硼酸衍生物功能化熒光探針在檢測(cè)5?羥甲基胞嘧啶中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于DNA中5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可特異性識(shí)別順式二羥基結(jié)構(gòu)的2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)功能化熒光復(fù)合物傳感材料(PBAQA-P_GMA)在檢測(cè)DNA鏈中5hmC的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

5-甲基胞嘧啶(5mC)在調(diào)控基因表達(dá)、基因組印記和X染色體失活中起著至關(guān)重要的作用。近來發(fā)現(xiàn)，5mC在TET(ten eleven translocation)家族雙加氧酶Fe²⁺/α-酮戊二酸的催化作用下可以被氧化為5hmC。5hmC作為一種1952年被發(fā)現(xiàn)至2009年才被再次發(fā)現(xiàn)進(jìn)而得到廣泛研究的新型胞嘧啶變異體，目前已經(jīng)被公認(rèn)為是繼5mC之后的第六種堿基。該堿基在生物生理學(xué)過程中有著至關(guān)重要的作用。研究證明，5hmC是DNA去甲基化過程的重要中間產(chǎn)物，它可能是一種可以獨(dú)立存在較穩(wěn)定的表觀遺傳修飾。研究還發(fā)現(xiàn)，在一些癌癥諸如肺癌、腦癌、肝癌、腎癌、皮膚癌、前列腺癌中5hmC的含量明顯下降，證明其在癌癥發(fā)展過程中扮演者重要的角色。除此之外，5hmC在亨廷頓舞蹈癥、骨髓增生異常綜合癥、阿爾茲海默癥這些疾病中的分布也表現(xiàn)出異常。這些發(fā)現(xiàn)均預(yù)示5hmC將可能成為一種疾病診斷、處理和治療的新興生物學(xué)標(biāo)志。

目前很多特定的技術(shù)已經(jīng)被用于檢測(cè)組織中的5hmC，包括薄層色譜法、高效液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜法、同位素標(biāo)記法、抗原抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)等，但這些方法存在一些無法克服的缺點(diǎn)，比如需要用到放射性元素，無論是對(duì)人體還是環(huán)境都有害，檢測(cè)儀器昂貴，操作繁瑣等?；诖酥饾u出現(xiàn)了光譜法檢測(cè)5hmC，如：將5hmC中的羥甲基氧化為醛基，通過醛基將一些熒光基團(tuán)標(biāo)記到DNA鏈上進(jìn)行熒光檢測(cè)；氧化后通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法進(jìn)行熒光檢測(cè)；通過糖基化反應(yīng)將含有疊氮基團(tuán)的糖基轉(zhuǎn)移到5hmC DNA鏈上，通過生物素標(biāo)記、鏈霉親和素標(biāo)記法進(jìn)行熒光標(biāo)記等。但這些熒光方法需要至少兩步提純過程，從而增大了DNA的損失率，而且操作過程繁瑣，有些難以避免背景因素干擾。

公開號(hào)為CN 104483295A的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種基于硼酸衍生物功能化熒光探針檢測(cè)糖蛋白等二醇類物質(zhì)的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為硼酸衍生物功能化熒光探針提供一種新的應(yīng)用。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：硼酸衍生物功能化熒光探針在檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶中的應(yīng)用，所述硼酸衍生物功能化熒光探針是表面固載2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯納米微球，其中聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯納米微球的粒徑為150～400nm。

上述硼酸衍生物功能化熒光探針的制備方法為：將聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯納米微球(P_GMA)溶解于蒸餾水中，并加入過量乙二胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，80℃反應(yīng)完全后，離心、洗滌、干燥，得到氨基功能化的P_GMA；將氨基功能化的P_GMA分散于無水乙醇中，并依次加入2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，其中氨基功能化的P_GMA與PBAQA、EDC、NHS的摩爾量比為4:4:9:9，超聲分散均勻，40℃反應(yīng)完全后，離心分離，產(chǎn)物依次用超純水、無水乙醇和乙腈洗滌，自然干燥，得到表面固載2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯納米微球(PBAQA-P_GMA)，即硼酸衍生物功能化熒光探針。

上述的硼酸衍生物功能化熒光探針在檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶中的應(yīng)用，具體檢測(cè)方法由下述步驟組成：

1、將5-羥甲基化胞嘧啶DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品與尿苷二磷酸葡萄糖在T4β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，25～37℃反應(yīng)1～2小時(shí)，分離提純產(chǎn)物，得到5-糖基化胞嘧啶DNA。

