本發(fā)明屬于發(fā)光材料應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
上轉(zhuǎn)換熒光材料作為標(biāo)記物在生物領(lǐng)域中已得到一定程度的應(yīng)用，其獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性使得生物檢測(cè)技術(shù)具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速、可定性定量等優(yōu)點(diǎn)。但這種傳統(tǒng)的直接激發(fā)發(fā)射模式，使得檢測(cè)過(guò)程必需依賴固相材料等手段實(shí)現(xiàn)未與檢測(cè)物結(jié)合的游離標(biāo)記物的徹底分離，否則任何殘留的游離標(biāo)記物均會(huì)成為假陽(yáng)性信號(hào)的來(lái)源。專利200410034105.5，200410034104.0，200420049580.5對(duì)生物領(lǐng)域中上轉(zhuǎn)換熒光材料應(yīng)用方法已有充分的介紹。
免疫磁珠(Immunomagneticbeads，IMB)，是由載體微球和免疫配基結(jié)合而成的一種納米級(jí)材料。免疫磁珠分離技術(shù)是以高均一性的磁性微球?yàn)楣滔嘀С治铮瑢⒚庖吲浠?如抗體，抗原等)通過(guò)功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體上形成免疫磁性微球，利用特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，在磁力作用下，發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，從混合溶液中分離出特異性的靶物質(zhì)。具有分離速度快，效率高，可重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備。
本發(fā)明的一種具有核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，是一種發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換納米材料與具有免疫性能的磁珠材料的復(fù)合結(jié)構(gòu)，由近紅外激光激發(fā)產(chǎn)生藍(lán)色發(fā)光。在待檢樣品的溶液中加入具有核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，免疫配基(如抗體，抗原等)通過(guò)功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體上形成免疫磁性微球，利用特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，在磁力作用下，發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，從混合溶液中分離檢測(cè)靶物質(zhì)，并通過(guò)紅外熒光量子點(diǎn)加入，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)自我認(rèn)證，逆向校驗(yàn)。在實(shí)際應(yīng)用中無(wú)需后續(xù)的任何分離操作，只需將待檢樣品與復(fù)合材料混合即可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快捷的定性定量檢測(cè)。同時(shí)，在反應(yīng)過(guò)程中可隨時(shí)對(duì)可見(jiàn)光進(jìn)行檢測(cè)，以監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)進(jìn)行的速度與程度，滿足應(yīng)用研究與基礎(chǔ)研究的不同需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一種具有核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的復(fù)合制備方法；它包括：發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換納米材料與具有免疫性能的磁珠組成的核殼結(jié)構(gòu)；上述材料表面分別使用溶膠-凝膠法修飾處理可在顆粒表面形成不同的基團(tuán)，有利于共價(jià)結(jié)合不同的免疫配基(如酶、細(xì)胞、抗體、抗原、DNA、RNA) 等物活性物質(zhì)；以紅外上轉(zhuǎn)換納米材料為復(fù)合材料的核結(jié)構(gòu)，以免疫磁珠為復(fù)合材料的殼層結(jié)構(gòu)，以去離子水為分散液配置15%-30%的上轉(zhuǎn)換納米材料的溶液，然后加入1%-15%的免疫磁珠，在室溫條件下通過(guò)化學(xué)水熱反應(yīng)合成具有核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，用于生物檢測(cè)。
