專利名稱：：羥基脂肪酸衍生物作為燃料添加劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物燃料領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及羥基脂肪酸低級烷基酯和/或羥基脂肪酸鹽作為生物燃料和/或燃料添加劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：能源是人類活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前人類正面臨化石燃料能源資源枯竭的問題，而且由化石燃料帶來的環(huán)境污染嚴重。今天，幾乎所有的工業(yè)國家都面臨著能源供應(yīng)的危機。可再生能源是清潔能源，是指在自然界中可以不斷再生、永續(xù)利用的資源。其中比較引人注目的是生物柴油和燃料乙醇。生物柴油是由動植物油脂與短鏈醇經(jīng)過酯交換反應(yīng)得到的各種脂肪酸單酯的混合液體燃料，可在內(nèi)燃機中直接使用。燃料乙醇是燃燒清潔的高辛烷值燃料，可由再生能源生產(chǎn)。但是大規(guī)模生產(chǎn)生物燃料可能需要大片的土地，而且擴大乙醇等生物燃料的生產(chǎn)還會對糧價產(chǎn)生影響。因此，新型能源的開發(fā)是一項迫在眉睫的任務(wù)。聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是微生物在生長不平衡的環(huán)境下積累的能源和碳源貯藏物(Doi&Steinbtichel,2002)。組成PHA的單體多種多樣，截至目前，已發(fā)現(xiàn)組成PHA的單體有100多種(Doi&Steinbiichd,2002)。3-羥基丁酸(3HB)是組成PHA的最常見的單體。典型地，PHA可以用以下通式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中n-l、2、3或4;通常n-l,即為聚-3-羥基脂肪酸酯。m表示聚合度，決定分子量的大小。R是可變基團，可為飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈及取代基的烷基。當"R-"基團為短于三個碳原子的取代基(即CH3-或CH3CH2-)時，PHA稱為短鏈PHA(ShortChainLengthPHA,簡稱sclPHA)。具體地，當"R-"基團為CEb-時，PHA稱為"聚-3-羥基丁酸酯(Poly-3勿droxybutyrate簡稱PHB)";當"R-，，基團為CH3CH^，這種PHA稱為"聚-3-羥基戊酸酯(Poly國3畫hydroxyvalerate簡稱PHV)"。3-羥基丁酸和3-羥基戊酸聚合，可以形成聚-3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate簡稱PHBV)。短鏈PHA的常見例子是PHB和PHBV。當"R-"基團為包含3個或3個以上碳原子的取代基時，可稱為中長鏈。在硫酸催化的醇解作用下，PHA中的酯鍵會斷裂，形成一個一個的單體。但是，當加入曱醇或乙醇進行醇解的時候，PHA降解生成的羥基脂肪酸(HA)單體中的羧基(-COOH)會和曱醇或乙醇的羥基(-OH)反應(yīng)，生成相應(yīng)的3-羥基脂肪酸曱酯或3-羥基脂肪酸乙酯(例如3-羥基丁酸曱酯或3-羥基丁酸乙酯；中長鏈羥基脂肪酸曱酯或中長鏈羥基脂肪酸乙酯)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面提供了式(I)化合物作為燃料的用途，。R,R2(I)其中，m為0-3的整數(shù)；R!選自C廣C5的烷基；112選自H和C廣C]7的烷基。優(yōu)選地，R^為d、C2或C3的烷基。優(yōu)選地，112選自d-C9的烷基；更優(yōu)選地，R2為d、C2或C3的烷基。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，式(I)化合物選自由以下成員構(gòu)成的組3-羥基丁酸曱酯；3-羥基丁酸乙酯；4-羥基丁酸曱酯；63-羥基戊酸曱酯；3-羥基戊酸乙酯；3-羥基己酸曱酯；3-羥基己酸乙酯；乳酸曱酯；乳酸乙酯。本發(fā)明另一方面提供了式(I)化合物作為燃料添加劑的用途，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)其中，m為0-3的整數(shù)；R!選自d-C5的烷基和堿金屬離子；R2選自H和d-Cn的烷基。本發(fā)明再一方面提供了一種燃料組合物，包含至少一種燃料；以及式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)其中，m為0-3的整數(shù)；R^選自d-C5的烷基和堿金屬離子；R2選自H和C-Cn的烷基。優(yōu)選地，Ri選自d、C2、C3的烷基和Na+。優(yōu)選地，112選自d-C9的烷基；更優(yōu)選地，R2為d、C2或C3的烷基。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，式(I)化合物選自由以下成員構(gòu)成的組3-羥基丁酸曱酯；3-羥基丁酸乙酯；4-羥基丁酸甲酯；3-羥基戊酸曱酯；3-羥基戊酸乙酯；3-羥基己酸甲酯；3-羥基己酸乙酯；3-羥基丁酸鈉；乳酸甲酯；乳酸乙酯。優(yōu)選地，所述燃料選自醇類燃料、汽油、柴油。