氟表面活性劑及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及高分子表面活性劑技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種氟表面活性劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理。在微流控芯片中利用油包水的原理，將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴含或不舍待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。在經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個對每個微滴進(jìn)行檢測，利用泊松分布對熒光信號進(jìn)行處理。

而表面活性劑通過降低油水界面張力，可以避免液滴發(fā)生融合，甚至可以在加熱加壓條件下保持液滴系統(tǒng)的穩(wěn)定，穩(wěn)定的液滴可以使液滴內(nèi)部成為一個反應(yīng)倉，利于將DNA模板細(xì)分成單一進(jìn)行擴(kuò)展。目前報道有全氟聚醚酯化物，全氟聚醚酰胺化物等非離子型氟表面活性劑。

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)作為21世紀(jì)科研含量極高，備受生物醫(yī)療界關(guān)注的一項(xiàng)技術(shù)，現(xiàn)階段僅有Bio-Rad及RainDance外國品牌具備相關(guān)成熟產(chǎn)品，因此市面上數(shù)字PCR儀器所需生成油，包括探針法及染料法，幾乎全部都來源于以上廠家。

現(xiàn)有的氟表面活性劑中非離子型產(chǎn)品以聚氧乙烯鏈為親水基團(tuán)的類型為主。從專利文獻(xiàn)可知該類活性劑制備工藝非常復(fù)雜，一般制作步驟在兩步以上且中間產(chǎn)物市面上并無銷售，因此導(dǎo)致該液滴生成所需的耗材價格高昂，滿足不了更廣闊的市場。

杜克大學(xué)的Ya-Ling Chui等在ACS NANO期刊中提到，可將含氟聚醚羧酸與二氯亞砜反應(yīng)生成酰氯完成第一步之后，接著溶解于三氟甲苯與HFE-7100混合液中，再加入三(羥甲基)氨基甲烷在惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行反應(yīng)生成含氟聚醚羧酸酰胺。但反應(yīng)過程中間產(chǎn)物酰氯非常容易與水發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致后續(xù)步驟效果不佳甚至產(chǎn)物報廢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要針對上述問題，提供一種氟表面活性劑，該氟表面活性劑具有制備簡單，性能優(yōu)越的特點(diǎn)。

具有式I所示結(jié)構(gòu)特征的氟表面活性劑：

所述氟表面活性劑的平均分子量為4000-9000。

上述氟表面活性劑可作為PCR探針法油相使用，實(shí)現(xiàn)在液滴式數(shù)字PCR上應(yīng)用，且液滴穩(wěn)定性可以得到保證，該氟表面活性劑具有優(yōu)越的表面性能。

在其中一個實(shí)施例中，所述氟表面活性劑的平均分子量為6000-9000。

本法明還公開了上述的氟表面活性劑的制備方法，包括如下反應(yīng)步驟：

在其中一個實(shí)施例中，以4-二甲氨基吡啶作為上述反應(yīng)的催化劑。以4-二甲氨基吡啶作為催化劑，對反應(yīng)物實(shí)現(xiàn)?；?，其具有較高的催化能力，對提高收率有極其明顯的效果。

在其中一個實(shí)施例中，所述反應(yīng)的具體條件為：在惰性氣體保護(hù)下，將式II的全氟聚醚、式III的三羥甲基氨基甲烷與4-二甲氨基吡啶溶于反應(yīng)溶劑中，在60℃-120℃的范圍下攪拌反應(yīng)12hr-36hr，回收溶劑，即得；所述反應(yīng)溶劑為氟油。反應(yīng)溫度優(yōu)選80℃-100℃?？刂品磻?yīng)按照上述條件進(jìn)行，能夠減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高產(chǎn)物得率。