本發(fā)明中的發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料制備方法為，含有Y、Gd、La的氟化物材料中的一種或一種以上混合物為基質(zhì)材料，在基質(zhì)材料中加入45-50%重量比的YbF3，同時(shí)在基質(zhì)材料中加入12-25%重量比TmF3，均勻混合后，在氬氣中于300-450度燒結(jié)1-6小時(shí)，制備出有藍(lán)色發(fā)光的紅外上轉(zhuǎn)換熒光顆粒材料，其在980nm激光激發(fā)，可產(chǎn)生440-480nm藍(lán)色發(fā)光，顆粒度在70-800nm。制備過(guò)程中氬氣可以有效阻止材料被氧化，改善發(fā)光效率與控制色純度；低溫度可以抑制顆粒的生長(zhǎng)。以3-氨丙基三甲氧基硅烷為表面硅烷化材料，以戊二醛為表面醛基化材料，在紅外上轉(zhuǎn)換納米材料表面使用溶膠-凝膠法修飾處理，使材料表面經(jīng)過(guò)硅烷化和醛基化處理后其表面適合連接不同的生物活性物質(zhì)，有利于在顆粒表面鏈接其他不同基團(tuán)有利于免疫磁珠顆粒在表面的吸附。
本發(fā)明中的具有免疫性能的磁珠材料制備方法是 ：以硫代乙醇為穩(wěn)定劑，配置濃度為15%的穩(wěn)定液然后在600C下恒溫?cái)嚢?，將Fe2+與Fe3+按2：3的摩爾比加入穩(wěn)定液中，然后加入NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為堿性，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，制備黑色的四氧化三鐵納米磁性顆粒。以油酸為表面羧基化原料，以高錳酸鉀催化劑，使用溶膠-凝膠法修飾處理具有免疫性能的磁珠材料表面，在合成的納米磁珠表面進(jìn)行羧基化處理后可在顆粒表面形成羧基，可共價(jià)結(jié)合不同的免疫配基(如酶、細(xì)胞、抗體、抗原、DNA、RNA) 等物活性物質(zhì)，可用于生物檢測(cè)。量子點(diǎn)熒光材料顆粒通常為1-10納米，其可以在磁珠材料制備階段加入，或者在磁珠材料與上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料成殼階段加入混合。
本發(fā)明中的發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換納米材料與具有免疫性能的磁珠組成的核殼結(jié)構(gòu)材料表面加入硫化鉛紅外熒光量子點(diǎn)，硫化鉛紅外熒光量子點(diǎn)吸收可見(jiàn)光，發(fā)射近紅外光，并被上轉(zhuǎn)換納米材料吸收?；蛘哂煽梢?jiàn)光激發(fā)，由上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料發(fā)射出另一波段可見(jiàn)光。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了可見(jiàn)光、紅外光相互激發(fā)轉(zhuǎn)換，使得用于生物多樣性檢測(cè)時(shí)更加準(zhǔn)確快捷唯一，并達(dá)到試劑檢測(cè)自我認(rèn)證，逆向校驗(yàn)，并可以在混合中被磁珠分離。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中的發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料制備方法為：含有Y、Gd、La的氟化物材料中的一種或一種以上混合物是基質(zhì)材料，在基質(zhì)材料中加入45-50%重量比的YbF3，同時(shí)加入12-25%重量比TmF3，在氬氣中于300-450度燒結(jié)1-6小時(shí)，制備出藍(lán)色發(fā)光的紅外上轉(zhuǎn)換熒光微顆粒材料，其由980nm激光激發(fā)，可發(fā)出440-480nm藍(lán)色發(fā)光，顆粒在70-800nm。當(dāng)燒結(jié)溫度低于350度，時(shí)間低于2小時(shí)，可以制備出直徑平均在100 nm以下的顆粒，其發(fā)光強(qiáng)度較弱；當(dāng)燒結(jié)溫度大于400度，時(shí)間大于4小時(shí)，材料成為塊狀，經(jīng)粉碎后可以制備出直徑平均在700 nm以上的顆粒，其發(fā)光強(qiáng)度較強(qiáng)；燒結(jié)過(guò)程應(yīng)在氬氣保護(hù)氣氛中進(jìn)行，制備過(guò)程中氬氣可以有效阻止材料被氧化，改善發(fā)光效率與控制色純度；低溫度可以抑制顆粒的生長(zhǎng)。
本發(fā)明中的具有免疫性能的磁珠材料制備方法是 ：以硫代乙醇為穩(wěn)定劑，配置濃度為15%的穩(wěn)定液然后在600C下恒溫?cái)嚢?，將Fe2+與Fe3+按2：3的摩爾比加入穩(wěn)定液中，然后加入NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系為堿性，室溫下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，制備出粒度在30nm—50nm的黑色的四氧化三鐵納米磁性顆粒。
本發(fā)明中的紅外上轉(zhuǎn)換納米材料表面使用溶膠-凝膠法修飾處理，以乙二醇為分散劑，配制成30%的的上轉(zhuǎn)換納米材料分散體系，然后加入1%-3%的3-氨丙基三甲氧基硅烷為表面硅烷化材料，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下在600C下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)10小時(shí)，反應(yīng)完成后用無(wú)水乙醇清洗至中性，然后加入0.5%——1%的戊二醛為表面醛基化材料，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，在室溫下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，然后用去離子水洗至中性，在室溫下晾干備用；使材料表面經(jīng)過(guò)硅烷化和醛基化處理后其表面適合連接不同的生物活性物質(zhì)，有利于在顆粒表面鏈接其他不同基團(tuán)有利于免疫磁珠顆粒在表面的吸附。
