專利名稱：紫金牛葉桿菌RC6b及其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫金牛葉桿菌，具體涉及一種根際促生(Plant growth promotingrhizobacteria, PGPR)紫金牛葉桿菌RC6b及其在重金屬污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
重金屬是環(huán)境中普遍存在的一類無(wú)機(jī)污染物，由于其在環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定不能降解，使得重金屬污染治理十分困難。特別是土壤重金屬污染，不僅影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)也使地下水體受到污染，并通過(guò)食物鏈的“生物放 大”作用對(duì)人類健康造成極大的威脅。修復(fù)重金屬污染土壤，恢復(fù)其原有功能，一直是國(guó)際研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，重金屬污染修復(fù)主要有兩種途徑1.改變重金屬的存在狀態(tài)，使其固化或鈍化，將重金屬的活性降低，減少它們?cè)谕寥乐械倪w移性和生物可利用性；2.利用特殊植物吸收土壤中的重金屬，然后將植物除去，再經(jīng)過(guò)淋洗、收集，以達(dá)到回收重金屬和減少土壤污染的雙重目的。就植物修復(fù)而言，土壤中過(guò)量的重金屬會(huì)阻礙一般植物的正常生長(zhǎng)。相比之下，大多超富集植物雖然對(duì)重金屬的抗耐、積累能力強(qiáng)，但其生長(zhǎng)緩慢且生物量小，導(dǎo)致實(shí)際修復(fù)效率很低，制約了植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用。近年來(lái)，植物根際細(xì)菌引起了國(guó)內(nèi)外研究者的極大關(guān)注，尤其在根際細(xì)菌、重金屬和植物三者的相互作用方面。研究發(fā)現(xiàn)，根際細(xì)菌可以通過(guò)以下途徑，來(lái)提高植物修復(fù)效率1.細(xì)菌自身吸附降低重金屬對(duì)植物的毒性；2.分泌植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育；3.多種渠道影響土壤中重金屬的植物有效性。然而，能夠同時(shí)具備以上三種能力的微生物資源還很少。目前，有關(guān)葉桿菌屬的研究主要集中在其提高土壤肥力，促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)方面，至今還未報(bào)道能夠自身吸附重金屬、提高重金屬植物有效性的葉桿菌。此外，環(huán)境中通常以多種重金屬同時(shí)存在，呈現(xiàn)其復(fù)合污染的現(xiàn)象。目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠同時(shí)吸附幾種重金屬的微生物資源。
發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明旨在針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問(wèn)題和需求，提供了一種能夠自身吸附重金屬并促進(jìn)重金屬污染土壤植物修復(fù)效率的微生物資源，該微生物為植物根際促生菌紫金牛葉桿菌RC6b CGMCC No. 6621，該菌對(duì)重金屬鎘、鋅、鉛均具有較強(qiáng)的抗性，分別可達(dá)到350、1000和450011^ L—1，并能夠在200mg L—1含鎘、鋅、鉛的液體培養(yǎng)基中很好的生長(zhǎng)；可以分泌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì)，比如I-氨基環(huán)丙燒-I-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate, ACC)脫氨酶、卩引哚乙酸(indole-3-acetic acid)、鐵載體(Siderophore),并能溶解土壤中難溶性磷酸鹽(Phosphate);可以自身吸附溶液中的重金屬鎘、鋅、鉛；能夠顯著促進(jìn)修復(fù)植物在重金屬污染條件下的生長(zhǎng)；可使污染土壤中修復(fù)植物對(duì)鎘、鋅、鉛的吸收量分別提高138%，90%, 46%。因此，該菌株在重金屬污染土壤的生物修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景。技術(shù)方案一株紫金牛葉桿菌(Phyllobacteriummyrsinacearum) RC6b,該菌種已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 66210紫金牛葉桿菌RC6b在修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用。