一種重組酵母菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種重組酵母菌株及其構(gòu)建方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在世界范圍內(nèi)，隨著經(jīng)濟(jì)水平和對健康需求的提高，食品的安全性、營養(yǎng)性和功能 性受到越來越多的關(guān)注，因此功能性營養(yǎng)化學(xué)品已成為發(fā)展趨勢，代表當(dāng)代食品發(fā)展的新 潮流，具有廣闊的市場前景。番茄紅素是一種脂溶性天然食用色素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于類胡 蘿卜素，具備極強(qiáng)的抗氧化能力，是近年來國際上功能食品成分研究的熱點(diǎn)。
[0003] 番茄紅素的制備主要依賴植物提取、化學(xué)合成和微生物合成，前兩種方法各有其 自身的不足，微生物合成則以低成本、高產(chǎn)量和產(chǎn)品安全性，被認(rèn)為是最有前途的方法。目 前，在微生物合成番茄紅素的研究中，所采用的宿主菌主要集中于大腸桿菌與釀酒酵母。 2011年，Yeong-SuKim等人在大腸桿菌中引入成團(tuán)泛菌來源的合成番前紅素三個(gè)基因 crtE、crtB和crtl，同時(shí)上調(diào)內(nèi)源MEP途徑中的關(guān)鍵基因并在胞內(nèi)搭建異源MVA路徑，最終 通過分批補(bǔ)料發(fā)酵優(yōu)化實(shí)現(xiàn)1.35g/L(32mg/gDCW)的番茄紅素產(chǎn)量。2014年，天津工業(yè)生 物技術(shù)研究所馬延和課題組通過優(yōu)化大腸桿菌胞內(nèi)NADPH和ATP的供給，并利用核糖體結(jié) 合位點(diǎn)文庫篩選獲得一株高產(chǎn)番茄紅素的重組大腸桿菌，其在分批補(bǔ)料發(fā)酵罐上的產(chǎn)量為 3. 52g/L (50. 6mg/g DCW)，屬目前公開報(bào)道的重組菌株中最高產(chǎn)量。
[0004] 釀酒酵母作為公認(rèn)的安全模式微生物，相比大腸桿菌，它的菌體維生素、蛋白質(zhì)含 量高，可作食用、藥用和飼料酵母；相比三孢布拉氏霉菌，它的生長周期更短且更易培養(yǎng)。 因此，實(shí)現(xiàn)番茄紅素在釀酒酵母中的高產(chǎn)將會(huì)在類胡蘿卜素產(chǎn)業(yè)化上展現(xiàn)極大的競爭力。 2014年Bahieldin等人報(bào)道的在釀酒酵母中通過ADH2啟動(dòng)子表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化的噬夏孢 歐文氏菌來源的crtE、crtB和crtl的番茄紅素產(chǎn)量僅3. 3mg/gDCW。2015年，浙江大學(xué)于 洪巍課題組通過蛋白定向進(jìn)化手段改造紅發(fā)夫酵母來源的雙功能酶crtYB，使其失去番茄 紅素環(huán)化酶的編碼功能，而僅保留其編碼八氫番茄紅素合成酶的功能；同時(shí)，對紅發(fā)夫酵母 來源的crtE進(jìn)行定向進(jìn)化，提高酶的催化性能；再次，通過調(diào)整crtE、crtB和crtl的拷貝 數(shù)，獲得一株高產(chǎn)番茄紅素的二倍體重組釀酒酵母，其搖瓶產(chǎn)量達(dá)到159. 56mg/L(23. 23mg/ gDCW)，最后通過分批補(bǔ)料發(fā)酵優(yōu)化，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到I. 61g/L(24. 41mg/gDCW)，屬目 前公開報(bào)道的利用重組釀酒酵母合成番茄紅素的最高產(chǎn)量。然而，這與此前報(bào)道的利用重 組大腸桿菌合成番茄紅素的最高產(chǎn)量（50. 6mg/g DCW)相比仍有較大的差距。因此，開發(fā)以 釀酒酵母為宿主菌株實(shí)現(xiàn)番茄紅素的高產(chǎn)依然存在很大的潛力與空間。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組酵母菌株，使得所述重組菌株能夠應(yīng) 用于番茄紅素的生物合成中，并保持較高產(chǎn)量，同時(shí)提供所述重組菌株的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] -種重組酵母菌株，所述酵母基因組敲除gall、gal7、gallO和ypl062w基因或者 gal80和ypl062w基因，且包含經(jīng)酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：
[0008] 酵母trpl位點(diǎn)上游同源序列、CYCl終止子、BtcrtI、GAL10啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、 PacrtB、PGKl終止子、酵母trpl位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段1 (模式圖見 圖1);
[0009] 酵母leu2位點(diǎn)上游同源序列、LEU2標(biāo)記、TDH2終止子、ACTl終止子、截短的 HMG-CoA還原酶基因tHMGRl、GALlO啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、發(fā)光古生球菌來源或三孢布拉氏 霉菌來源或曼地亞紅豆杉來源的crtE、GPMl終止子、酵母leu2位點(diǎn)下游同源序列順次拼接 而成的基因片段2 (模式圖見圖2)。
