專利名稱：一種紅球菌及其菌劑與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅球菌，還涉及利用該紅球菌生產(chǎn)的微生物菌劑，以及所述紅球 菌及其菌劑在含鉻(VI)工業(yè)廢水中降解有毒有機(jī)物質(zhì)與廢水處理上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
吡啶、苯酚及其衍生物是重要的化工原料，也是焦化廢水、印染廢水、制革廢水等 工業(yè)廢水的主要成分，研究發(fā)現(xiàn)這些化合物對(duì)人類和環(huán)境生物均具有較大的危害。鉻(VI) 的存在，不但會(huì)對(duì)人、環(huán)境產(chǎn)生直接危害，還會(huì)抑制環(huán)境生物去除有機(jī)污染物的能力，一般 的生物治理很難使含有上述成分的廢水的出水達(dá)標(biāo)排放。微生物因具有強(qiáng)大的降解功能和 較強(qiáng)的適應(yīng)性，而經(jīng)常被用做環(huán)境污染修復(fù)的重要工具。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種對(duì)有毒有機(jī)物質(zhì)具有降解作用以及對(duì)工業(yè)廢水具 有較好處理效果的紅球菌。本發(fā)明的目的之二是提供一種利用上述紅球菌生產(chǎn)的微生物菌劑。本發(fā)明的目的之三是提供上述紅球菌和菌劑在含有鉻(VI)的條件下或不含有鉻 (VI)的條件下對(duì)有毒有機(jī)物質(zhì)降解上的應(yīng)用，以及在含鉻(VI)工業(yè)廢水處理上的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供的紅球菌(Rhodococcus sp. )BZ_9，以下簡(jiǎn)稱為紅球菌BZ-9，已于 2010年3月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 3695。本發(fā)明的紅球菌BZ-9的形態(tài)特征菌體為短桿狀。本發(fā)明的紅球菌BZ-9的生理生化特征革蘭氏染色陽(yáng)性菌(革蘭氏染色陽(yáng)性)； 脲酶、接觸酶陽(yáng)性，氧化酶、VP反應(yīng)和甲基紅反應(yīng)陰性；在LB固體培養(yǎng)基(成分如下酵母 膏5g/L，蛋白胨10g/L, NaCl 10g/L, pH7. 0-7. 2)上生長(zhǎng)3天后，菌落大小約2_3mm，淺橘黃 色，菌落凸起，邊緣不規(guī)則，菌落表面干燥、粗糙，不透明。本發(fā)明還公開(kāi)了利用上述紅球菌BZ-9生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為紅球菌 BZ-9菌體。所述微生物菌劑的制備方法如下所述生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品，所述產(chǎn)品的包裝 劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。所述菌劑的制備具體可采用如下步驟1、斜面種將菌株BZ_9(原種)在培養(yǎng)皿上活化，并測(cè)定降解性能，接種于試管斜 面上備用。2、搖瓶種將試管種接種于200ml肉湯培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為牛肉膏0. 3克、蛋 白胨1. 0克、NaCl 0. 5克、水100毫升，pH 7. 0 7. 2)中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，準(zhǔn)備接種種子罐。3、種子罐配制發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為葡萄糖0.8%、(NH4)2 S041%, K2HP04 0. 2%, MgS04 0 . 05%, NaCl 0. 01%, CaC03 0. 3%、酵母膏 0. 02%，其余為水，pH 值 7. 2-7. 5)，將400L發(fā)酵培養(yǎng)基加入500L種子罐，121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，將搖 瓶菌種按10% (體積百分含量)的接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，攪拌速度為 220轉(zhuǎn)/分，無(wú)菌空氣通入量為1 0.8(體積比)。4、生產(chǎn)罐生產(chǎn)罐(生產(chǎn)罐容量5噸)所用培養(yǎng)基成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同(投料量 4. 