在其中一個實(shí)施例中，所述反應(yīng)溶劑還包括極性有機(jī)溶劑，所述極性有機(jī)溶劑選自：三氟甲苯、二甲基甲酰胺、四氫呋喃和二甲基亞砜中的至少一種。優(yōu)選三氟甲苯。將極性有機(jī)溶劑和氟油混合作為反應(yīng)溶劑使用，能夠提高最終得到產(chǎn)物的純度。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述氟油與所述極性有機(jī)溶劑的體積此為1.2-2.0。

在其中一個實(shí)施例中，所述氟油為甲氧基-九氟代丁烷。以甲氧基-九氟代丁烷作為反應(yīng)溶劑，具有溶解性好，易控的優(yōu)點(diǎn)。

在其中一個實(shí)施例中，上述制備方法還包括純化步驟，所述純化步驟中，將反應(yīng)步驟得到的產(chǎn)物再次加入氟油溶解，然后滴加二氯甲烷，使產(chǎn)物中的式I化合物析出，干燥后即得所述氟表面活性劑。通過上述純化步驟，可以大幅度提高產(chǎn)物純度。

本發(fā)明還公開了上述的氟表面活性劑在PCR擴(kuò)增的微滴化處理過程中的應(yīng)用。將上述氟表面活性劑應(yīng)用于液滴式數(shù)字PCR中，作為PCR探針法油相使用，能夠降低液滴表面張力，提高微滴穩(wěn)定性。

本發(fā)明還公開了上一種液滴生成油，包括上述的氟表面活性劑作為溶質(zhì)的氟油溶液，所述氟表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為1.5％-2.5％。

上述液滴生成油能夠保證液滴的穩(wěn)定性，具有較好的效果。

在其中一個實(shí)施例中，作為液滴生成油使用的氟油型號為HFE-7500。

與現(xiàn)有技術(shù)相此，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的氟表面活性劑，可作為PCR探針法油相使用，實(shí)現(xiàn)在液滴式數(shù)字PCR上應(yīng)用，且液滴穩(wěn)定性可以得到保證。

本發(fā)明的氟表面活性劑的制備方法，為創(chuàng)新的一步法制備工藝，具有工藝簡單，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

選用上述方法制備的氟表面活性劑制備液滴生成油，具有成本低，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中反應(yīng)原料與產(chǎn)物紅外光譜對此圖。

其中：實(shí)線表示產(chǎn)物PFPE-Tris紅外光譜，虛線表示原料PFPE-COOH紅外光譜。

圖2為實(shí)施例1中產(chǎn)物PFPE-Tris氟譜圖。

圖3為實(shí)施例2中產(chǎn)物PFPE-Tris氫譜圖。

圖4為實(shí)施例3中液滴生成后及時取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖5為實(shí)施例3中液滴生成靜置7天后取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖6為實(shí)施例3中液滴生成后及時取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為100μm。

圖7為實(shí)施例3中液滴生成靜置7天后取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為100μm。

圖8為實(shí)施例3中微流控芯片生成均一的油包水液滴示意圖。

圖9為實(shí)施例3中PCR擴(kuò)增熱循環(huán)前顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖10為實(shí)施例3中PCR擴(kuò)增熱循環(huán)后顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖11為圖10虛線框放大視野圖，圖中圖例長度為100μm。

圖12為圖11在汞燈環(huán)境下調(diào)整曝光率后液滴熒光示意圖。

圖13為液滴進(jìn)行熒光信號采集波形圖。

圖14為圖13經(jīng)濾波處理后的波形圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。

以下實(shí)施例中所用原料均為市售購得。

實(shí)施例1

一種氟表面活性劑，通過以下方法制備得到：

一、反應(yīng)。

按照如下反應(yīng)線路進(jìn)行：

所述反應(yīng)的具體條件為：在惰性氣體保護(hù)下，將式II的全氟聚醚(購自杜邦，型號為FSH157，該全氟聚醚的平均分子量為7000-7500)、式III的三羥甲基氨基甲烷(tris)與4-二甲氨基吡啶溶(DMAP)于氟油(購自杜邦，型號為HFE-7100)與三氟甲苯的混合反應(yīng)溶劑中，所述HFE-7100與所述三氟甲苯的體積此為1.6，在80℃-100℃的范圍下攪拌反應(yīng)24hr，抽濾后旋干溶劑。

