具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及用于蛋白質(zhì)分離的高效液相色譜固定相領(lǐng)域，尤其涉及一種具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相及其制備方法。

背景技術(shù)：

高效液相色譜(hplc)由于柱效高和分離條件溫和，已經(jīng)發(fā)展成為分離和分析生物大分子的強(qiáng)有力手段。離子交換色譜(iec)是一種高效的分離方法，是hplc中必不可少的分離模式。

它是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換色譜固定相中可交換的離子通過(guò)交換而達(dá)到分離純化的方法，也可以認(rèn)為是蛋白質(zhì)分子中帶電的氨基酸殘基與帶相反電荷的色譜固定相相互作用達(dá)到分離純化的方法。所以當(dāng)前都是帶正電荷或者負(fù)電荷的離子型色譜固定相，帶電功能基團(tuán)決定了離子交換的基本性質(zhì)，功能基團(tuán)的類型決定了離子交換的類型和強(qiáng)弱，它們的總量和有效數(shù)量決定了離子交換劑的總交換容量和有效交換容量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要提供的是一種非離子型色譜固定相，是一種與當(dāng)前離子型色譜固定相不同的新型固定相，原理是nacl溶液為洗脫液，固定相上的羥基會(huì)與洗脫液的氯離子形成o—h…cl的弱氫鍵作用，使得色譜固定相帶上負(fù)電荷，因此具有了陽(yáng)離子交換功能。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相，結(jié)構(gòu)式為：

其中為聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙脂微球，r為h或ch3，n為1～8的整數(shù)。

一種具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相的制備方法，包括以下步驟：

基質(zhì)表面環(huán)氧基水解：將pgma/edma微球i分散于h2so4溶液中，接著攪拌至完全反應(yīng)，得到環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii；

第一次清洗干燥：將得到的環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii分別用水和甲醇洗滌，接著真空干燥，得到干燥微球pgma/edmaii；

基質(zhì)表面環(huán)氧化：將得到的干燥微球pgma/edmaii分散于混合溶液一中，邊攪拌邊加入環(huán)氧氯丙烷，接著攪拌至完全反應(yīng)，其中混合溶液一包括二甲亞砜溶液和naoh溶液，得到環(huán)氧化微球pgma/edmaiii；

第二次清洗干燥：將得到的環(huán)氧化微球pgma/edmaiii分別用水和甲醇洗滌，接著真空干燥，得到干燥微球pgma/edmaiii；

非離子型色譜固定相獲得：將得到的干燥微球pgma/edmaiii分散于二氧六環(huán)中，邊攪拌邊加入含多羥基的有機(jī)胺，攪拌至完全反應(yīng)，得到多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv；

第三次清洗干燥：將得到的多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv分別用水和甲醇洗滌，接著真空干燥，得到陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相。

最優(yōu)的，所述基質(zhì)表面環(huán)氧基水解步驟具體為：按照6克的pgma/edma微球i分散于至少100ml的h2so4溶液中的比例將pgma/edma微球i分散于h2so4溶液中，其中h2so4溶液濃度為0.1mol/l，在60℃水浴條件下攪拌反應(yīng)至少10小時(shí)，得到環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii。

最優(yōu)的，所述基質(zhì)表面環(huán)氧化步驟具體為：按照6克干燥微球pgma/edmaii分散于至少60ml的混合溶液一中的比例將干燥微球pgma/edmaii分散于混合溶液一中，室溫邊攪拌邊加入5ml環(huán)氧氯丙烷，接著在60℃水浴條件下攪拌反應(yīng)4～6小時(shí)，其中混合溶液一包括二甲亞砜溶液和naoh溶液，得到環(huán)氧化微球pgma/edmaiii。

最優(yōu)的，所述基質(zhì)表面環(huán)氧化步驟中的混合溶液一包括5體積份的二甲亞砜溶液和1體積份的naoh溶液。

最優(yōu)的，所述非離子型色譜固定相獲得步驟具體為：按照6克干燥微球pgma/edmaiii分散于至少50ml的二氧六環(huán)中的比例將干燥微球pgma/edmaiii分散于二氧六環(huán)中，邊攪拌邊加入含多羥基的有機(jī)胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～6小時(shí)，得到多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv。

最優(yōu)的，所述非離子型色譜固定相獲得步驟中，含多羥基的有機(jī)胺為n-甲基葡糖胺，且6克干燥微球pgma/edmaiii分散于至少50ml的二氧六環(huán)中，室溫邊攪拌邊加入2克n-甲基葡糖胺。

最優(yōu)的，所述第一次清洗干燥步驟具體為：將得到的環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii分別用水和甲醇各洗滌2～4次，接著50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaii；所述第二次清洗干燥步驟具體為：將得到的環(huán)氧化微球pgma/edmaiii分別用水和甲醇各洗滌2～4次，接著50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaiii；所述第三次清洗干燥步驟具體為：將得到的多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv分別用水和甲醇各洗滌2～4次，接著50℃真空干燥4h，得到陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相。