具體地，所述醇類燃津+選自乙醇、正丙醇、正丁醇?？梢岳斫?，本發(fā)明的燃料、燃料添加劑或燃料組合物中可以同時包含多種式(I)化合物。例如，在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方式中，mclHA曱酯中包含3-羥基己酸、3-羥基辛酸、3-羥基癸酸、3-羥基十二酸等的甲基酯。由于制備方便，本發(fā)明羥基脂肪酸的曱酯或乙酯是特別優(yōu)選的。本發(fā)明提供的輕基脂肪酸衍生物作為燃料直接使用時，具有高燃燒熱、零污染物排放等優(yōu)點。當本發(fā)明的羥基脂肪酸衍生物作為燃料添加劑與其他燃料混合使用時，可以改善其燃燒熱值和抗爆性能等。圖la-圖lc顯示了在表1所示FermentationA-C條件下，發(fā)酵時間vs營養(yǎng)元素vs發(fā)酵相關(guān)參數(shù)。圖2顯示了PHB&NMR結(jié)構(gòu)圖。圖3顯示了雷諾作圖法校正圖。具體實施例方式本文所用的術(shù)語"烷基"是指帶有給定數(shù)量的碳原子的支鏈和直鏈的飽和脂族烴基。例如，"CrC9的烷基"定義為直鏈或支鏈的帶有1、2、3、4、5、6、7、8或9個碳的飽和脂族爛基基團。例如，"d-C9的烷基，，特別包括曱基、乙基、正-丙基、異-丙基、正-丁基、叔-丁基、異-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。本文所用的術(shù)語"低級烷基"是指碳原子數(shù)不超過5個的烷基。本發(fā)明中特別優(yōu)選的"低級烷基"包括曱基和乙基。本文所用的術(shù)語"堿金屬離子"指的元素周期表中第一主族的金屬離子，包括但不限于Na+、K+、Li+等。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"羥基脂肪酸，，(Hydroxyalkanoicacid或HA)與"HA"可以互換使用。羥基脂肪酸衍生物的實例包括但不限于3-羥基丁酸(3-hydroxybutyricacid或3HB)甲酯、4-羥基丁酸(4-hydroxybutyricacid或4HB)甲酯、3-羥基丁酸(3HB)乙酯、3-羥基己酸(3-hydroxyhexanoicacid或3HHx)曱酯、3-羥基己酸(3HHx)乙酯、3-羥基己酸(3HHx)等。本文所用的術(shù)語"mclPHA"或"中長鏈PHA"是指一種特定的中長鏈PHA聚合物，包含多種HA單體，其制備方法和組成如實施例2所述。"mclHA曱酯"是指由mclPHA進行醇解反應(yīng)所獲得的各種單體的曱酯的混合物，其組成如表4所述。采用PHA來獲得本發(fā)明的羥基脂肪酸衍生物有許多優(yōu)點。例如，PHA生產(chǎn)者非常廣泛，自然界的各種環(huán)境中的許多微生物都有合成PHA的能力。生產(chǎn)底物來源非常廣泛，PHA的合成底物可以包括大部分的有機物。目前已經(jīng)商業(yè)化的聚3-羥基丁酸酯(PHB),3-羥基丁酸和3-羥基戊酸的共聚物(PHBV),3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)等PHA的底物來源就可以來自于廉價的淀粉或椋櫚油等。對PHB合成代謝途徑的研究表明，PHB合成路徑是廣泛存在于許多細菌中的，而且PHB可以在活性污泥中的多種菌中，利用廢水中的有機污染物為碳源合成。發(fā)酵生產(chǎn)條件要求簡單。目前常規(guī)的抗生素發(fā)酵，酒精發(fā)酵，乳酸發(fā)酵等設(shè)備不需改造或只需稍加改造就可以直接用于PHA的發(fā)酵生產(chǎn)。更具有竟爭力的發(fā)酵方式是處理污水的設(shè)備。目前的各種處理污水的設(shè)備最后都得到大量的活性污泥，這些活性污泥的主要成分事實上都是微生物特別是細菌菌體，可以直接生產(chǎn)PHB,活性污泥中的各種菌種無需處理或稍加改造就可以直接利用污水中的有機污染物來進行PHB的生產(chǎn)。我國每年廢水處理產(chǎn)生的活性污泥有幾千萬噸，大部分被填埋、焚燒或用于沼氣的發(fā)酵生產(chǎn)。利用活性污泥得到燃料是一個很好的雙贏的解決方法。本發(fā)明的以微生物合成的PHA作為來源的各種羥基脂肪酸低級烷基酯作為燃料可以豐富目前的生物燃料領(lǐng)域，同時具有良好的社會和經(jīng)濟效益。這些羥基脂肪酸低級烷基酯(例如曱酯或乙酯)作為燃料具有合適的燃燒熱、零污染物排放、可以和通用燃料例如汽油等混合使用、同時可以改善汽油等燃料的燃燒、提高其辛烷值等效果。本發(fā)明的作為燃料使用的羥基脂肪酸低級烷基酯具體包括但不限于3-羥基丁酸甲酯、4-羥基丁酸甲酯、3-羥基丁酸乙酯、3-羥基丁酸甲酯或乙酯和3-輕基戊酸曱酯或乙酯的各種摩爾比例的混合物、3-羥基丁酸曱酯或乙酯和3-羥基己酸甲酯或乙酯的各種摩爾比例的混合物、3-羥基中長鏈脂肪酸甲酯或乙酯的混合物、3-羥基丁酸甲酯或乙酯和4-羥基丁酸甲酯或乙酯的各種摩爾比例的混合物、3-羥基丙酸曱酯或乙酯、2-羥基丙酸曱酯或乙酯等。本發(fā)明的羥基脂肪酸酯可以與汽油等燃料混合。根據(jù)已有的許多研究表明，各種生物質(zhì)例如秸稈等直接燃燒的熱效率是很低的，只有10%左右，80%~90%的能量都浪費了，而將它們轉(zhuǎn)換為氣體或液體燃料例如曱烷、乙醇等，其熱效率可以提高到30%~40%以上。把固態(tài)、松散的聚羥基脂肪酸轉(zhuǎn)換成液態(tài)的羥基脂肪酸酯，對其燃燒效率的提高也是有正面效果的。