2、將硼酸衍生物功能化熒光探針與5-糖基化胞嘧啶DNA加入pH＝7.4的磷酸緩沖液中，室溫震蕩反應(yīng)，用熒光光譜儀測(cè)量不同濃度5-糖基化胞嘧啶DNA對(duì)應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，繪制F-F₀值隨5-糖基化胞嘧啶DNA濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、按照步驟2的方法用熒光光譜儀測(cè)量待測(cè)DNA樣品的熒光強(qiáng)度，根據(jù)待測(cè)DNA樣品的F-F₀值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可高選擇性識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶DNA并確定待測(cè)DNA樣品中5-羥甲基胞嘧啶的含量。

上述步驟2中，優(yōu)選磷酸緩沖液中硼酸衍生物功能化熒光探針的初始濃度為0.2～1mg/mL。

本發(fā)明將PBAQA通過EDC/NHS接枝到氨基功能化的P_GMA表面，從而得到兼具熒光性質(zhì)和特異性識(shí)別二醇物質(zhì)的硼酸衍生物功能化熒光探針，該熒光探針能夠特異性吸附糖基化后的5-羥甲基胞嘧啶，既解決了DNA序列中胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶由于結(jié)構(gòu)相似難以區(qū)分檢測(cè)的問題，又為光譜法檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶提供了新方法，且該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，克服了已有方法測(cè)量?jī)x器復(fù)雜、昂貴、操作繁瑣等弊端，同時(shí)與其他一些檢測(cè)方法相比還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)5-糖基化胞嘧啶的富集，降低檢出限，使5-糖基化胞嘧啶的檢出限降低至0.16nmol/L。

附圖說明

圖1是正常DNA的MALDI-TOF MS圖。

圖2是5-羥甲基胞嘧啶DNA的MALDI-TOF MS圖。

圖3是糖基化處理的正常DNA的MALDI-TOF MS圖。

圖4是5-糖基化胞嘧啶DNA的MALDI-TOF MS圖。

圖5是熒光強(qiáng)度隨5-糖基化胞嘧啶DNA濃度變化的熒光光譜圖。

圖6是F-F₀值隨5-糖基化胞嘧啶DNA濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7是PBAQA-P_GMA對(duì)糖基化的5-羥甲基胞嘧啶DNA的特異性識(shí)別熒光圖。

圖8是PBAQA-P_GMA對(duì)糖基化的5-甲基胞嘧啶DNA的熒光檢測(cè)圖。

圖9是PBAQA-P_GMA對(duì)糖基化的正常DNA的熒光檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

下面實(shí)施例中所用的硼酸衍生物功能化熒光探針由下述方法制備得到：

將粒徑為200nm的P_GMA溶解于30mL蒸餾水中，并加入30mL乙二胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，80℃反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)完后，離心分離，所得產(chǎn)物用蒸餾水洗滌3次后，60℃干燥，得到氨基功能化的P_GMA。將0.058g氨基功能化的P_GMA(0.4mmol)分散于40mL無水乙醇中，并依次加入0.12g PBAQA(0.4mmol)、0.115g EDC(0.9mmol)、0.069g(0.9mmol)NHS，超聲分散均勻，40℃反應(yīng)7小時(shí)，反應(yīng)完后，離心分離，所得產(chǎn)物依次用超純水、無水乙醇和乙腈洗滌，自然干燥，得到PBAQA-P_GMA，即硼酸衍生物功能化熒光探針。

實(shí)施例1

硼酸衍生物功能化熒光探針在檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶中的應(yīng)用，具體檢測(cè)方法由下述步驟組成：

1、將5-羥甲基胞嘧啶DNA(堿基序列5'-CTTAAGCCG(5hmC)AGGTACCTTCC-3'，分子量為6372.2)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶于超純水中，配制成100μmol/L 5-羥甲基胞嘧啶DNA水溶液。將1μL 10000U/mL T4-β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶溶液加入32μL 1.25×NEBuffer4中，并加入1μL 2mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖、10μL 100μmol/L 5-羥甲基胞嘧啶DNA水溶液，混合均勻后，37℃反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，恢復(fù)到常溫，向反應(yīng)溶液中加入等體積的萃取液(萃取液是苯酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1的混合液，pH值為8.0)，劇烈震蕩混勻15分鐘，離心分離10分鐘，取上層清液用等體積萃取液重復(fù)離心洗滌，使T4β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、尿苷二磷酸葡萄糖去除干凈，然后加入其2倍體積的-20℃無水乙醇，混合均勻，于-20℃靜置1小時(shí)后，常溫離心分離20分鐘，移除上清液，用體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇水溶液洗滌，離心分離20分鐘，移除上清液，常溫干燥，得到5-糖基化胞嘧啶DNA。