最優(yōu)的，所述pgma/edma微球i的結(jié)構(gòu)式為：

所述環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii和干燥微球pgma/edmaii的結(jié)構(gòu)式均為：

所述環(huán)氧化微球pgma/edmaiii和干燥微球pgma/edmaiii的結(jié)構(gòu)式均為：

所述多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv和陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相結(jié)構(gòu)式均為：

其中為聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙脂微球，r為h或ch3，n為1～8的整數(shù)。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供的陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相，以聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙脂微球?yàn)榛|(zhì)，將其表面環(huán)氧基水解后生成鄰二醇基，在naoh的作用下使羥基與環(huán)氧氯丙烷發(fā)生反應(yīng)，再在二氧六環(huán)中使環(huán)氧基與含多羥基的有機(jī)胺發(fā)生反應(yīng)，得到一種含有多羥基及胺基的特殊色譜固定相。該固定相含有大量不帶電荷的羥基以及帶微弱正電荷的胺基，在陽(yáng)離子交換模式下表現(xiàn)出極好的分離性能，從而可以使用填充該色譜固定相的色譜柱對(duì)堿性蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。

附圖說(shuō)明

附圖1：具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相反應(yīng)原理圖。

附圖2：具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相對(duì)五種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的色譜分離圖。圖中1、2、3、4、5分別為核糖核酸b、核糖核酸酶a、細(xì)胞色素c、α-糜蛋白酶原a、溶菌酶。

具體實(shí)施方式

結(jié)合本發(fā)明的附圖，對(duì)發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)闡述。

一種具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相，結(jié)構(gòu)式為：

其中為聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙脂微球，r為h或ch3，n為1～8的整數(shù)。

參照附圖1所示，一種具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相的制備方法，包括以下步驟：

s1：基質(zhì)表面環(huán)氧基水解：按照6克的pgma/edma微球i分散于至少100ml的h2so4溶液中的比例將pgma/edma微球i分散于h2so4溶液中，其中h2so4溶液濃度為0.1mol/l，在60℃水浴條件下攪拌反應(yīng)至少10小時(shí)，得到環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii。其中pgma/edma微球i的結(jié)構(gòu)式為：

s2：第一次清洗干燥：將得到的環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii分別用水和甲醇各洗滌2～4次，接著50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaii。其中環(huán)氧基水解成鄰二醇基微球pgma/edmaii和干燥微球pgma/edmaii的結(jié)構(gòu)式均為：

s3：基質(zhì)表面環(huán)氧化：按照6克干燥微球pgma/edmaii分散于至少60ml的混合溶液一中的比例將干燥微球pgma/edmaii分散于混合溶液一中，室溫邊攪拌邊加入5ml環(huán)氧氯丙烷，接著在60℃水浴條件下攪拌反應(yīng)4～6小時(shí)，其中混合溶液一包括5體積份的二甲亞砜溶液和1體積份的naoh溶液，得到環(huán)氧化微球pgma/edmaiii。

s4：第二次清洗干燥：將得到的環(huán)氧化微球pgma/edmaiii分別用水和甲醇各洗滌2～4次，接著50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaiii。其中環(huán)氧化微球pgma/edmaiii和干燥微球pgma/edmaiii的結(jié)構(gòu)式均為：

s5：非離子型色譜固定相獲得：按照6克干燥微球pgma/edmaiii分散于至少50ml的二氧六環(huán)中的比例將干燥微球pgma/edmaiii分散于二氧六環(huán)中，邊攪拌邊加入2克的n-甲基葡糖胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～6小時(shí)，得到多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv。

s6：第三次清洗干燥：將得到的多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv分別用水和甲醇各洗滌2～4次，接著50℃真空干燥4h，得到陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相。其中多羥基有機(jī)胺改性的色譜固定相微球pgma/edmaiv和陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相結(jié)構(gòu)式均為：

其中為聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙脂微球，r為h或ch3，n為1～8的整數(shù)。

接著將得到的陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相裝柱，在離子交換模式下對(duì)五種標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行分離。

分離條件如下所述：

流動(dòng)相：a液是20mmol/l的tris，且tris的ph是7.5；b液是20mmol/ltris+1.0mol/lnacl，且b液的ph是7.5。線性梯度洗脫，初始時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總體積的90％，流動(dòng)相b占流動(dòng)相總體積的10％，接下來(lái)的30min內(nèi)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總體積的份數(shù)降至40％，流動(dòng)相b占流動(dòng)相總體積的份數(shù)升至60％，流速為1.0ml/min，對(duì)核糖核酸b、核糖核酸酶a、細(xì)胞色素c、α-糜蛋白酶原a、溶菌酶等五種蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)了良好的分離，分離結(jié)果如附圖2所示，圖中1、2、3、4、5分別為核糖核酸b、核糖核酸酶a、細(xì)胞色素c、α-糜蛋白酶原a、溶菌酶，可以看出本發(fā)明所述的具有陽(yáng)離子交換功能的非離子型色譜固定相，可以將上述五種標(biāo)準(zhǔn)蛋白達(dá)到基線分離。