燃料含碳量特別是CH2的含量對燃料的燃燒熱值具有較大的影響，燃料含碳量升高，燃燒熱值表現(xiàn)出上升的趨勢。生物乙醇由于具有較低的含碳量，其燃燒熱值為27.3KJ/g，但是在能源缺乏的情況下，乙醇可以代替汽油作為燃料。另夕卜，人們在研究乙醇/汽油混合燃料中發(fā)現(xiàn)，由于乙醇分子中氧含量高，和汽油混合后，可以提高汽油的抗爆性能，從而有可能取代傳統(tǒng)的含鉛抗爆劑，避免了傳統(tǒng)抗爆劑的毒害性。對比于燃料乙醇，羥基脂肪酸酯由于本身所帶的羥基(-OH)和酯化反應(yīng)引入的酯鍵使羥基脂肪酸酯的含氧量得以提高，從而可以更好提高汽油的抗爆性能。經(jīng)過燃燒熱測定得到數(shù)據(jù)3HB甲酯燃燒熱19.43KJ/g;MediumChainLengthPHA(MCLPHA曱酯)的燃燒熱36.5KJ/g;酒精燃燒熱27.32KJ/g;0#柴油(0#柴油的生產(chǎn)商家為中國石化廣東分公司，銷售廠家為汕頭市魚它浦加油站)燃燒熱54.6KJ/g;90#汽油燃燒熱52.4KJ/g。3HB曱酯酒精燃燒熱32.88KJ/g;3HB曱酯90#汽油燃燒熱46.25KJ/g;3HB甲酯0#柴油燃燒熱49.15KJ/g(其中3HB甲酉旨酒精=1:9;3HB曱酯柴油=1:9;3HB甲酉旨汽油=1:9)。3HB甲酯的燃燒熱值比酒精的燃燒熱值稍低。將3HB曱酯和其他燃料混合發(fā)現(xiàn)3HB曱酯的加入竟然可以提高酒精的燃燒熱值，3HB曱酯的加入沒有提高0#柴油或90#汽油的燃燒熱值。相比于純的0#柴油(54.6)和90#汽油(52.4)的燃燒熱值，混合燃料的燃燒熱值分別為46.2KJ/g和49.1KJ/g左右，仍能維持一個比較高的數(shù)值。從燃料的使用角度來看，3HA曱酯可以作為燃料或添加到傳統(tǒng)燃料中進行使用。本發(fā)明的羥基脂肪酸酯也可以直接作為燃料。隨著發(fā)酵和提取等工藝的改進，目前已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的聚-3-羥基丁酸脂肪酸酯(PHB)的生產(chǎn)成本越來越低，這為3-羥基丁酸甲酯或乙酯直接作為燃料提供了可能。3-羥基丁酸甲酯或乙酯同樣具有高燃燒熱、零污染物排放等優(yōu)點。以3-羥基丁酸曱酯或乙酯直接作為燃料用于燃燒，直接觀察表現(xiàn)為可以替代酒精燈中的酒精，表現(xiàn)出和酒精相似的性能，例如有高的著火點，外焰為純藍色火焰內(nèi)焰為黃色火焰等。除了直接燃燒外，羥基脂肪酸酯例如3-羥基丁酸曱酯或乙酯用作燃料可以首先考慮作為汽車燃料使用。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，可以利用活性污泥生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)。主要利用已有的活性污泥處理工藝來生產(chǎn)PHA。已有的活性污泥處理工藝主要有以下三種(a)常規(guī)的活性污泥處理過程；(b)硝化-反硝化活性污泥處理過程；(c)厭氧-需氧活性污泥處理過程。在一般情況下，首先選用厭氧-需氧活性污泥處理過程來進行PHA的生產(chǎn)。因為在厭氧-需氧活性污泥處理過程中，不用經(jīng)過任何工藝的改造和添加任何的外加營養(yǎng)物，根據(jù)污染物中的有機物含量和通氣量的控制等因素的調(diào)節(jié)，其活性污泥中的微生物就可以合成15%-33y。的PHA,這為PHA的低成本生產(chǎn)提供了比較好的可能。另外一種方法是對常見的這三種活性污泥處理過程的菌群進行基因工程的改造?；蚬こ谈脑旆椒ㄖ饕且獦?gòu)建一個安全、穩(wěn)定、高效和具有廣譜宿主能力的質(zhì)粒，從而使經(jīng)過基因工程改造后的活性污泥中的微生物合成的PHA的絕對數(shù)量得到提高。PHA的提取主要是利用有機溶劑提取法，有機溶劑首選以酯類溶劑例如醋酸乙酯、醋酸丁酯等。酯類溶劑的好處是酯類溶劑具有比較低的價格、和PHA具有良好的混溶性、無毒、可以和羥基脂肪酸曱酯或乙酯同時混合作為一種燃料。經(jīng)過簡單的分離和純化后，溶液狀態(tài)的PHA可以直接與氬氧化鈉或石危酸、曱醇或乙醇直接進4亍醇解反應(yīng)制得羥基脂肪酸曱酯或乙酯并同時和提取溶劑醋酸乙酯或醋酸丁酯等作為燃料使用。實施例實施例1利用活性污泥生產(chǎn)PHA在實驗室利用小型的設(shè)備進行活性污泥生產(chǎn)PHA的模擬。參照已有的利用厭氧-需氧活性污泥(EBPR)生產(chǎn)PHA的研究(Iwamoto等，尸rac.五"wVo".i^s31(1994)305-314;Satoh等，Pfafer.ScJec/wo/38(1998)103-109;Satoh等，/W.乂A》/.A/"crawo/.25(1999)105-109;岳春等，水處理技術(shù)，30(2004);陳然等，農(nóng)業(yè)環(huán)境保護，20(2003)424-428)。本實施例中采用的實驗裝置是序批式反應(yīng)器(SRS)(可參見《農(nóng)業(yè)環(huán)境保護》2001年第五期329-332頁中的描述)。由高位槽、儲水槽、泵、電;茲閥、LOGO時間控制器及曝氣裝置組成。高位槽的定量容積為2L，SBR溶劑約5L。采用外加乙酸的碳源的方法。以乙酸為底物配置COD為1000mg/L左右的人工廢水，配制廢水時考慮到均衡營養(yǎng)的需要按5mg/L加入氯化銨、磷酸二氫鉀、七水疏酸鎂、磷酸氫二鉀和氯化鈣作為營養(yǎng)物(以上的化學試劑均為北京化工廠產(chǎn)品，均為分析純)。