5噸)，投料后的生產(chǎn)罐在1. lkg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C 以下，通無(wú)菌空氣保持無(wú)菌狀態(tài)備用；將到達(dá)對(duì)數(shù)期的種子液按10% (體積百分含量)的 接種量接入生產(chǎn)罐，接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30-35°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的 通氣量為1 (0. 6-1. 2)(體積比)，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分(可優(yōu)選為240轉(zhuǎn)/分)， 整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)；發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。5、產(chǎn)品發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采 用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。本發(fā)明提供的紅球菌BZ-9及其菌劑對(duì)工業(yè)廢水中的有毒有害物質(zhì)及鉻(VI)具 有較強(qiáng)的抗性和適應(yīng)性，具有較廣的降解譜，能夠降解吡啶、3-羥基吡啶、苯酚等化合物，能 使吡啶、苯酚的降解率達(dá)到95%以上，3-羥基吡啶的降解率達(dá)到50%以上，特別是在含鉻 (VI)的條件下，對(duì)吡啶、3-羥基吡啶、苯酚也具有較好的降解效果。本發(fā)明的微生物菌劑為 新型的芳香族有機(jī)污染物降解菌劑，具有生產(chǎn)使用成本低、使用方便、較廣的降解譜、去除 效果好的優(yōu)點(diǎn)，可以使制革廢水等廢水中的苯酚的降解率達(dá)到95%以上。本發(fā)明提供的菌 株和菌劑可用于降解工業(yè)廢水中的有機(jī)有毒成分處理，適用于現(xiàn)代工業(yè)廢水如焦化廢水、 制革廢水、印染廢水等含鉻(VI)(或不含鉻)廢水以及其它石油化工生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的含 有苯酚、3-羥基吡啶和吡啶的有機(jī)廢水的處理，可以保證工業(yè)廢水中的苯酚和吡啶等有機(jī) 物殘留含量符合廢水排放標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明成功地解決了工業(yè)廢水處理過(guò)程中的苯酚及其衍生 物或其它雜環(huán)化合物去除效果不高的問(wèn)題，降低了生產(chǎn)和使用過(guò)程中的工作量，降低了生 產(chǎn)和使用成本，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人民的身體健康具有重要的意義。保藏信息本發(fā)明提供的紅球菌(Rhodococcus sp. ) BZ_9，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 3695，保藏日期為2010年3月26日。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中 的“ ％ ”，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。降解率=(1-反應(yīng)結(jié)束時(shí)化合物的量/反應(yīng)起始時(shí)化合物的量)X 100%?；A(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中各個(gè)有機(jī)物的濃度測(cè)定方法取0. 5ml液體，加入等體積的 甲醇(充分振蕩，使化合物溶解)，用0. 22 y m的微孔濾膜過(guò)濾后使用配備有紫外檢測(cè)器的
4高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)條件如下；色譜柱，C18反相柱(4. 6mmX 150mm, 5陽(yáng))；流動(dòng) 相，甲醇水=5 2(體積比)；流速為0.7ml/min;上樣量為20iU ；各化合物的檢測(cè)(定 量)波長(zhǎng)吡啶，257nm ；3-羥基吡啶，276nm ；苯酚，271nm。濃度定量采用外標(biāo)法。焦化廢水(或制革廢水)中苯酚和吡啶的濃度測(cè)定方法取0. 5ml液體，加入等體 積的甲醇(充分振蕩)，用0. 22 y m的微孔濾膜過(guò)濾后使用配備有紫外檢測(cè)器的高效液相色 譜進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)條件如下；色譜柱，C18反相柱(4. 6mmX150mm,5um)；流動(dòng)相，甲醇與水 的初始體積比為2 5，在15min內(nèi)勻速調(diào)整為5 2，維持2min后調(diào)整到初始比；流速為 0. 7ml/min ；上樣量為20 yl ；各化合物的檢測(cè)(定量)波長(zhǎng)如下苯酚，271nm ；吡啶，257nm。 濃度定量采用外標(biāo)法。制革廢水中的鉻(VI)濃度測(cè)定采用二苯碳酰二胼分光光度法(GB 7467-87)。