紫金牛葉桿菌RC6b的抗重金屬且具ACC脫氨酶活性的促生菌分離培養(yǎng)基，即ADF培養(yǎng)基(1L)，其組成為DF母液(每升含4gKH2PO4, 6g Na2HPO4, O. 2g MgSO4 · 7H20,0. OOlg FeSO4 · 7H20, 2g 葡萄糖，2g 葡萄糖酸，2g 檸檬酸，2g (NH4)2SO4，微量元素溶液O. ImL)加ACC (終濃度為3nmol Γ1)為唯一氮源的培養(yǎng)基，瓊脂20g, pH 7. 2，重金屬50-4500mg L-1。上述重金屬分別為鎘、鋅、鉛。本發(fā)明提供一種自身吸附重金屬并能促進(jìn)重金屬污染土壤植物修復(fù)效率的優(yōu)勢(shì)菌種。該菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 6621，經(jīng)鑒定為紫金牛葉桿菌(PhylIobacterium
myrsinacearum)ο該菌株在Luria-Bertani (LB)平板上生長(zhǎng)48h后呈灰褐色半透明，菌落直徑約為I 4mm，表面皺褶且凹陷，邊緣較整齊(見(jiàn)圖I)。經(jīng)染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性，桿狀。該菌具有較強(qiáng)吸附重金屬、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高土壤中重金屬植物有效性的能力。將 Phyllobacterium myrsinacearum RC6b CGMCC No. 6621 菌株接種于 LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；將上述培養(yǎng)好的菌懸液按2%的接種量接入250mL三角瓶，含不同重金屬鎘、鋅、鉛濃度均為200mg L-1LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)36h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株在重金屬濃度較高的液體培養(yǎng)基中可以很好地生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)曲線與該菌對(duì)鎘、鋅、鉛的抗性結(jié)果呈現(xiàn)一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系；重金屬離子對(duì)菌株RC6b的毒害順序?yàn)殒k > 鋅 > 鉛(見(jiàn)圖3)。將RC6b CGMCC No. 6621菌株分別接種于濃度為150mg Λ pH值為4· O的CdCl2、ZnSO4、Pb (NO3) 2溶液，并放入20°C恒溫培養(yǎng)箱中，吸附2、4、6、8h，然后過(guò)濾，收集上清液，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定溶液中殘余Cd2+、Zn2+、Pb2+的濃度，并計(jì)算細(xì)菌對(duì)重金屬離子的吸附量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RC6b菌株對(duì)Cd2+、Zn2+、Pb2+三種重金屬離子的吸附強(qiáng)弱順序?yàn)閆n2+(10. 79mgkg—1干重)>Cd2+ (5. 82mg kg—1干重)>Pb2+ (3. 12mg kg—1干重)(見(jiàn)圖4)。這很可能與重金屬的離子半徑直接相關(guān)。由于Cd2+的離子半徑(0.97 A )、Zn2+ ( 0.88 A )、Pb2+ (1.2 A),具有較小離子半徑的重金屬可以很容易被吸附到細(xì)菌表面。將RC6b CGMCC No. 6621菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；將上述菌懸液按10%的接種量接入重金屬污染土壤中，28°C避光培養(yǎng)5d后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，污染土壤中重金屬鎘、鋅、鉛的可溶解性呈顯著增加趨勢(shì)。其中，土壤中重金屬鎘的可溶解性提高了 16. 7倍，鋅為4. 6倍，鉛為5. 7倍(見(jiàn)圖5)。將RC6b CGMCC No. 6621菌株接種到表面消毒的油菜種子，培養(yǎng)45d后，在不含重金屬的培養(yǎng)基中，植物根長(zhǎng)、莖葉長(zhǎng)、鮮重、干重均明顯高于不接菌的對(duì)照處理。此外，含5、IOmL Cd2+I/1培養(yǎng)基雖然表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性，抑制了油菜的生長(zhǎng)。但在用RC6b菌浸種的處理中，植物的生物量也明顯高于不接菌的對(duì)照處理(見(jiàn)圖6)。此外，在植物修復(fù)過(guò)程中，接種紫金牛葉桿菌RC6b不僅可以大大促進(jìn)超富集植物伴礦景天的生長(zhǎng)，還可以顯著地提高伴礦景天對(duì)重金屬鎘、鋅、鉛的吸收量(P〈0. 05)，其中增幅最高的是鎘(138%)，其次是鋅(90%)和鉛(46%)(見(jiàn)圖7)。本發(fā)明提供的CGMCC No. 6621菌，能在以ACC為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并能自身吸附重金屬離子，促進(jìn)重金屬污染土壤上植物的生長(zhǎng)，提高土壤中重金屬植物有效性。