pH值保持在6.8-7.1。而實驗用的污泥主要是采集于厭氧-需氧活性污泥處理過程中(EBPR)的活性污泥(見文獻陳然等，農(nóng)業(yè)環(huán)境保護，20(2003)424-428)。采集過來的活性污泥(來自于廣州四明燕塘乳業(yè)公司污水處理站)先過濾、生理鹽水洗滌并曝氣4h以降解其懸浮物質(zhì)或膠體物質(zhì)后放入反應(yīng)器中。實驗的每一周期為8h,—天運轉(zhuǎn)三個周期。每一個周期安排如下進水2分鐘，曝氣240分鐘，沉淀180分鐘，排上清液30分鐘。整個時間控制由LOGO時間控制器控制，反應(yīng)器中污泥濃度維持在1800-400mg/L左右，pH維持在6.8~7.l左右。污泥先培養(yǎng)馴化三周以上，待COD去除率在85y。以上，即污泥適應(yīng)了單一底物環(huán)境且菌種相對較為單一后，取水樣、泥樣進行分析。觀察廢水的COD降解情況。接下來還要看乙酸濃度對PHB的形成的影響。實驗開始乙酸濃度為0.26mg/L,三周以后，即23天做COD降解以及PHB的生成曲線。第28天后改配置使乙酸濃度增加為0.42mg/L,再馴化三周后于51天再做COD降解以及PHB的生成曲線，將兩次結(jié)果作對比以考察乙酸濃度的變化對PHB的形成的影響。PHB的定性方法主要是采用蘇丹黑染色法和核磁共振分析法(圖2),而定量方法主要是利用氣相色譜法，結(jié)果分析表明PHB的胞內(nèi)含量可以達到35。/。(w/w)左右(具體方法可見文獻Luo等，JournalofAppliedPolymerScience2007105:3402-3408;Ouyang等Biomac匪olecules20078:2504-2511)。實施例2PHA的提取以及羥基脂肪酸曱酯或乙酯的制備利用有機溶劑提取法對活性污泥中的PHA進行提取。參照相關(guān)的有機溶劑提取法提取純化PHA的研究(Chen等，^7/.Mcr^o/.S她cW，57(2001)50-55;陳國強等，中國發(fā)明專利，CN1844185,2006-04-13;陳國強等，中國發(fā)明專利，申請?zhí)?2130725.3)?；钚晕勰嗵幚砦鬯螅瑢⑴c經(jīng)過處理的干凈的水自動分離，沉淀下來的活性污泥進入傳統(tǒng)的焚燒設(shè)備進行干燥后，按1:5-1:7(活性污泥有機溶劑)的比例加入醋酸乙酯或醋酸丁酯(北京化學試劑廠分析純)。90°C~100。C加熱回流攪拌3050min后，PHA將溶解到醋酸乙酯或醋酸丁酯中以稀PHA溶液的形式存在。經(jīng)過靜止放置后，固液將自動分離，取出相應(yīng)的液體，并加入曱醇或乙醇，此時的PHA會以絮狀或塊狀沉淀出來，利用有機溶劑提取的方法可以使PHA的收率達到氣相色譜(美國安捷倫公司)方法計算的理論胞內(nèi)含量95%(w/w)以上。以氬氧化鈉或濃^J臾作為催化劑，在90~100。C加熱回流的情況下進行相應(yīng)的醇解反應(yīng)。所得的醇解液可以直接作為燃料用于燃燒等。同時，如有必要，也可以進行一定的純化得到純度更高的羥基脂肪酸曱酯或乙酯。實施例3以嗜水氣單胞菌4Ak4(JeromowoyM^TOp/n/a4AK4)為生產(chǎn)者利用月桂酸或其他有機物碳源發(fā)酵生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸-3-羥基己酸(PHBHHx)實驗條件參照文獻Chen等ApplMicrobiolBiotechnol200157:50-55。PHBHHX的發(fā)酵采用分批發(fā)酵培養(yǎng)的方法。于LB培養(yǎng)基中制備種子，種子培養(yǎng)液再轉(zhuǎn)移到裝有400毫升LB培養(yǎng)基的1000毫升帶擋板搖瓶中3(TC培養(yǎng)12個小時。種子液轉(zhuǎn)移到裝有2000升葡萄糖/酵母提取物培養(yǎng)基的4000升發(fā)酵罐中。發(fā)酵條件如下攪拌速度250rpm,通氣量20000L/h,培養(yǎng)溫度30。C，發(fā)酵時間12小時(使細胞長至指數(shù)生長期)。其中1升的葡萄糖/酵母提取物培養(yǎng)液中包括如下成分16g葡萄糖，1.5g磷酸二氫鉀，lg硫酸銨，4.5g磷酸氬二鈉，0.2g七水碌u酸鎂，0.05g二水氯化4丐，0.5g酵母提取液和1毫升的微量元素溶、液(孩i:量元素酉己方可見:Ki等，Jwtomevaw丄eewwew/zoeA:78(2000)43-49)。處于指數(shù)生長期的2000L種子培養(yǎng)液無菌轉(zhuǎn)移至帶有10000升生長培養(yǎng)基的20000升發(fā)酵罐中。生長培養(yǎng)基的成分可見表1。通過對A/^^o^/zz7a4AK4進行元素分析，計算初始投料的銨鹽和磷酸鹽的濃度，從而確定后續(xù)的營養(yǎng)限制。整個發(fā)酵過程主要分為兩個階段第一階段是菌體的生長階段，此階段中，以葡萄糖作為碳源，無需進行營養(yǎng)因子的限制；第二階段是PHBHHx的積累階段，此階段以月桂酸作為碳源，并限制氮或磷，促進產(chǎn)物的積累。當葡萄糖的濃度下降至10g/L(表中的FermentationA和B)或20g/L(表中的FermentationC)的時候，溶解于50。C熱水中的月桂酸(濃度為400g/L)通過無菌操作，利用壓縮空氣加入到20000L的發(fā)酵罐中。