本發(fā)明中的具有免疫性能的磁珠材料表面使用溶膠-凝膠法修飾處理，以去離子水為分散劑，配制成10%—25%的分散體系，然后加入2%—4%的油酸為表面羧基化原料，在700C下持續(xù)攪拌1小時(shí)，然后用無(wú)水乙醇清洗2遍以清洗多余的油酸，最后用去離子水洗滌至中性，最后加入0.5%的高錳酸鉀催化劑，在超聲清洗儀中超聲震蕩8小時(shí)，完成后水洗3遍，然后在室溫下自然晾干。在合成的納米磁珠表面進(jìn)行羧基化處理后可在顆粒表面形成羧基，可共價(jià)結(jié)合不同的免疫配基(如酶、細(xì)胞、抗體、抗原、DNA、RNA) 等物活性物質(zhì)，可用于生物檢測(cè)。
本發(fā)明中的上述材料表面分別使用溶膠-凝膠法修飾處理可在顆粒表面形成不同的基團(tuán)，有利于共價(jià)結(jié)合不同的免疫配基(如酶、細(xì)胞、抗體、抗原、DNA、RNA) 等物活性物質(zhì)；以紅外上轉(zhuǎn)換納米材料為復(fù)合材料的核結(jié)構(gòu)，以免疫磁珠為復(fù)合材料的殼層結(jié)構(gòu)，以去離子水為分散液配置15%-30%的上轉(zhuǎn)換納米材料的溶液，然后加入1%-15%的免疫磁珠，在室溫條件下通過(guò)化學(xué)水熱反應(yīng)合成具有核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，用于生物檢測(cè)。
本發(fā)明中的硫化鉛紅外熒光量子點(diǎn)使用水熱法制備，顆粒度2-10納米，發(fā)射光900-1500納米，吸收光紫外與可見(jiàn)光，發(fā)射出大于吸收光的近紅外光，并被上轉(zhuǎn)換納米材料吸收?；蛘哂煽梢?jiàn)光激發(fā)，由上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料發(fā)射出另一波段可見(jiàn)光。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了可見(jiàn)光、紅外光相互激發(fā)轉(zhuǎn)換，使得用于生物多樣性檢測(cè)時(shí)更加準(zhǔn)確快捷唯一，并達(dá)到試劑檢測(cè)自我認(rèn)證，逆向校驗(yàn)。如使用綠光激發(fā)紅外量子點(diǎn)材料，其發(fā)射出900-1000納米紅外光，并被發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換納米材料吸收，發(fā)射出藍(lán)光，則形成綠光、紅外光、藍(lán)光相互轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)
利用特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，在磁力作用下，發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，從混合溶液中分離檢測(cè)靶物質(zhì)。簡(jiǎn)化了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的操作流程，并縮短的檢測(cè)時(shí)間。
在實(shí)際應(yīng)用中無(wú)需后續(xù)的任何分離操作，只需將待檢樣品與復(fù)合材料混合即可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快捷的定性定量檢測(cè)。同時(shí)，在反應(yīng)過(guò)程中可隨時(shí)對(duì)可見(jiàn)光進(jìn)行檢測(cè)，以監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)進(jìn)行的速度與程度。
生產(chǎn)簡(jiǎn)單，容易批量生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化。
具體實(shí)施例
實(shí)施例1
制備發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料：取YF390g，GdF310g，加入YbF345g，TmF313g，在氬氣保護(hù)中于4000C燒結(jié)2小時(shí)，制備出的紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料在980nm激光激發(fā)，可發(fā)出450nm藍(lán)色發(fā)光，顆粒在100nm。
取出以上紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料30g加入三口燒瓶?jī)?nèi)，然后加入100ml乙二醇攪拌分散均勻，然后加入0.5g的3-氨丙基三甲氧基硅烷為表面硅烷化材料，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下在600C下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)10小時(shí)，反應(yīng)完成后用無(wú)水乙醇清洗至中性，然后用去離子水稀釋至100ml，然后加入0.2g的戊二醛為表面醛基化材料，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，在室溫下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，然后用去離子水洗至中性，在室溫下晾干備用，得到表面醛基化的上轉(zhuǎn)換納米材料。