有益效果該根際促生菌具有較強(qiáng)的重金屬抗耐性和吸附能力，可以顯著地促進(jìn)植物的生長(zhǎng),降低重金屬對(duì)植物的毒性，同時(shí)提高土壤中重金屬的植物有效性。因此,可直接用于提高植物修復(fù)效率，并且在重金屬污染土壤的生物修復(fù)中具有較好的應(yīng)用前景。四
圖I為菌株RC6b在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；圖2基于16S rRNA序列同源性的菌株RC6b和相關(guān)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；圖3為菌株RC6b在含重金屬的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線；圖4為培養(yǎng)8小時(shí)內(nèi)菌株RC6b對(duì)溶液中重金屬的吸附量；圖5為培養(yǎng)5天后菌株RC6b對(duì)土壤中重金屬的活化情況； 圖6為菌株RC6b對(duì)含鎘營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上植物生長(zhǎng)的影響；圖7接種菌株RC6b對(duì)植物重金屬鎘、鋅、鉛吸收量的影響。五、具體實(shí)施方案實(shí)施例I :紫金牛葉桿菌 RC6b (Phyllobacterium myrsinacearum RC6b CGMCCNo. 6621)的分離、鑒定及其特性I. I 供試土壤采自浙江某鉛鋅礦區(qū)生長(zhǎng)的鋅鎘超富集植物伴礦景天的根際土壤。其基本理化性質(zhì)為pH 7. 6，有機(jī)質(zhì)13. 6g kg—1，銅全量1826. 7mg kg—1，鋅全量991. 9mg kg—1，鎘全量91. 3mg kg4,鉛全量14207. 4mg kg'新鮮土壤樣品過(guò)2mm篩,于暗處4°C保存。I. 2供試重金屬CdCl2 · 2. 5H20, ZnSO4 · 7H20 和 Pb (NO3) 2 均購(gòu)自 Sigma 公司(美國(guó))，均為分析純。I. 3培養(yǎng)基類型①Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基每升含5g酵母抽提物，IOg蛋白胨，IOgNaCl;②具ACC脫氨酶活性的促生菌分離培養(yǎng)基，即ADF培養(yǎng)基(IL)5Dworkin and Foster (DF)母液加ACC (終濃度為3nmol L—1)為唯一氮源的培養(yǎng)基，瓊脂20g，pH 7.2。DF母液每升含4gKH2PO4, 6g Na2HPO4, O. 2g MgSO4 · 7H20,0. OOlg FeSO4 · 7H20, 2g 葡萄糖，2g 葡萄糖酸，2g 檸檬酸，2g (NH4)2SO4，微量元素溶液O. ImL (其組成為100mL蒸餾水中溶解，124. 6mg ZnSO4,78. 2mg CuSO4, IOmg MoO3, IOmg H3BO3,11. 2mg MnSO4);③含重金屬的具 ACC 脫氨酶活性的促生菌分離培養(yǎng)基配制50mg Iiir1CdCl^ZnSO4和Pb (NO3)2儲(chǔ)液，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后加入上述配方的具ACC脫氨酶活性的促生菌分離培養(yǎng)基，制成重金屬濃度變化在50-4500mg Γ1 一系列培養(yǎng)基。I. 4根際促生菌的分離與純化稱取Ig上述新鮮供試土壤，加入裝有50mL SLP液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C下SOOrmirT1振蕩培養(yǎng)24h。然后，轉(zhuǎn)移ImL菌懸液至另一 50mL SLP培養(yǎng)液中，同等條件下培養(yǎng)24h。第3d，從SLP培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移ImL菌懸液至50mL DF液中，相同條件下培養(yǎng)48h，用于含ACC脫氨酶活性細(xì)菌的分離純化。最后，吸取O. ImL ADF培養(yǎng)液稀釋不同梯度涂布于ADF固體平板，28°C恒溫箱中培養(yǎng)72h，劃線分離，純化后_80°C保存。為避免重復(fù)篩選，觀察比較菌落形態(tài)，每樣本僅挑取占優(yōu)勢(shì)的單菌落作為研究用途的含ACC脫氨酶活性細(xì)菌。最后，再將含ACC脫氨酶活性的細(xì)菌菌液接種到含重金屬的磷酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)3d,能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的最低濃度為該菌株的最低抑菌濃度(Minimal inhibitoryconcentration, MIC)。