在菌體的生長階段，保持發(fā)酵的轉(zhuǎn)速為120rpm,通氣量為200000L/h，pH為7.0,在PHBHHx的積累階段，使通氣量下降為100000L/h,pH為6.5。pH的調(diào)節(jié)通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20%(w/v)的氪氧化鈉來實現(xiàn)。發(fā)酵結(jié)果如圖1所示。最終發(fā)酵結(jié)果表明，發(fā)酵46個小時以后，細胞濃度，PHBHHx濃度和PHBHHx的胞內(nèi)含量分別為50g/L、25g/L和50%(w/w)。PHBHHx分析和提取步驟與實施例1、2相類似，可以根據(jù)工廠的設(shè)備進行適當?shù)母脑臁嵤├?多菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)PHA參照張圓等，微生物學報43(2003)進行微生物混合培養(yǎng)用于生產(chǎn)PHA。考慮到對多種活性污泥處理過程如硝化-反硝化活性污泥處理過程，厭氧-需氧活性污泥處理過程等的廣譜適用性，實^r室才莫擬采取了這些活性污泥處理過程中的常見菌群混合培養(yǎng)發(fā)酵研究的方法。主要的細菌包括圓褐固氮菌(Jzc^o6""wc/zraococcwm)突變林G-3、巨大芽孢桿菌(^C/〃M膨g她"'謂)、食酸叢毛單月包菌(Comamo"ayac/(iovora"5)禾口惡、臭，i單月包菌(尸sew(io附o/7(Xs/w/7't/a)等。、液體培養(yǎng)基的主要成分為每升含蔗糖20g、磷酸氫二鉀0.8g、磷酸二氫鉀0.2g、七水硫酸鎂0.2g、碳酸4丐0.5g、七水氯化鐵0.125g、蛋白胨lg、微量元素lml(微量元素配方和實施例3中的相同)。培養(yǎng)條件如下所述首先利用搖床培養(yǎng)，250ml三角瓶裝培養(yǎng)液3040ml，30°C,220rpm培養(yǎng)。發(fā)酵罐培養(yǎng)利用美國NBS全自動發(fā)酵罐，溫度30。C自控，pH6.9~7.2,石咸液間歇調(diào)控，初始攪拌速度和通氣量分別為600rpm和1:1,初始裝液量1.2L，接種量10%，采用間歇補料方法進行培養(yǎng)。菌種加入的順序為圓褐固氮菌和惡臭假單胞菌，先加入進行培養(yǎng)22~28小時后，再以10%的接種量接入巨大芽孢桿菌和食酸叢毛單胞菌，并同時補加0.5%(w/v)的蛋白胨和0.5%(w/v)的硝酸銨，繼續(xù)培養(yǎng)42~46小時。培養(yǎng)期間每隔一定時間測定罐內(nèi)蔗糖濃度，當罐內(nèi)蔗糖濃度降至0.3%~0.5%(w/v)左右，開啟自動補料泵，用30%(w/v)蔗糖溶液補糖，使罐內(nèi)的蔗糖濃度保持在2%(w/v)左右。最終發(fā)酵結(jié)果分析表明，細菌混合培養(yǎng)66~74小時后，細胞干重可以達到32g/L,PHA的含量可以達到75%(w/w),而糖對PHA的轉(zhuǎn)化率為0.32。實施例53HA曱酯的制備及其燃燒熱的測定3HB甲酯的制備可參見文獻(Roo等，BiotechnologyandBioengineering20026.717-722;Lee等,BiotechnologyandBioengineering199965.363-368)。具體如下15g的PHB首先溶解在200ml的氯仿中。PHB溶解后，再加上等體積的石克酸/曱醇溶液(石危酸/曱醇溶液的配比為15體積的硫酸配85體積的曱醇)。這些混合溶液在10(TC下回流48個小時?；亓?8小時后，冷至室溫并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入40ml的飽和氯化鈉溶液，劇烈震蕩10分鐘，靜置，可見有機相和水相分層，取下層有機相，并用去離子水洗滌有機相幾次。有機相轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除其中的氯仿，最后得到的粘稠液體為3HB曱酯。其他的3HA曱酯的制備利用同樣的方法制得(以上的試劑均來自于汕頭西隴化工廠，均為分析純)。3HA曱酯的燃燒熱測定實驗是利用南京南大萬和科技有限公司的最新產(chǎn)品BH-IIIS燃燒熱測定儀測定的。利用已知燃燒熱的苯曱酸標定得到儀器的熱容為15.6KjrC。此儀器測定的物質(zhì)燃燒熱是恒容燃燒熱用符號Qvs表示。物質(zhì)的恒容燃燒熱的計算公式為CAt=msQvs-1.4mh(C為儀器的熱容，At為溫差，ms為樣品的質(zhì)量，Qvs為待測樣品的恒容燃燒熱，mh為燒掉的鎳鉻絲的質(zhì)量)。其中的At需要經(jīng)過雷諾作圖法(見圖3)進行校正。圖3為在燃燒熱測定儀測定得到的溫差變化圖。由于燃燒熱測定儀的絕熱性能不能完全避免系統(tǒng)和環(huán)境之間的熱交換，因此，對于物質(zhì)燃燒測定的溫度-時間曲線需要進行校正才能獲得正確的結(jié)果。溫度-時間曲線的含義如下ab為基線，表示燃燒反應(yīng)發(fā)生之前，量熱計中介質(zhì)水的溫度。當ab為平行于時間軸的直線或為斜率恒定的斜線時，表明量熱計的溫度已經(jīng)穩(wěn)定。bc表示燃燒反應(yīng)發(fā)生后量熱計中介質(zhì)水的溫度變化情況。從b點起，燃燒反應(yīng)放出大量的熱，使水溫在短時間內(nèi)迅速上升，直到曲線出現(xiàn)轉(zhuǎn)折到達c點為止。cd段表示系統(tǒng)溫度經(jīng)過迅速上升后再次趨于平穩(wěn)。按照雷諾作圖法從溫度-時間曲線量取峰高可獲得正確的結(jié)果。