失，但是優(yōu)選為取代。此外，CDR區(qū)中殘基變化通常不超過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)。因此，在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的抗ro-1單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)包含(a) Vh CDRl區(qū)，其含有選自SEQ ID NOs: 15、16、17、18、19、20和21或與SEQ ID NOs: 15、16、17、18、19、20和21相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(b)VH CDR2區(qū)，其含有選自SEQ IDN0s:22、23、24、25、26、27 和 28 或與 SEQ ID NOs:22、23、24、25、26、27 和 28 相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(c)Vh CDR3區(qū)，其含有選自 SEQ ID N0s:29、30、31、32、33、34 和 35 或與 SEQ ID N0s:29、30、31、32、33、34和35相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(d)VK CDRl 區(qū)，其含有選自 SEQ ID NOs:36、37、38、39、40、41 和 42 或與 SEQ IDN0s:36、37、38、39、40、41和42相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(e)VKCDR2區(qū)，其含有選自SEQ ID NOs: 43、44、45、46、47、48和49或與SEQ IDNOs:43、44、45、46、47、48和49相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列；(f)Vk CDR3區(qū)，其含有選自SEQ IDN0s:50、51、52、53、54、55 和 56 或與 SEQ ID N0s:50、51、52、53、54、55 和 56 相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列。本發(fā)明的工程改造的抗體包括那些Vh和/或Vk中框架殘基進(jìn)行了修飾以例如改進(jìn)抗體特性的抗體。通常進(jìn)行此類框架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是“回復(fù)突變(backmutate)” 一個(gè)或多個(gè)框架殘基為相應(yīng)的種系序列。更具體的說，發(fā)生體細(xì)胞突變的抗體可以含有與衍生該抗體的種系序列不同的框架殘基?？梢酝ㄟ^比較抗體框架序列和衍生該抗體的種系序列來鑒定此類殘基。例如，下文表I顯示了抗PD-1抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的框架區(qū)
中與重鏈親本種系序列不同的氨基酸改變的數(shù)目。為使框架區(qū)序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基回歸它們的種系構(gòu)造，可以通過例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變將體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”為種系序列。氨基酸改變可以發(fā)生在抗ro-1抗體中與輕鏈親本種系序列不同的框架區(qū)中。例如，對(duì)于17D8，VK的氨基酸殘基#47 (FR2中)是異亮氨酸，但是相應(yīng)的Vk L6種系序列中該殘基為亮氨酸。為使框架區(qū)序列回歸它們的種系構(gòu)造，可以通過例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變將體細(xì)胞突變“回復(fù)突變”為種系序列(例如18D7的Vk的殘基#47 (FR2的殘基#13)可以從異亮氨酸“回復(fù)突變”為亮氨酸)。作為另一實(shí)例，對(duì)于4A11，VK的氨基酸殘基#20 (FRl中)是絲氨酸，但是相應(yīng)的VkL15種系序列中該殘基為蘇氨酸。為使框架區(qū)序列回歸它們的種系構(gòu)造，例如，4A11的VdA殘基#20可以從絲氨酸“回復(fù)突變”為蘇氨酸。此類“回復(fù)突變”抗體也意圖涵蓋在本發(fā)明的范圍中。17D8、2D3、4H1、5C4和7D3的Vh區(qū)與親本種系VH3_33序列的比對(duì)結(jié)果如圖8所示。4A11和5F4的Vh區(qū)與親本種系VH4_39序列的比對(duì)結(jié)果如圖11所示。表1.重鏈種系構(gòu)造向抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的突變
權(quán)利要求
1.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 a)包含選自SEQID N0:15、16、17、18、19、20和21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDRl ； b)包含選自SEQID N0:22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2 ； c)包含選自SEQID NO:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3 ； d)包含選自SEQID N0:36、37、38、39、40、41和42的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl ； e)包含選自SEQID NO:43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2 ；和 f)包含選自SEQID N0:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3 ； 其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。
2.分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含 a)包含選自SEQID NO:l、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);和 b)包含選自SEQID N0:8、9、10、ll、12、13和14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū); 其中所述抗體與ro-1特異性結(jié)合。
3.組合物，其包含權(quán)利要求1或2的抗體或其抗原結(jié)合部分，及藥學(xué)可接受的載體。
4.分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1或2的抗體或其抗原結(jié)合部分。
5.包含權(quán)利要求4的核酸分子的表達(dá)載體。
6.包含權(quán)利要求5的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.制備抗ro-1抗體的方法，其包括 (a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQID N0:15、16、17、18、19、20和`21 的 CDRl 序列，選自 SEQ ID NO: 22、23、24、25、26、27 和 `28 的 CDR2 序列，和選自 SEQ IDN0:29、30、31、32、33、34和35的CDR3序列；或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQID N0:36、37、38、39、40、41 和 42 的 CDRl 序列，選自 SEQID NO:43、44、45、46、47、48 和 49 的CDR2 序列，和選自 SEQ IDNO: 50、51、52、53、54、55 和 56 的 CDR3 序列； (b)改變至少一個(gè)可變區(qū)抗體序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，以創(chuàng)造至少一個(gè)經(jīng)改變的抗體序列；和 (C)將經(jīng)改變的抗體序列表達(dá)成蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及程序性死亡-1(PD-1)的人單克隆抗體及單獨(dú)使用或與其它免疫治療劑聯(lián)合使用抗PD-1抗體來治療癌癥的方法。本發(fā)明提供了以高親和力與PD-1特異性結(jié)合的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。還提供了編碼本發(fā)明抗體的核酸分子、用于表達(dá)本發(fā)明抗體的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和方法。還提供了包含本發(fā)明抗體的免疫偶聯(lián)物、雙特異性分子和藥用組合物。本發(fā)明還提供了使用抗PD-1抗體來檢測PD-1的方法，以及治療各種疾病，包括癌癥和傳染病的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用聯(lián)合免疫療法，諸如抗CTLA-4抗體和抗PD-1抗體的組合來治療過度增殖性疾病，諸如癌癥的方法。本發(fā)明還提供了改變與單獨(dú)使用此類抗體進(jìn)行的治療有關(guān)的不良事件的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK103059138SQ20121055488
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2006年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
發(fā)明者艾倫.J.科曼, 莫漢.斯里尼瓦森, 王常玉, 馬克.J.塞爾比, 陳炳良, 約瑟芬.M.卡達(dá)雷里, 黃海春 申請(qǐng)人:小野藥品工業(yè)株式會(huì)社, 梅達(dá)雷克斯股份有限公司