I. 5菌種形態(tài)觀察及鑒定將已充分活化的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24h，革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察該菌株。經(jīng)染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性，桿狀。將活化菌種在LB培養(yǎng)基平皿上劃線接種，28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d，觀察菌落形態(tài)，并測(cè)量菌落大小。經(jīng)顯微鏡檢，在LB平板上生長(zhǎng)48h后呈灰褐色半透明，菌落直徑約為I 4mm，表面皺褶且凹陷，邊緣較整齊(見(jiàn)圖I)。I. 616S rDNA的PCR擴(kuò)增、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建利用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)提取細(xì)菌DNA。用于16S rDNA PCR反應(yīng)的引物為一對(duì)通用引物。正向引物為FAM27f :5' -GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3';反向引物為 1492r :5' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)條件94°C 3min ；94°C lmin,56°C lmin,72°C 2min，循環(huán) 33 次；72°C IOmin0 瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物的測(cè)序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。植物根際促生菌RC6b的16S rDNA序列通過(guò)Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。然后利用MEGA5. I軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(見(jiàn)圖2)。I. 7菌懸液的制備在無(wú)菌條件下將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28°C下200r mirT1振蕩培養(yǎng)18h，離心收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌3次，再用磷酸鹽緩沖液將菌液調(diào)節(jié)吸光度(OD600)至 I 備用，含菌量為 I. 5 X IO8CFU mL'I. 8菌株在含重金屬的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)為了測(cè)定每種重金屬離子對(duì)菌株生長(zhǎng)的毒害順序，在250mL三角瓶?jī)?nèi)分別配制各種重金屬離子濃度皆為200mg L^1LB液體培養(yǎng)基，終體積為50mL。將上述方法制備好的RC6b菌懸液以2%接種量分別接種，28°C下200r mirT1振蕩培養(yǎng)36h，在不同時(shí)段(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36h)定時(shí)取樣，4°C冷凍保存。同時(shí)在不含重金屬離子的液體培養(yǎng)基中接種菌株作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。最后，測(cè)定0D_值，觀察菌株的生長(zhǎng)，比較不同重金屬離子對(duì)RC6b菌株生長(zhǎng)的影響。I. 9生長(zhǎng)菌體對(duì)溶液中重金屬的吸附將菌株RC6b接種于含l%wt NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24h后，離心，棄去上清液，用離心管(IOmL)收集細(xì)菌，用去離子水洗滌菌體兩遍，棄去上清液。預(yù)留裝有細(xì)菌的離心管，菌體經(jīng)80°C干燥至衡重后稱量，計(jì)算細(xì)菌干重。分別配制濃度為150mg L'pH值為4. O的CdCl2溶液，然后用5mL的移液槍將該溶液分裝于裝有細(xì)菌的離心管中。接著將離心管全部放入20°C恒溫培養(yǎng)箱中，吸附2、4、6、8h，然后過(guò)濾，收集上清液，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定溶液中殘余Cd2+的濃度，并做兩個(gè)平行樣，計(jì)算菌體吸附量(菌體吸附前后培養(yǎng)基中重金屬離子濃度差除以吸附前細(xì)菌的干重)。見(jiàn)下式菌體吸附量(mg g—1)=[對(duì)照溶液起始濃度(mg L—1)-實(shí)測(cè)終濃度(mg L—1)] X溶液體積(L) X稀釋倍數(shù)/菌體質(zhì)量(g)。