實(shí)施例1 紅球菌BZ-9的獲得及鑒定一、紅球菌BZ-9的獲得取2009年12月從山東濱州制革廠廢水中取得的活性污泥2g加入到含有吡啶、苯 酚的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，稀釋后在含吡啶、苯酚的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基平板上涂 布，再培養(yǎng)7天后，挑取單菌落劃線純化后保存?；A(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基成分:NaCl1. 0g、NH4N03 1. 0g、K2HP04 1. 5g、KH2P04 0. 5g 和 MgS04 7H20 0. 2g，用水定容至1L，pH為7. 0左右。二、紅球菌BZ-9的鑒定(1)形態(tài)特征菌體為短桿狀。(2)生理生化特征革蘭氏染色陽(yáng)性菌(革蘭氏染色陽(yáng)性)；脲酶、接觸酶陽(yáng)性，氧 化酶、VP反應(yīng)和甲基紅反應(yīng)陰性；在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3天后，菌落大小約2-3mm，淺橘 黃色，菌落凸起，邊緣不規(guī)則，菌落表面干燥、粗糙，不透明。(3) 16S rDNA 序列鑒定采用如下引物8F(5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘ )，1492 (5 ‘ -TACCTTGTTA CGACTT-3')，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從菌株BZ-9中擴(kuò)增到16S rDNA基因片段，將所獲得16S rDNA 克隆到pGEM T-easy載體后送北京諾塞基因組研究中心有限公司測(cè)序。16S rDNA的部分序 列見(jiàn)序列表,與GenBank中的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BZ-9的16S rDNA序列與Rhodococcus屬部分 菌株序列的同源性高于99%.三、紅球菌BZ-9的保藏通過(guò)以上鑒定結(jié)果，確認(rèn)上述菌株為來(lái)自于紅球菌屬(Rhodococcus sp.)的細(xì)菌， 將其命名為BZ-9，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.3695。實(shí)施例2 紅球菌BZ-9在含鉻(VI)的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基對(duì)不同化合物的降解挑取紅球菌BZ-9單菌落于3ml LB液體培養(yǎng)基中，30°C、165轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24小 時(shí)，獲得新鮮菌液。在100ml溶液A (或溶液B或溶液C)中，接入2ml新鮮菌液，30°C搖床培養(yǎng)(170 轉(zhuǎn)/分)，3天后(72小時(shí))取樣測(cè)定化合物的降解率。溶液A的制備方法將苯酚加入基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中，苯酚的終濃度為100mg/L， 添加鉻(VI)，使鉻的終濃度為20mg/L。
溶液B的制備方法將3-羥基吡啶加入基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中，3-羥基吡啶的終濃 度為100mg/L，添加鉻(VI)，使鉻的終濃度為20mg/L。溶液C的制備方法將吡啶加入基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中，吡啶的終濃度為100mg/L， 添加鉻(VI)，使鉻的終濃度為20mg/L。降解結(jié)果見(jiàn)表1。表1紅球菌BZ-9對(duì)不同化合物的降解率 實(shí)施例3 紅球菌BZ-9在制革廢水中對(duì)不同化合物的降解挑取紅球菌BZ-9單菌落于3ml LB液體培養(yǎng)基中，30°C、165轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24小 時(shí)，獲得新鮮菌液。量取100ml含鉻(VI)廢水，其中鉻(VI)濃度為2mg/l，檢測(cè)其中苯酚濃度添加量。 苯酚的濃度為100mg/L。接入2ml新鮮菌液，混勻，置于30°C，165轉(zhuǎn)/分的搖床培養(yǎng)，4天后(96小時(shí))取 樣測(cè)定化合物的降解率。結(jié)果見(jiàn)表2。表2紅球菌BZ-9在制革廢水中對(duì)不同化合物的去除