按照上述方法對(duì)正常DNA(堿基序列5'-CGGTACCTGCGGCTTAAGCC-3'，分子量為6094)進(jìn)行糖基化處理。

采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)對(duì)正常DNA、糖基化處理的正常DNA、5-羥甲基胞嘧啶DNA、5-糖基化胞嘧啶DNA分別進(jìn)行表征，結(jié)果見圖1～4。由圖可見，在m/z＝6133處為正常DNA片段的加鉀離子峰，在m/z＝6410.2處是5-羥甲基胞嘧啶DNA片段的加鉀正離子峰，在m/z＝6115處是糖基化處理的正常DNA片段的加鈉減氫正離子峰，在m/z＝6510.2處為成功標(biāo)記尿苷二磷酸葡萄糖糖基部分(分子量為160)的5-羥甲基胞嘧啶DNA片段的減鈉正離子峰，證明對(duì)5-羥甲基胞嘧啶DNA的糖基標(biāo)記成功。

2、將硼酸衍生物功能化熒光探針和步驟1得到的5-糖基化胞嘧啶DNA分別溶于超純水中，配制成2mg/mL熒光探針懸浮液和1μmol/L 5-糖基化胞嘧啶DNA水溶液；取20μL 2mg/mL熒光探針懸浮液加入pH＝7.4的磷酸緩沖液中，并加入不同體積的1μmol/L 5-糖基化胞嘧啶DNA，分別得到200μL 5-糖基化胞嘧啶DNA濃度為0、5、10、20、25、50、72nmol/L的反應(yīng)溶液，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，采用F-7000型(日立)熒光分光光度(激發(fā)波長(zhǎng)281nm，發(fā)射波長(zhǎng)415nm，光電倍增管高壓為450V，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0nm)測(cè)量不同濃度5-糖基化胞嘧啶DNA對(duì)應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖5，繪制F-F₀值隨5-糖基化胞嘧啶DNA濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖6。

由圖5可見，隨著5-糖基化胞嘧啶DNA濃度的增大熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。由圖6可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y＝0.4481x+5.659，其中y代表F-F₀值，x代表5-糖基化胞嘧啶DNA濃度，R＝0.9854，說明5-糖基化胞嘧啶DNA濃度與F-F₀值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。經(jīng)計(jì)算，該硼酸衍生物功能化熒光探針對(duì)5-糖基化胞嘧啶DNA的檢出限為1.6nmol/L。

3、按照步驟2的方法用熒光光譜儀測(cè)量待測(cè)DNA樣品的熒光強(qiáng)度，根據(jù)待測(cè)DNA樣品的F-F₀值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可高選擇性識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶DNA并確定待測(cè)DNA樣品中5-羥甲基胞嘧啶DNA的濃度。

為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人按照實(shí)施例1的方法，分別采用硼酸衍生物功能化熒光探針對(duì)濃度72nmol/L的正常DNA(堿基序列5'-CGGTACCTGCGGCTTAAGCC-3')、5-甲基胞嘧啶DNA(堿基序列5'-ATCGTTGAT(5mC)ACGTCTAGCTG-3')、5-羥甲基胞嘧啶DNA(堿基序列5'-CTTAAGCCG(5hmC)AGGTACCTTCC-3')糖基化處理后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，并以未加檢測(cè)物的溶液做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖7～9。

如圖7所示，該熒光探針與糖基化的5-羥甲基胞嘧啶DNA(5gmC-DNA)反應(yīng)后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出了對(duì)5-羥甲基胞嘧啶DNA良好的選擇性；而與糖基化的5-甲基胞嘧啶DNA(G-5mC-DNA，見圖8)、糖基化后的正常DNA(G-C-DNA，見圖9)在相同條件下進(jìn)行反應(yīng)基本沒有熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，說明胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶不會(huì)影響到DNA鏈中5-羥甲基胞嘧啶的檢測(cè)，即本發(fā)明的硼酸衍生物功能化熒光探針可以特異性檢測(cè)DNA序列中的5-羥甲基胞嘧啶。