同樣配制濃度為150mg L—1的ZnSO4和Pb (NO3)2溶液，重復(fù)如上操作，進(jìn)行生長(zhǎng)菌體的吸附實(shí)驗(yàn)。I. 10菌株對(duì)土壤中重金屬的活化將該菌接種量為10% wt的菌懸液(ImL)添加到裝有Ig供試土壤的試管中，以加無(wú)菌蒸餾水的處理作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。用牛皮紙包裹所有試管，并稱重，28°C下200r mirT1避光振蕩。培養(yǎng)7天后，再次對(duì)試管稱重，并以等量的無(wú)菌水補(bǔ)償水分的蒸發(fā)量。然后，用IOmL無(wú)菌蒸餾水加入到每個(gè)試管，用于提取土壤中水溶性重金屬。將土壤懸浮液離心7000rpm IOmin并過(guò)濾。最后,用原子吸收分光光度計(jì)(AAS)測(cè)定土壤溶液中 Cd2+、Zn2+、Pb2+ 的濃度。AAS 為美國(guó)熱電公司 SOLAAR S4 型，含 Varian SpectrAA 220FS型火焰，220Z型石墨爐。I. 11菌株對(duì)含鎘營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上植物生長(zhǎng)的影響用O. 5%植物瓊脂(Phytagar)混合濃度分別為 5、IOmL I^CcTl/ffloagland’ s 營(yíng)養(yǎng)液，高溫滅菌，以不含重金屬的處理作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。將油菜種子于70%wt酒精中浸泡lmin，無(wú)菌水沖洗I次，再用3%NaC10浸泡3min，無(wú)菌水沖洗5_6次，備用。將表面消毒的植物種子放入上述方法配置的RC6b菌懸液中浸泡2h，然后接種到盛有25mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的150mL試管中，每根試管中加入6個(gè)種子,并用棉塞封口，放置在生長(zhǎng)室中。45d后，將植物從試管中移除，用無(wú)菌蒸餾水清洗植物根部3-5次，以除去根部附著 的植物瓊脂。測(cè)定植物的鮮重和干重，并用AAS測(cè)定重金屬離子在植物體內(nèi)的總含量。2. I根際促生菌的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)及生理生化特征及序列分析該紫金牛葉桿菌RC6b CGMCC No. 6621具有以下特征(I)菌落形態(tài)特征在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h的菌落大小為直徑I 4mm，菌落呈圓形，表面皺褶且凹陷，邊緣較整齊，呈灰褐色半透明(見(jiàn)圖I)。(2)菌體形態(tài)特征該菌為革蘭氏陰性，桿狀。(3)生理生化特征好氧生長(zhǎng)，氧化酶為陽(yáng)性，能利用ACC為唯一碳源和能源生長(zhǎng)；能分泌口引哚乙酸(;[11(1016-3-3061:;^ acid)、鐵載體(Siderophore)；能溶解土壤中難溶性磷酸鹽(Phosphate);不能水解淀粉、果膠和纖維素。該菌的16S rDNAPCR產(chǎn)物約I. 5kb左右，16S rRNA序列同源性比對(duì)(見(jiàn)圖2)表明，該菌株16S rRNA序列與Phyllobacteriummyrsinacearum細(xì)菌的16SrRNA序列相似性高達(dá)99%。結(jié)合上述的形態(tài)鑒定與16S rDNA分析結(jié)果將此菌株鑒定為紫金牛葉桿菌，其編號(hào)為RC6b。2. 2RC6b在含重金屬的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線RC6b在含有200mg L—1重金屬的液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。該菌株從接種到第36h生長(zhǎng)曲線與該菌對(duì)鎘、鋅、鉛的抗性結(jié)果呈現(xiàn)一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系；重金屬離子對(duì)菌株RC6b的毒害順序?yàn)殒k > 鋅 > 鉛。在初始的8h，細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始有所增加，其中增長(zhǎng)速度最快的是對(duì)照。鎘、鋅、鉛的存在初始抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。但是，幾小時(shí)以后RC6b恢復(fù)了其在重金屬溶液中的生長(zhǎng)能力。從8h到20h，細(xì)胞數(shù)目急劇增加，處于指數(shù)生長(zhǎng)期；第201!到28h，0D600值變化不大，細(xì)胞處于穩(wěn)定期；32h到36h，細(xì)胞數(shù)目有所減少，進(jìn)入衰亡期。2. 3RC6b菌株對(duì)溶液中重金屬的吸附特性分析RC6b菌株對(duì)溶液中重金屬鎘、鋅、鉛的吸附量隨時(shí)間的變化情況如圖4所示。RC6b菌株對(duì)培養(yǎng)液中的重金屬Cd2+、Zn2+、Pb2+具有很強(qiáng)的吸附能力。在初始4h內(nèi)，RC6b對(duì)Cd2+、Zn2+、Pb2+的吸附能力較強(qiáng)。第8h，RC6b對(duì)Cd2+、Zn2+、Pb2+吸附量分別達(dá)到最高。其中，RC6b對(duì)這三種重金屬離子的吸附強(qiáng)弱順序?yàn)閆n2+ (10. 79mg kg4干重)>Cd2+ (5. 82mg kg4干重)>Pb2+ (3. 12mg kg—1干重)。這很可能與重金屬的離子半徑直接相關(guān)。由于Cd2+的離子半徑(0.97 A K Zn2+(0.88 A ). Pb2+(1.2 A )，具有較小離子半徑的重金屬可以很容易被吸附到細(xì)菌表面。
