一種腫瘤特異性til細胞的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種腫瘤特異性TIL細胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤過繼免疫治療（adoptiveimmunotherapy，ACI)是指通過向腫瘤患者輸注具 有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷或激發(fā)機體免疫反應殺傷腫瘤細胞，達到治療腫瘤的 目的。它包括非特異性激活和特異性激活的效應細胞，前者是采用非特異性刺激因子（IL2、 干擾素）刺激前體效應細胞，使其活化為具有抗腫瘤活性的效應細胞，如LAK細胞、腫瘤浸 潤性淋巴細胞（TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokineinducedkillcells，CIK)等； 特異性激活的效應細胞是指采用腫瘤抗原作刺激物所誘導的抗腫瘤效應細胞，如樹突狀細 胞（DC)，細胞毒T淋巴細胞（CD8+細胞）等。ACI在惡性實體腫瘤治療中的應用已引起了 人們的普遍關注。
[0003] HL細胞是特異性殺傷腫瘤細胞的效應細胞，其殺瘤活性較LAK細胞強50~100 倍；TIL細胞療法是一種特異性免疫活性細胞療法，盡管其用于腫瘤治療領域已有20多年 的歷史，但至今一直有新技術、新成果在不斷報道。2004年SteveRosenberg教授在PNAS 上發(fā)表文章指出：腫瘤特異性的TIL治療轉移性黑色素瘤的臨床有效率大于50%，35個病 人中18名病人有響應，其中4人完全響應。TIL因其對腫瘤細胞具有較強的特異性殺傷作 用，因而一直是國內(nèi)外惡性腫瘤生物治療的熱點之一。
[0004] 但是TIL細胞制備技術復雜，通常需要篩選上百個甚至幾百個T淋巴細胞克隆才 能得到腫瘤特異性的TIL細胞，同時目前，體外培養(yǎng)TIL細胞主要還是用含有人血清或FBS 的培養(yǎng)基，使用動物血清的缺點是有潛在傳播傳染病的風險，以及由于異種蛋白導致過敏 癥的發(fā)生，而使用人AB血清的供應量有限，而且也存在傳播傳染病的風險。這些因素嚴重 地限制了其的應用和有效性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供簡便、有效的腫瘤特異性TIL細胞的培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn) 有技術的缺陷。
[0006] 為此，本發(fā)明公開了一種腫瘤特異性TIL細胞的培養(yǎng)方法，其包括下列步驟：
[0007] 無菌條件下制備固體腫瘤單細胞懸液或采集惡性胸腔積液或腹水；
[0008] 采用淋巴細胞分離液離心，收集含淋巴細胞的云霧狀細胞層；
[0009] 云霧狀細胞層用無菌緩沖液洗一次，再用無血清培養(yǎng)液洗一次，離心收集細胞；
[0010] 按IX106/ml的濃度將細胞懸于無血清培養(yǎng)液中，接種于細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中 而后置于飽和濕度、37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時后取出，收集懸浮細胞；
[0011] 懸浮細胞采用磁珠分離儀分離⑶8+T細胞；
[0012] CD8+T細胞采用磁珠分離儀分離CD8+PD-1+T細胞；
[0013] ⑶8+PD_l+T細胞用無菌緩沖液洗一次，再用無血清培養(yǎng)液洗一次，離心收集細胞；
[0014] 按0.5-2.OXIO6Ail的濃度將⑶8+PD-l+T細胞懸于無血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)的第1天 無血清培養(yǎng)液加入終濃度為lOU/ml的IFN-y、100ng/ml的PHA，40-50U/ml的IL-2 ;而后 隔1~2d加入含有IL-2 100U/ml的無血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)5-7天；
[0015] 含有IL-2lOOOU/ml的無血清培養(yǎng)液下每隔2-3天傳代培養(yǎng)，15-20天即可收集細 胞；
[0016] 所述無血清培養(yǎng)液包括基礎培養(yǎng)基、維生素類物質、微量元素、2-巰基乙醇、丙谷 二肽和甘油酯；
[0017]其中基礎培養(yǎng)基是Iscove'sModifiedDulbecco'sMedia、或者是RPMI-1640,或 者是Dulbecco'sModifiedEagleMedium和Ham's_F12按照1:1的體積比例混合而成的。
[0018] 在一些實施例中，其中維生素類物質含量為生物素1-5yM;肌醇0. 1-0. 2mM;葉酸 0. 01-0. 02mM;煙酸 0. 03-0. 05mM;砒洛醇 7-10yM;葉黃素 0. 5-1yM;硫銨 7-10yM;維生素 B12 0? 3-0. 9yM;泛酸鈣 0? 01-0. 03mM。