過圖中的c點和b點分別做平行于時間軸的直線交溫度軸于Tl和T2點。過Tl-c和T2-b直線作垂直于溫度軸的直線AB并交b-c曲線于中點O。沿c-d和a-b作反向的延長線并交AB于E點和F點，則EF兩點的距離即為公式中的溫差變化At。物質(zhì)恒容燃燒熱的測定方法和步驟概述如下(一)首先用已知燃燒熱的苯甲酸標定儀器的熱容。(a)稱取0.8~lg的苯曱酸，于紅外壓片機中壓制成片。用風筒吹走苯曱酸片的未成型粉末，再稱一次苯曱酸片的重量，記錄起來。(b)擰開氧彈蓋，把預先稱量過的鎳鉻絲中間彎成環(huán)狀后小心牢固地纏在氧彈的兩根電極上，再將樣品放入氧彈的燃燒皿內(nèi)，并利用鎳鉻絲的彈性使鎳鉻絲與樣品貼緊(注意鎳鉻絲不能碰到燃燒皿)，然后用萬用表檢查是否通路，如果通路，旋緊氧彈蓋再次檢查通路情況(c)按照氧彈的充氣要求給氧彈充上1~1.2MPa的氧氣。(d)用萬用表再次檢查兩電極是否通路。若通路，將氧彈放入燃燒熱測定儀中，再在放置氧彈的內(nèi)筒里準確倒入3L自來水，開啟攪拌開關(guān)，觀察溫度變化，當溫度基線和橫坐標的時間曲線平行或其切線為直線的時候，開始點火，點火后可見溫度急劇上升，最后趨于平穩(wěn)直至和橫坐標平行，根據(jù)經(jīng)驗一般設(shè)置時間極限為35分鐘。(二)3HA甲酯和其他燃料的燃燒熱測定。總體步驟和上述苯曱酸的燃燒熱的測定相似，不同的地方主要是3HA曱酯為液體樣品。因為3HA甲酯的沸點比較高，單純測3HA曱酯時，可以把樣品直接加到燃燒皿中。而對于沸點較低易揮發(fā)的樣品可以把這些樣品裝在已知燃燒熱的小塑料袋中檢測。測試結(jié)果見表2。本實施例中采用的mclPHA是由清華大學歐陽少平博士構(gòu)建的惡臭假單胞菌KTOY06,利用月桂酸(十二酸)為碳源生產(chǎn)出來的，組成成分如表4所述。具體的生產(chǎn)過程見參考文獻OuyangSP,LuoRC,ChenSS,LiuQ,ChungA,WuQ,ChenGQ(2007a)Productionofpolyhydroxyalkanoateswithhigh3勿droxydodecanoatemonomercontentby/"<iSandy^t(5L4knockoutmutantof尸sewdomo/os/z^/<iaKT2442.Biomacromolecules8:2504-2511;以及LiuWK,ChenGQ(2007)Production3-hydroxytetradecanoatemonomercontentbyandy^<i^knockoutmutantof/^ei^fowowas戶f油KT2442.ApplMicrobiolBiotechnol76:1153-1159。mclHA曱酯(mclHAM)的制備方法和3HB甲酯(3HBM)的制備方法是相同的。由此可以看出3HA曱酯中，3HB曱酯的燃燒熱值最低；隨著碳原子數(shù)的增多，燃燒熱值升高，其中MCL曱酯的燃燒熱值為36.5KJ/g左右。3HB曱酯的燃燒熱值比酒精的燃燒熱值稍低。將3HB曱酯和其他燃料混合發(fā)現(xiàn)3HB甲酯的加入可以提高酒精的燃燒熱值。而3HB曱酯的加入沒有提高0#柴油或90#汽油的燃燒熱值，相比于純的0#柴油(54.6KJ/g)和90#汽油(52.4KJ/g)的燃燒熱值，混合燃料的燃燒熱值分別為46.2KJ/g和49.1KJ/g左右，仍能維持一個比較高的數(shù)值。隨著3HB曱酯或者MCL曱酯在混合燃料中比重的增加，混合燃料的燃燒熱并沒有明顯上升或下降的趨勢，而是保持在一個比較平穩(wěn)的水平。和3HB曱酯的現(xiàn)象一樣，在MCL曱酯和酒精的混合燃料中，經(jīng)過MCL曱酯的加入，酒精的燃燒熱也得到了提高，而且提高的幅度普遍都比3HB甲酯的高，具體的原因還未知，可能的一個原因就是3HA酯類和乙醇在燃燒過程中有附加生成的反應(yīng)熱，從而使整體混合燃料的燃燒熱得到提高。跟期望的結(jié)果相反，各個重量比例的MCL曱酯加入到柴油或汽油中，并未使柴油或汽油的燃燒熱值提高，還是沒有純的柴油或汽油的燃燒熱值高。同時，MCL曱酯的效果和3HB甲酯的效果比起來，它們兩者的差別并不大。分析其中的原因可能是，由于MCL曱酯的碳鏈比較長(一般都是8個碳原子以上)，在燃燒過程中，可能出現(xiàn)炭化，燃燒不充分，導致不能完全燃燒，從而不能把真正的燃燒熱能釋放出來。這個問題已經(jīng)經(jīng)過一些改進，例如，減少樣品量、增加助燃棉線等，但好像效果都不明顯?？梢韵胂蟮氖牵谌紵^程中，并不是碳原子數(shù)越多，它所具有的燃燒熱能就會越高，要提高燃料的燃燒熱，除了燃料質(zhì)量本身，是否能使其燃燒充分也應(yīng)該是一個要考慮的問題。當MCL曱酯和汽油或柴油混合燃燒時，由于汽油或柴油特別是柴油往往自身都有燃燒不充分的現(xiàn)象出現(xiàn)，所以本身長碳鏈的MCL甲酯的加入，加劇了不充分燃燒現(xiàn)象的出現(xiàn)，這可能是混合燃料的燃燒熱值沒有得到有效地提高的原因之一。從這些燃燒熱值結(jié)果的分析來看，3HA甲酯作為燃料的價值特別是3HB曱酯作為燃料的價值是比較高的。因為各種重量比例的3HB甲酯或MCL甲酯和燃料混合后的燃燒熱值都相差不大，那么用最少的3HB曱酯或MCL曱酯就可以了；因為MCL曱酯和3HB曱酯的效果相差不大，那么開發(fā)3HB甲酯作為燃料的開發(fā)的潛力就更大了。此外，無論是3HB曱酯還是MCL曱酯，它們和酒精混合后，都可以使酒精的燃燒熱值得到比較大幅度的提高，特別是MCL曱酯，它能更大幅度地提高酒精的燃燒熱值。