制備具有免疫性能的磁珠的制備：取15g硫代乙醇然后加入100ml去離子水，在燒杯中配制成穩(wěn)定液，然后分別加入0.8mol/L的Fe3+溶液90ml和0.8mol/L的Fe2+溶液60ml，攪拌30min，混合均勻；最后加入1mol/L的NaOH溶液300ml，在室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，最后用去離子水清洗至中性，得到30nm的磁珠顆粒。
取制得的磁珠顆粒15g，然后加入100ml離子水配制成分散體溶液，然后緩慢加入0.5g的油酸，在700C下持續(xù)攪拌1小時(shí)，然后用無(wú)水乙醇清洗2遍以清洗多余的油酸，最后用去離子水洗滌至中性，然后用去離子水配制成100ml的溶液，最后加入0.1g的高錳酸鉀，在超聲清洗儀中超聲震蕩8小時(shí)，超聲完成后水洗3遍，然后在室溫下自然晾干，得到表面羧基化的納米磁珠顆粒。
制備核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換材料：首先取30g表面醛基化的上轉(zhuǎn)換納米材料，然后加入150ml去離子水配制成分散體系，然后加入3.0g表面羧基化的納米磁珠顆粒，在室溫條件下通過(guò)化學(xué)水熱反應(yīng)合成具有核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料。然后在用去離子水清洗至中性，最后在00C—100C下冷藏保存。
實(shí)施例2
制備發(fā)藍(lán)光的紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料：取YF3 100克，加入YbF3 50克， TmF3 20克，在氬氣中于450度燒結(jié)5小時(shí)，制備出的紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料研磨分碎， 在980nm激光激發(fā)下，可產(chǎn)生470nm藍(lán)色發(fā)光，顆粒在800nm。
取出以上紅外上轉(zhuǎn)換熒光材料15g加入三口燒瓶?jī)?nèi)，然后加入100ml乙二醇攪拌分散均勻，然后加入0.2g的3-氨丙基三甲氧基硅烷為表面硅烷化材料，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下在600C下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)10小時(shí)，反應(yīng)完成后用無(wú)水乙醇清洗至中性，然后用去離子水稀釋至100ml，然后加入0.15g的戊二醛為表面醛基化材料，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，在室溫下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，然后用去離子水洗至中性，在室溫下晾干備用，得到表面醛基化的上轉(zhuǎn)換納米材料。
制備具有免疫性能的磁珠的制備：取30g硫代乙醇然后加入200ml去離子水，在燒杯中配制成穩(wěn)定液，然后分別加入0.8mol/L的Fe3+溶液150ml和0.8mol/L的Fe2+溶液100ml，攪拌30min，混合均勻；最后加入1mol/L的NaOH溶液500ml，在室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，最后用去離子水清洗至中性，得到50nm的磁珠顆粒。
取制得的磁珠顆粒30g，然后加入200ml離子水配制成分散體溶液，然后緩慢加入1.2g的油酸，在700C下持續(xù)攪拌2小時(shí)，然后用無(wú)水乙醇清洗2遍以清洗多余的油酸，最后用去離子水洗滌至中性，然后用去離子水配制成200ml的溶液，最后加入0.3g的高錳酸鉀，在超聲清洗儀中超聲震蕩10小時(shí)，超聲完成后水洗3遍，然后在室溫下自然晾干，得到表面羧基化的納米磁珠顆粒。
制備核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換材料：首先取50g表面醛基化的上轉(zhuǎn)換納米材料，然后加入150ml去離子水配制成分散體系，然后加入6.0g表面羧基化的納米磁珠顆粒，在室溫條件下通過(guò)化學(xué)水熱反應(yīng)合成具有核殼結(jié)構(gòu)的免疫磁性納米上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料。然后在用去離子水清洗至中性，最后在00C—100C下冷藏保存。
在上面針對(duì)本發(fā)明較好的實(shí)施方式作了舉例說(shuō)明后，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)應(yīng)明白的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對(duì)本發(fā)明所作的任何改變和改進(jìn)都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。