2. 4RC6b菌株對(duì)土壤中重金屬的活化特性分析微生物能夠?qū)χ亟饘偕镉行缘挠绊懺酱?，在生物修?fù)中的利用價(jià)值就越大。因此，微生物提高土壤中重金屬溶解性是生物修復(fù)時(shí)選擇微生物的重要因素。圖5所示的是接種RC6b 5d后對(duì)土壤中重金屬鎘、鋅、鉛離子溶解性的影響情況。從圖中可以看出，接種RC6b菌株的土壤中，鎘、鋅、鉛的溶解性均明顯高于對(duì)照。此外，RC6b對(duì)土壤中鎘離子溶解性的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它重金屬。接種RC6b的土壤中，鎘的溶解性提高了 16. 7倍，鋅為
4.6倍，鉛為5. 7倍。以上結(jié)果表明該菌能有效地促進(jìn)鎘、鋅、鉛在土壤中的溶解性，且對(duì)鎘溶解性/植物可利用性的影響最強(qiáng)。本研究中利用ACC生長(zhǎng)的RC6b表現(xiàn)出較好地促進(jìn)土壤中重金屬鎘、鋅、鉛溶解性的能力。2. 5RC6b菌株對(duì)含鎘培養(yǎng)基上植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用分析圖6所示的是接種RC6b菌株對(duì)含鎘營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上油菜生長(zhǎng)的影響情況。從 圖中可以看出，將RC6b CGMCC No. 6621菌株接種到表面消毒的油菜種子，培養(yǎng)45d后，在不含重金屬的培養(yǎng)基中，植物根長(zhǎng)、莖葉長(zhǎng)、鮮重、干重均明顯高于不接菌的對(duì)照處理。此外，含5、10mL Cd2+L4培養(yǎng)基雖然表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性,抑制了油菜的生長(zhǎng)。但在用RC6b菌浸種的處理中，植物的生物量也明顯高于不接菌的對(duì)照處理。實(shí)施例2 :紫金牛葉桿菌 RC6b (Phyllobacterium myrsinacearum RC6b CGMCCNo. 6621)的生物修復(fù)效應(yīng)I. I 供試土壤采自浙江某重金屬污染農(nóng)田土壤。土壤的基本理化性質(zhì)為pH 7. 3,有機(jī)質(zhì)16. Ogkg'銅全量 203. Omg kg'鋅全量 736. 2mg kg'鎘全量 5.9mg kg-1,鉛全量 153. 3mg kg'新鮮土壤樣品過(guò)2_篩后，于暗處4°C保存。I. 2培養(yǎng)基類型①Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基每升含5g酵母抽提物，IOg蛋白胨，IOgNaCl;②具ACC脫氨酶活性的促生菌分離培養(yǎng)基，即ADF培養(yǎng)基(IL)5Dworkin and Foster (DF)母液加ACC (終濃度為3nmol L—1)為唯一氮源的培養(yǎng)基，瓊脂20g，pH 7.2。DF母液每升含4gKH2PO4, 6g Na2HPO4, O. 2g MgSO4 · 7H20,0. OOlg FeSO4 · 7H20, 2g 葡萄糖，2g 葡萄糖酸，2g 檸檬酸，2g (NH4)2SO4，微量元素溶液O. ImL (其組成為100mL蒸餾水中溶解，124. 6mg ZnSO4,78. 2mg CuSO4, IOmg MoO3, IOmg H3BO3,11. 2mg MnSO4);③含重金屬的具 ACC 脫氨酶活性的促生菌分離培養(yǎng)基配制50mg Iiir1CdCl^ZnSO4和Pb (NO3)2儲(chǔ)液，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后加入上述配方的具ACC脫氨酶活性的促生菌分離培養(yǎng)基，制成重金屬濃度變化在50-4500mg Γ1 一系列培養(yǎng)基。I. 3供試菌株紫金牛葉桿菌RC6b (Phyllobacterium myrsinacearum RC6b CGMCC No. 6621)。I. 4菌液的制備在無(wú)菌條件下將菌株RC6b接種于LB液體培養(yǎng)基中，28°C下200r mirT1振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心后收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再用磷酸鹽緩沖液將菌液調(diào)節(jié)吸光度(0D600)至I備用，含菌量為I. 