這是一個新發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，而且另外一個比較振奮人心的結(jié)果就是，少量的3HA甲酯或MCL曱酯就可以使酒精的燃燒熱值得到比較大幅度的提高，從商業(yè)開發(fā)的角度出發(fā)考慮也是比較經(jīng)濟實惠的。在未來可以預計的以酒精等綠色燃料為主要能源燃料的社會，3HA曱酯燃料的開發(fā)以及3HA曱S旨/酒精混合燃料的開發(fā)可能表現(xiàn)出比較大的應(yīng)用潛力，從而為3HA曱酯作為燃料的開發(fā)使用帶來新的契機，同時也促進了乙醇燃料質(zhì)量的提升。此外，3HA由于具有非常容易修飾的-OH和-COOH基團，所以以3HA為基礎(chǔ)可以很方便地誕生出許多具有有趣性能的衍生物來，這些衍生物在作為燃料的綠色生物添加劑方面，可能可以提高燃料的燃燒熱值或提高燃料的燃燒效率等等的性能。為此做了一些驗證性的實驗，主要目的就是為了驗證3HB曱酯、3HB鈉鹽和MCL曱酯能否提高乙醇、正丙醇和正丁醇這三種醇類燃料的燃燒熱值。實施例63-羥基脂肪酸衍生物提高醇類燃料的燃燒熱值實馬全的測試方法以及數(shù)據(jù)處理過程和上述的內(nèi)容是一致的。在這個實施例中，除了3HB曱酯，MCL甲酯外，還研究了另一個3HA的衍生物即3HB鈉鹽。3HB鈉鹽本身是不能燃燒的，希望通過試驗來比較本身能燃燒的3HB曱酯或MCL甲酯加入到醇類燃料中對醇類燃料的燃燒熱值有什么改變，本身不能燃燒的3HB鈉鹽加入到醇類燃料中對醇類燃料燃燒熱值的有什么改變。具體結(jié)果見表3。沒有呈規(guī)律性地提高，而是維持在一個比較平衡的水平。另外還發(fā)現(xiàn)，本身不能燃燒的3HB鈉鹽的加入也可以使乙醇燃料的燃燒熱值得到提高，而且只要非常少量的樣品加入，就可以使乙醇燃料的燃燒熱值維持在34.33KJ/g左右。在提高正丙醇的燃燒熱值的實驗中，純的正丙醇的燃燒熱值為34.32KJ/g。3HB曱酯或MCL甲酯的加入沒有大幅度提高正丙醇的燃燒熱值，但均能使混合燃料的燃燒熱值維持在一個平衡的水平，而且均比純的正丙醇的燃燒熱值要高一些。同時，3HB甲酯的改善效果和MCL甲酯的改善效果沒有明顯的差別。隨著3HB曱酯或MCL曱酯在混合燃料中的比重的增加，混合燃料的燃燒熱值并沒有呈規(guī)律性地提高，而是維持在一個比較平衡的水平。本身不能燃燒的3HB鈉的加入沒有對正丙醇的燃燒熱值產(chǎn)生太大的影響。在提高正丁醇的燃燒熱值的實^r中，純的正丁醇的燃燒熱值為36.66KJ/g。3HB曱酯的加入沒有明顯改變正丁醇的燃燒熱值，各個比重的3HB甲酯和正丁醇的混合燃料的燃燒熱值維持在一個平穩(wěn)的水平。MCL甲酯的加入可以提高正丁醇的燃燒熱值，最高可以達到39KJ/g,而且隨著MCL甲酯的比例升高，MCL曱酯和正丁醇混合燃料的燃燒熱值也呈現(xiàn)規(guī)律性的提高。此外，少量本身不能燃燒的3HB鈉鹽的加入也可以提高正丁醇的燃燒熱值，3HB鈉鹽的加入可以4吏正丁醇的燃燒熱值提高到39KJ/g左右。表1.20000L發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基成分營養(yǎng)成分(g/L)FermentationA氮FermentationB磷FermentationC磷葡萄糖a202050硫酸銨122磷酸氫二鈉5.63.55.8七水好u酸鎂0.20.20.5二水氯化釣0.050.050.1;隊量元素溶液b112酵母提取物0.50.51月桂酸c202050a葡萄糖在初始生長培養(yǎng)基中添加b微量元素溶液的濃度單位使ml/Lc月桂酸在圖4a,4b和4c所示的時間l殳添加表2:3HB甲酯、MCL甲酯以及它們和乙醇、汽油及柴油各種比例混合的燃燒熱值。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>MCL甲酯-汽油(4:6)49.64注燃燒熱值的單位均為KJ/g。其中混合燃料的比例均為重量比(w/w)。表3.利用3HB曱酯、3HB鈉鹽和MCL曱酯提高醇類燃料燃燒熱值的實驗數(shù)據(jù)沖羊品燃燒熱值沖羊品燃燒熱值乙醇27.32MCL曱酯-正丙醇(1:9)36.66正丙醇34.32MCL甲酯-正丙醇(2:8)36.66正丁醇36.66MCL曱酯-正丙醇(3:7)36.273HB曱酯19.43MCL甲酯-正丙醇(4:6)38.22MCL曱酯36.53HB鈉-正丙醇(0.01)36.663HB鈉-正丙醇(0.02)35.493HB曱酯-乙醇(1:9)32.883HB曱酯-乙醇(2:8)35.563HB曱酯-正丁醇(1:9)37.643HB曱酯-乙醇(3:7)35.573HB甲酯-正丁醇(2:8)37.643HB甲酯-乙醇(4:6)35.573HB甲酯-正丁醇(3:7)39.39MCL甲酯-乙醇(1:9)36.863HB曱酯-正丁醇(4:6)35.49MCL甲酯-乙醇(2:8)39.64MCL甲酯-正丁醇(1:9)36.66MCL甲酯-乙醇(3:7)38.83MCL甲酯-正丁醇(2:8)38.61MCL曱酯-乙醇(4:6)37.52MCL曱酯-正丁醇(3:7)393HB鈉-乙醇(0.01)34.33MCL甲酯-正丁醇(4:6)393HB鈉-乙醇(0.02)34.333HB鈉-正丁醇(0.01)393HB鈉-正丁醇(0.02)393HB曱酯-正丙醇(1:9)36.663HB曱酯-正丙醇(2:8)37.833HB曱酯-正丙醇(3:7)36.663HB甲酯-正丙醇(4:6)34.32注燃燒熱值的單位均為KJ/g。