二、純化。

將步驟一得到的產(chǎn)物再次加入HFE-7100溶解，滴加二氯甲烷清洗將最終產(chǎn)物析出并進(jìn)行旋蒸，然后真空干燥12小時后得到白色透明油狀物的最終產(chǎn)物，即得式I的氟表面活性劑(PFPE-Tris)。

三、驗(yàn)證。

將上述PFPE-Tris進(jìn)行紅外圖譜及核磁圖譜(氟譜、氫譜)檢測核實(shí)。

從圖譜中可以看出，如圖1所示，在紅外圖譜中可以清晰觀察到在1675cm-1位置上有明顯的產(chǎn)物酰胺C＝O特征吸收峰。如圖2所示，氟譜中虛線圖框內(nèi)即化學(xué)位移在-83～-74范圍的一系列共振峰可以核實(shí)是PFPE該成分；此外氫譜中化學(xué)位移3.5～5范圍中的兩個單峰的積分面積此值約為3∶4，可以證實(shí)為Tris結(jié)構(gòu)，即驗(yàn)證所得產(chǎn)物即為式I的PFPE-Tris。

實(shí)施例2

一種液滴生成油，將實(shí)施例1制備得到的氟表面活性劑按質(zhì)量百分濃度2％的量溶于HFE-7500氟油(購自杜邦，型號為HFE-7500)中，即得。

實(shí)施例3

利用實(shí)施例2的液滴生成油進(jìn)行液滴生成實(shí)驗(yàn)。

一、靜置穩(wěn)定性測試。

對實(shí)施例2的液滴生成油進(jìn)行了液滴靜置穩(wěn)定性的測試，使用生成后立即取樣的液滴與放置7天后的液滴進(jìn)行對比，如圖4-7所示，在顯微鏡可以觀察到兩者幾乎沒有區(qū)別，液滴照樣能呈現(xiàn)蜂巢式均一性排布，可以說明該油相所制液滴具備優(yōu)秀的靜置穩(wěn)定性能。

二、液滴式數(shù)字PCR測試。

對實(shí)施例2的液滴生成油進(jìn)行液滴式數(shù)字PCR測試。具體為：以Hotstart master mix配合引物、探針及DNA模板作為水相，如圖8所示，在微流控芯片中生成均一的油包水液滴，進(jìn)行PCR擴(kuò)增熱循環(huán)。

PCR擴(kuò)增熱循環(huán)前顯微鏡下觀察到液滴形態(tài)如圖9所示，PCR擴(kuò)增熱循環(huán)后顯微鏡下觀察到液滴形態(tài)如圖10所示。在顯微鏡下觀察到，液滴經(jīng)30至50圈熱循環(huán)后，其均一性狀態(tài)依然保持良好，仍然呈現(xiàn)規(guī)律的蜂窩形貌，破損及融合液滴的存在率(CV值)遠(yuǎn)低于5％。

將圖10中虛線框的局部放大，得到圖11的局部視圖。在汞燈環(huán)境下調(diào)整曝光率，清晰觀察到，擴(kuò)增后呈陽性的液滴熒光強(qiáng)度相對其他陰性液滴更加明亮，如圖12所示，該圖12為圖11相同視野圖。

再對液滴熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，利用光機(jī)模塊對每個通過的液滴進(jìn)行熒光信號采集并進(jìn)行濾波處理，如圖13-14所示，在隨機(jī)一段采集片段中可以清晰看到，幾個陽性峰的峰值強(qiáng)度是眾多陰性峰值的4倍左右，符合顯微鏡觀察結(jié)果。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。