專利名稱：一類以熒光素類似物為母體的熒光染料的合成和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類以熒光素為母體的新型熒光染料，其制備方法及應(yīng)用，以及利用該類熒光探針化合物在體外和體內(nèi)檢測生物巰基化合物，并將染料應(yīng)用到細(xì)胞成像和活體實(shí)驗(yàn)中。
背景技術(shù)：
熒光染料作為功能性色素在科學(xué)技術(shù)的各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在生命科學(xué)、臨床醫(yī)療診斷、免疫分析檢測等方面的研究在全世界備受矚目。在眾多的熒光染料中熒光素是一類被廣泛應(yīng)用的染料，這類染料具有大的摩爾消光系數(shù)、好的光穩(wěn)定性、高的熒光 量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)。熒光成像監(jiān)測生物大分子在生命系統(tǒng)中最強(qiáng)大的技術(shù)之一，與在可見光區(qū)的吸收和發(fā)射的熒光傳感器相比，近紅外(NIR)范圍內(nèi)的染料在生命系統(tǒng)中的應(yīng)用中是有利的生物成像試劑，由于近紅外染料具有最小的光損傷，深部組織的滲透，和最小的背景的自發(fā)熒光。因此，發(fā)射紅光和近紅外區(qū)域的生色團(tuán)近幾年得到密切的關(guān)注。近日，被廣泛使用的NIR熒光團(tuán)探針的菁染料，主要是Cy5和Cy7。然而，據(jù)我們所知，菁染料有致命的缺點(diǎn)一特別差的耐光性能。因此，很多組竭盡他們所能，以開發(fā)新的近紅外的熒光基團(tuán)，他們主要基于Rhodamine B, BODIPY染料，目前已經(jīng)有很多這兩類熒光團(tuán)的光譜可以延伸到近紅外區(qū)域了，更重要的，這兩類熒光團(tuán)有特別好的光穩(wěn)定性。例如，林偉英的研究課題組構(gòu)建了長沙市近紅外功能染料。Nagano的研究小組開發(fā)了系列2_MeTeR是可逆的近紅外ROS熒光探針。他們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一種新型的近紅外的Si雜羅丹明熒光探針MMSiR檢測次氯酸。同時(shí)，他們還開發(fā)出了一系列新的近紅外波長激發(fā)的熒光染料，SiR-NIRs，這類探針是基于修飾后的Si雜羅丹明母體。與此同時(shí)，其他各組也發(fā)現(xiàn)了更多的新的近紅外的BODIPY染料,但是,到現(xiàn)在為止,很少有近紅外突光素衍生物已構(gòu)建的文獻(xiàn)報(bào)道。 熒光素染料具有良好的光化學(xué)特性，如高摩爾消光系數(shù)，較大的熒光量子產(chǎn)率，較好的光穩(wěn)定性能。最近，熒光素衍生物與氯取代的2’，7’的位置已被廣泛開發(fā)。值得注意的是，熒光素的羥基位置始終處于一種激活狀態(tài)，可以很容易地進(jìn)行修飾。羥基保護(hù)的熒光探針已廣泛的作為有效平臺(tái)建設(shè)的熒光轉(zhuǎn)式傳感器。許多多樣化的目標(biāo)檢測物，包括過氧化氫，超氧陰離子自由基，半胱氨酸的基礎(chǔ)上獨(dú)特的羥基保護(hù)的過程中熒光素探針的報(bào)道。但是，這些已經(jīng)報(bào)道過的探針的吸收和發(fā)射波長仍然分別約在480nm和520nm左右。據(jù)了解，短波長激發(fā)容易帶來了巨大的生物樣品損害，因此，在近紅外范圍內(nèi)的吸收光譜和發(fā)射的熒光素類似物研發(fā)是一項(xiàng)非?？扇〉陌l(fā)展。在此，我們引入了新的戰(zhàn)略設(shè)計(jì)一個(gè)近紅外功能性熒光染料，這種染料是基于2’，7’ - 二氯熒光素(DCF)母體的，同時(shí)，基于D-J1-A的機(jī)制。我們預(yù)期的設(shè)計(jì)可以延長各種各樣的近紅外功能性染料為進(jìn)一步有用的應(yīng)用在生物學(xué)研究的發(fā)展戰(zhàn)略。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于上述背景技術(shù)，開發(fā)一種新的熒光染料，該熒光染料具有以下優(yōu)點(diǎn):光穩(wěn)定性好，發(fā)射波長在近“紅色”區(qū)域的基于熒光素類似物為母體的一類新型熒光染料，同時(shí)本發(fā)明所述染料在生物應(yīng)用方面具有一定的細(xì)胞膜通透性，長波長的特點(diǎn)使得光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有較大差異。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有存在的熒光素染料的不足，在其基礎(chǔ)上改進(jìn)，提供了一類結(jié)構(gòu)簡單、長波長、且具有良好的細(xì)胞膜通透性的新化合物，其具有下列結(jié)構(gòu)通式1:
Cl
Y'COOM RI通式I中:m 為 0、1、2 或 3;M 選自 H，K+，Na+，-R5, -OR10 和-(CH2)n-O-R10 ；R10 為 C1^18 烷基，η 為 1-18 的整數(shù)；R。選自 H、F、CUr 和 I ;R’選自H、乙?；⒈?烯?；籖 選自 H、札、R2 > R3> R4> R5> R6> R7> R8 和 R9 ;
仏 H Y # 0
R-fR2R3R4R5Re
,r,,,
NC,'CN NC COOCH2CH3 NC^^COOHX 為 C(CH3)2'O、S 或 Se ;Y_為負(fù)離子。具有上述結(jié)構(gòu)通式I的熒光染料可用于生物染色，實(shí)施例中列舉了，將其中一個(gè)染料應(yīng)用于半胱氨酸的體外和體內(nèi)檢測，同時(shí)還應(yīng)用到活體檢測等領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)，顯示出此類化合物具有一定水平的水溶性，同時(shí)具有一定良好的細(xì)胞膜通透性。本發(fā)明的這類化合物同時(shí)還具有比較新穎的光譜特性，可應(yīng)用于熒光成像等方面。本發(fā)明的另一方面目的在于提高所述的熒光染料的綴合物。
再一方面的目的在于提高用于生物樣品染色的組合物，包含上述熒光染料或其綴合物。另一方面:提供一種制備本發(fā)明所述的化合物的方法，所述方法包括以下步驟:( I)將熒光素母體化合物II’溶解在50%的氫氧化鈉的水溶液中，在反應(yīng)溫度為10 165°C條件下反應(yīng)10 24h，得到粘稠狀物，然后將反應(yīng)混合物加入到冰水中，用濃鹽酸中和至中性，靜置然后抽濾得到固體II ；
權(quán)利要求
1.一類以熒光素類似物為母體的新型熒光染料，具有通式I的結(jié)構(gòu):
2.權(quán)利要求1所述的熒光染料，其特征在于，所述的m為I。
3.權(quán)利要求1所述的熒光染料，其特征在于，所述的Rtl選自H、F、Cl。
4.權(quán)利要求1所述的熒光染料，其特征在于，所述的R’選自H、乙?；?、丙烯?；?。
5.權(quán)利要求1所述的熒光染料，其特征在于，所述的R選自
6.權(quán)利要求1 5中任一權(quán)利要求所述的突光染料,其特征在于,所述的M選自H,K+,Na+。
7.權(quán)利要求1所述的熒光染料的綴合物。
8.權(quán)利要求1所述的熒光染料的制備方法，包括如下步驟: (I)將熒光素母體化合物II’溶解在50wt%的氫氧化鈉的水溶液中，在10 165°C條件下反應(yīng)10 24h，將得到的粘稠狀物加至冰水中，用濃鹽酸中和至中性，靜置后抽濾得到固體II ；
9.一種用于生物樣品染色的組合物，包含權(quán)利要求1所述的熒光染料或權(quán)利要求7所述的熒光染料綴合物。
10.一種生物樣品的染色方法，包括將權(quán)利要求1所述的熒光染料、權(quán)利要求9所述的熒光染料綴合物或權(quán) 利要求9所述的組合物與生物樣品接觸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一類以熒光素為母體的熒光染料、其制備方法及應(yīng)用，所述的以熒光素為母體的熒光染料，具有通式I的結(jié)構(gòu)。該熒光染料可用于生物染色，同時(shí)將其中一個(gè)染料應(yīng)用于半胱氨酸的體外和體內(nèi)檢測，同時(shí)還應(yīng)用到活體檢測等領(lǐng)域，這類化合物具有一定水平的水溶性，同時(shí)具有一定良好的細(xì)胞膜通透性。本發(fā)明的這類化合物同時(shí)還具有比較新穎的光譜特性，并將這類良好性質(zhì)的熒光素衍生物的染料應(yīng)用于熒光成像方面。
文檔編號(hào)C09K11/06GK103214875SQ201310067820
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者彭孝軍, 熊小慶, 宋鋒玲, 樊江莉, 王靜云, 孫世國, 張玉康 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)