3HB鈉-乙醇(0.01)表示0.8克的乙醇中加入0.01克的3HB鈉，3HB鈉-乙醇(0.02)表示0.8克的乙醇中加入0.02克的3HB鈉，正丙醇和正丁醇中的表示含義和3HB鈉-乙醇中的一樣。22表4.醇解mclPHA后的各種mclHA甲酯比例樣品摩爾比例(mol%)mclPHA聚合物HHxHOHDHDD3.0±0.122.9±0.333.2±1.040.9±1.4mclHA曱酯HHx曱酯HO曱酯HD曱酯HDD甲酯1.85±1.229.06±0.833.11±2.135.98±0.1注mclPHA聚合物是由惡臭假單胞菌KTOY06發(fā)酵生產(chǎn)的；HHx:3-羥基己酸(3-hydroxyhexanoate);HO:3-羥基辛酸(3-hydroxyotanoate);HD:3-羥基發(fā)酸(3-hydroxydecanoate);HDD:3-輕基十二酸(3-hydroxydodecanoate)。權(quán)利要求1.式(I)化合物作為燃料的用途，其中，m為0-3的整數(shù)；R1選自C1-C5的烷基；R2選自H和C1-C17的烷基。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中R!為d、C2或C3的烷基。3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中R2選自d-C9的烷基。4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中R2為d、C2或C3的烷基。5.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中式(I)化合物選自由以下成員構(gòu)成的組3-羥基丁酸甲酯；3-羥基丁酸乙酯；4-羥基丁酸甲酯；3-羥基戊酸甲酯；3-羥基戊酸乙酯；3-羥基己酸曱酯；3-羥基己酸乙酯；乳酸甲酯；乳酸乙酯。6.式(I)化合物作為燃料添加劑的用途，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>(I)其中，m為0-3的整數(shù)；R!選自d-C5的烷基和堿金屬離子；R2選自H和d-Cn的烷基。7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中R^選自d、C2、Cg的烷基和Na+。8.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中R2選自d-C9的烷基。9.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中R2為d、。2或。3的烷基。10.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中式(I)化合物選自由以下成員構(gòu)成的組3-輕基丁酸曱酯；3-羥基丁酸乙酯；4-羥基丁酸曱酯；3-羥基戊酸曱酯；3-羥基戊酸乙酯；3-羥基己酸曱酯；3-羥基己酸乙酯；3-羥基丁酸鈉；乳酸曱酯；乳酸乙酯。11.根據(jù)權(quán)利要求6-10任一項的用途，其中所述燃料選自醇類燃料、汽油、柴油。12.—種燃料組合物，包含至少一種燃料；以及式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>R2(I)其中，m為0-3的整數(shù)；選自CrC5的烷基和堿金屬離子；R2選自H和d-Cn的烷基。13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中R!選自d、C2、C3的烷基和Na+。14.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中R2選自d-C9的烷基。15.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中R2為d、<32或〇3的烷基。16.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中式(I)化合物選自由以下成員構(gòu)成的組3-羥基丁酸曱酯；3-羥基丁酸乙酯；4-羥基丁酸曱酯；3-羥基戊酸曱酯；3-羥基戊酸乙酯；3-羥基己酸曱酯；3-輕基己酸乙酯；3-羥基丁酸鈉；乳酸曱酯；乳酸乙酯。17.根據(jù)權(quán)利要求12-16任一項的組合物，其中所述至少一種燃料選自醇類燃料、汽油、柴油。18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其中所述醇類燃料選自乙醇、正丙醇、正丁醇。全文摘要本發(fā)明涉及羥基脂肪酸衍生物作為燃料添加劑的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了羥基脂肪酸低級烷基酯和/或羥基脂肪酸鹽作為生物燃料和/或燃料添加劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種燃料組合物，包含至少一種燃料以及羥基脂肪酸低級烷基酯和/或羥基脂肪酸鹽。文檔編號C10L1/04GK101591575SQ20081009873公開日2009年12月2日申請日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日發(fā)明者羅容聰,陳國強申請人:汕頭大學