5 X IO8CFU mL—1。I. 5重金屬污染土壤的生物修復(fù)試驗(yàn)采自浙江淳安的伴礦景天幼苗，將野外植株移至溫室生長(zhǎng)繁殖，通過(guò)l/4Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液水培方式預(yù)培育新植株。一周后，選擇大小一致，長(zhǎng)勢(shì)良好的幼苗，備用。將幼苗于70%酒精中浸泡lmin，無(wú)菌水沖洗I次，再用3%NaC10浸泡3min，無(wú)菌水沖洗5-6次，備用。然后，將表面消毒的植物幼苗根部放入上述方法配置的I. 5X IO8Iiir1CFU的RC6b菌懸液中浸泡2h，移植到盛有750g上述重金屬污染土壤的花盆里，每盆6株植物幼苗，放置在生長(zhǎng)室中，25±5°C下，16/8晝/夜。以不加菌的處理作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。75d后，小心將植物從盆中移除，用滅菌的蒸餾水清洗植物根部3-5次，以除去根部附著的土壤。測(cè)定植物的干重，并用AAS測(cè)定植物根部及地上部分重金屬離子的總含量(鎘、鋅、鉛)。I. 6植物體內(nèi)重金屬的分析稱取O. 2g風(fēng)干后粉碎的植物樣于聚四氟乙烯燒杯中，加入HCl-HNO3 (優(yōu)級(jí)純，體積比4:1)消化，原子吸收分光光度計(jì)[Varian SpectrAA220FS (火焰)、220Z (石墨爐) ]測(cè)定植物體內(nèi)重金屬含量。同時(shí)做空白對(duì)照，并采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)GSS-4進(jìn)行分析質(zhì)量控制，測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度范圍內(nèi)。2. I植物重金屬吸收量的動(dòng)態(tài)變化植物修復(fù)效率最終取決于植物對(duì)重金屬吸收總量的大小。微生物對(duì)重金屬的植物吸收量的影響越大，在生物修復(fù)中就越能體現(xiàn)其價(jià)值。因此，微生物能否能顯著提高植物對(duì)重金屬的吸收是生物修復(fù)時(shí)選擇微生物最直接的標(biāo)準(zhǔn)。在植物修復(fù)過(guò)程中，接種紫金牛葉桿菌RC6b不僅可以大大促進(jìn)超富集植物伴礦景天的生長(zhǎng)，還可以顯著地提高植物對(duì)重金屬吸收量。圖7所示的是在生物修復(fù)過(guò)程中，接種紫金牛葉桿菌RC6b對(duì)超富集植物伴礦景天重金屬鎘、鋅、鉛吸收量的影響。從中可以看出，75d后，所有加菌的處理中植物對(duì)鎘、鋅、鉛的吸收量均明顯高于對(duì)照植物(P〈0. 05)，其中增幅最高的是鎘(138%)，其次是鋅(90%)和鉛(46%)。
權(quán)利要求
1.紫金牛葉桿菌myrsinacearum)RC6b,該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 6621。
2.權(quán)利要求I所述的紫金牛葉桿菌 jrs/aaceara )RC6b,該菌株在生物修復(fù)重金屬污染土壤中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的紫金牛葉桿菌(/%_F77oAaci6 ritt jrs/aaceara ) RC6b,該菌株在植物修復(fù)鎘、鋅、鉛污染土壤中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的紫金牛葉桿菌myrsinacearum)RC6b修復(fù)重金屬污染土壤的方法，其特征在于將RC6b CGMCC No. 6621菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；將上述菌懸液按土壤10% wt的接種量接入重金屬污染土壤中，28°C避光培養(yǎng)。
全文摘要
紫金牛葉桿菌RC6b及其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用，該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.6621。該根際促生菌具有較強(qiáng)的重金屬抗耐性和吸附能力，可以顯著地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，降低重金屬對(duì)植物的毒性，同時(shí)提高土壤中重金屬的植物有效性。因此，可直接用于提高植物修復(fù)效率，并且在重金屬污染土壤的生物修復(fù)中具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102911900SQ20121041295
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者馬瑩, 駱永明, 滕應(yīng), 李振高 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所