[0019] 微量元素：腐胺0.OlmM;乙醇胺0.ImM;亞油酸0.OOlmM;檸檬酸鐵10mg/L;硫 酸銅0? 05-0.IyM硫酸鋅5-10yM;硒酸鈉0? 01-0.IyM;氯化鋁0? 05-0. 01yM;碘化鉀 0? 04-0. 06yM;氯化鈷 0? 03-0. 07yM。
[0020] 其中2-巰基乙醇的含量為L0-5. 0yg/ml;
[0021] 其中丙谷二肽的含量為0? 5-3mM。
[0022] 本發(fā)明方法操作簡單，能高效地增殖培養(yǎng)出腫瘤特異性TIL細胞，大大提高了TIL 細胞的殺瘤效果，同時采用無血清培養(yǎng)解決現(xiàn)有技術中潛在傳播病毒和其他危險的風險， 為其今后的廣泛應用提供了基礎。
【附圖說明】
[0023] 圖1，不同培養(yǎng)基體外CD8+PD-1+T細胞增殖比較。
【具體實施方式】
[0024] 除非另有指示或定義，否則所有所用術語均具有本領域中的通常含義，該含義將 為本領域技術人員所了解。
[0025] 參考例如標準手冊，為進一步詳細描述在本發(fā)明的實踐中所使用的常規(guī)技術， 實踐者可參看有關細胞生物學、組織結構學以及胚胎學的標準的教科書及評論。包括 Teratocarcinomasandembryonicstemcell:Apracticalapproach[E.J.Robertson編， IRL出版有限公司，1987];GuidetotechniquesinMouseDevelopment[P.M.Wasserman 等編，學術出版社，1993]!EmbryonicStemCellDifferentiationinVitro[M. V.Wiles,Meth.EnzymoI.225:900,1993]!PropertiesandusesofEmbryonicStem Cells:ProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy[P.D.Rathjen 等，Reprod.Fertil.Dev. 10:31，1998] 〇
[0026] 細胞生物學、蛋白質化學、和抗體技術可以在"蛋白科學中的當前方案" [J. E.Colligan等編輯，Wiley&Sons]、"細胞生物學中的當前方案" [J.S.Bonifacino等， Wiley&Sons]和"兔疫學功時當亦方案" [J.E.Colligan等編輯，Wiley&Sons]中找到。與 本發(fā)明相關的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業(yè)供應商那得到，例如BioRad、 Stratagene、InvitrogeruClonTech以及sigma-Aldrich公司。
[0027] 細胞培養(yǎng)方法通常在"動物細胞培養(yǎng)：基本技術手冊"最新版本（R.I.Freshney編 輯，Wiley&Sons)細胞培養(yǎng)一般技術"(M.A.Harrison和I.F.Rae,劍橋大學出版）；和"胚 胎干細胞：方法和操作規(guī)定"(K.Turksen編輯，Humana出版）中有描述。組織培養(yǎng)基和試劑 可從商業(yè)供應商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-NuncInternational、SigmaChemical Co.、以及ICNBiomedicals。以及本文中引用的一般現(xiàn)有技術；
[0028] 此外，除非另有說明，否則未具體詳述的所有方法、步驟、技術及操作均可以且已 經(jīng)以本身已知的方式進行，該方式將為本領域技術人員所了解。亦參考例如標準手冊、上述 一般現(xiàn)有技術及其中引用的其他參考文獻.以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的 實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0029] 一、材料與方法
[0030]( -）材料收集
[0031] 從上海醫(yī)院收集6例晚期腫瘤患者（2例肺癌、1例肝癌、1例胃癌、1例十二指腸腺 癌）的胸腔積液或腹水各200ml(肝素抗凝5U/ml)，立即進行分離制備試驗。上述標本均為 臨床治療過程中的廢棄物。
[0032] (二）實驗方法
[0033] 1.腫瘤特異性TIL細胞的分離和FACS檢測
[0034] 無菌收集經(jīng)肝素抗凝的惡性胸腔積液或腹水100ml，經(jīng)2000r/min離心10min，沉 淀細胞用無菌緩沖液洗滌2次后懸于20ml的緩沖液中；
[0035] 而后將100%的淋巴細胞分離液5ml加入15ml的無菌離心管中，再小心加入IOml 上述細胞懸液，經(jīng)2000以1^11離心201^11，在100%的淋巴細胞分離液界面上收集云霧狀的 細胞層細胞即為腫瘤細胞與TIL細胞的混合體，1500r/min，離心5