底物苯酚鉻(VI)還原降解率(% )100> 75實(shí)施例4 紅球菌BZ-9在焦化廢水中對(duì)不同化合物的降解挑取紅球菌BZ-9單菌落于3ml LB液體培養(yǎng)基中，30°C、165轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24小 時(shí)，獲得新鮮菌液。量取100ml焦化廢水，苯酚的濃度為400 士 10mg/L ；添加吡啶使其濃度為 100士5mg/L。接入2ml新鮮菌液，混勻，置于30°C，165轉(zhuǎn)/分的搖床培養(yǎng)，4天后(96小時(shí))取 樣測(cè)定化合物的降解率。結(jié)果見(jiàn)表3。表3紅球菌BZ-9在焦化廢水中對(duì)不同化合物的降解率 由上實(shí)施例可見(jiàn)，本發(fā)明提供的紅球菌BZ-9及其菌劑對(duì)工業(yè)廢水中的有毒有害 物質(zhì)及鉻(VI)具有較強(qiáng)的抗性和適應(yīng)性，具有較廣的降解譜，能夠同時(shí)降解吡啶、3-羥基 吡啶、苯酚等化合物，能使吡啶、苯酚的降解率達(dá)到95%以上，3-羥基吡啶的降解率達(dá)到 50%以上。可以保證工業(yè)廢水中的苯酚和吡啶等有機(jī)物殘留含量符合廢水排放標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明成功地解決了在工業(yè)廢水處理過(guò)程中的苯酚及其衍生物或其它雜環(huán)化合物去除效果 不高的問(wèn)題，降低了生產(chǎn)和使用過(guò)程中的工作量，降低了生產(chǎn)和使用成本，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán) 境，保護(hù)人民的身體健康具有重要的意義。 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明權(quán)利要求范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明權(quán)利要求的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
一種紅球菌(Rhodococcus sp.)BZ-9，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.3695。
2.利用權(quán)利要求1所述的紅球菌BZ-9生產(chǎn)的微生物菌劑，其特征在于其活性成分為紅 球菌BZ-9菌體。
3.權(quán)利要求1所述的紅球菌BZ-9在降解有毒有機(jī)物質(zhì)中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的紅球菌BZ-9在降解有毒有機(jī)物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于所 述有毒有機(jī)物質(zhì)為苯酚或吡啶或3-羥基吡啶，所述有毒有機(jī)物質(zhì)與鉻(VI)共存或不與鉻 (VI)共存。
5.權(quán)利要求1所述的紅球菌BZ-9在工業(yè)廢水處理中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的紅球菌BZ-9在廢水處理中的應(yīng)用，其特征在于所述廢水為焦 化廢水或含鉻(VI)制革廢水或印染廢水。
7.權(quán)利要求2所述的菌劑在降解有毒有機(jī)物質(zhì)中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的菌劑在降解有毒有機(jī)物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于所述有毒有 機(jī)物質(zhì)為苯酚或或吡啶3-羥基吡啶，所述有毒有機(jī)物質(zhì)與鉻(VI)共存或不與鉻(VI)共存。
9.權(quán)利要求2所述的菌劑在工業(yè)廢水處理中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的菌劑在廢水處理中的應(yīng)用，其特征在于所述廢水為焦化廢水 或含鉻(VI)的制革廢水或印染廢水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)的紅球菌(Rhodococcus sp.)BZ-9保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.3695。本發(fā)明還公開(kāi)了一種微生物菌劑，其活性成分為紅球菌BZ-9。本發(fā)明提供的紅球菌BZ-9及其菌劑對(duì)多種有毒有機(jī)物質(zhì)具有高效降解性能，在有鉻(VI)的條件下也有很高的降解能力，適用于焦化廢水、制革廢水、印染廢水以及其它石油化工生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的含有苯酚和吡啶等有毒有機(jī)物質(zhì)的有機(jī)廢水的處理。
文檔編號(hào)C02F101/38GK101857846SQ20101015603
公開(kāi)日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者劉偉強(qiáng), 吳曉磊, 周湧, 孫紀(jì)全, 徐蓮, 湯岳琴, 趙晶晶, 陳福明 申請(qǐng)人:深圳清華大學(xué)研究院