[0010] 本發(fā)明通過利用特定的酵母內(nèi)源基因以及外源基因進(jìn)行基因元件、基因模塊的構(gòu) 建，并轉(zhuǎn)入到敲除gall、gal7、gallO和ypl062w基因或敲除gal80和ypl062w基因的酵母 基因組上，實(shí)現(xiàn)重組菌株番茄紅素的合成產(chǎn)量提高。
[0011] 其中，所涉及的酵母內(nèi)源基因包括截短的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶基因tHMGRl，可通過酵母基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得；
[0012] 同時(shí)，本發(fā)明還涉及采用酵母中的氨基酸標(biāo)記、啟動(dòng)子和終止子，包括CYCl終止 子、GALlO啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、PGKl終止子、ACTl終止子、GPMl終止子、LEU2標(biāo)記、TDH2 終止子、FBAl終止子、EN02終止子、HIS3標(biāo)記，上述基因元件的獲得也可以酵母基因組為模 板，通過PCR擴(kuò)增獲得；
[0013] 在本發(fā)明中，上述各基因元件以及相關(guān)的上下游同源序列以釀酒酵母菌株BY4741 的基因組為模板，設(shè)計(jì)并合成合適的引物，通過PCR擴(kuò)增得到；而LEU2上游同源序列及 LEU2標(biāo)記是一并從質(zhì)粒pRS405上PCR擴(kuò)增下來，HIS3上游同源序列及HIS3標(biāo)記是一并從 質(zhì)粒PRS313上PCR擴(kuò)增下來。
[0014] 本發(fā)明所涉及的外源基因包括香葉基焦磷酸（GGPP)合酶基因crtE、八氫番 茄紅素合成酶基因crtB和八氫番茄紅素脫氫酶基因crtl。其中CrtE的來源包括成 團(tuán)泛菌（Pantoeaagglomerans)、三抱布拉氏霉菌（Blakesleatrispora)、曼地亞紅豆 杉（TaxusXmedia)、嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolobusacidocaldarius)以及發(fā)光古生球 菌（Archaeoglobusfulgidus)，依次簡寫為PacrtE、BtcrtE、TmcrtE、SacrtE、Af crtE;crtB的來源包括成團(tuán)泛菌（Pantoeaagglomerans)和水生副球菌（Agrobacterium aurantiacum)，依次簡寫為PacrtB、AacrtB;crtl的來源包括成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans)、水生副球菌（Agrobacteriumaurantiacum)和三抱布拉氏霉菌（Blakeslea trispora)，依次簡寫為PacrtI、AacrtI、Btcrtl。上述基因均為經(jīng)過密碼子優(yōu)化并適當(dāng) 規(guī)避常用限制性酶切位點(diǎn)后通過人工合成得到。
[0015] 作為優(yōu)選，所述菌株還包括經(jīng)酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片 段：
[0016] 基因片段2中TDH2終止子及其上游同源序列、DR-KlURA3-DR營養(yǎng)標(biāo)簽、CYCl終 止子、BtcrtI、GAL3啟動(dòng)子、基因片段2中ACTl終止子及其下游同源序列順次拼接而成的 基因片段3 (模式圖見圖3)。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述基因片段3如SEQIDNO: 5所示。
[0017] 更優(yōu)選地，所述菌株還包括經(jīng)酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片 段：
[0018] 酵母his3位點(diǎn)上游同源序列、HIS3標(biāo)記、EN02終止子、ACTl終止子、截短的 HMG-CoA還原酶基因tHMGRl、GALlO啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、融合基因BTS1-ERG20、FBAl終止 子、酵母his3位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段4 (模式圖見圖4)。進(jìn)一步優(yōu)選 地，所述基因片段4如SEQIDNO:6所示。
[0019] 最優(yōu)選地，所述重組酵母菌株以釀酒酵母CEN.PK2-1D為出發(fā)菌株，包含曼地亞紅 豆杉來源的crtE，敲除galI、gal7、gal10和ypl062w基因，保藏編號為CGMCCNo. 10754,在 本發(fā)明中記為SyBE_Sc0014D019。并列地，所述重組酵母菌株以釀酒酵母CEN.PK2-1C為出 發(fā)菌株，包含曼地亞紅豆杉來源的crtE，敲除gal80和ypl062w基因。
[0020] 作為優(yōu)選地，所述基因片段1如SEQIDNO: 1所示、基因片段2如SEQIDNO:2-4 任意一項(xiàng)所示；
[0021] 其中，包含發(fā)光古生球菌來源crtE基因的基因片段2如SEQIDNO:2所示；包含 三孢布拉氏霉菌來源crtE基因的基因片段2如SEQIDN0:3所示；包含曼地亞紅豆杉來源 crtE基因的基因片段2如SEQIDNO:4所示。
[0022] 作為優(yōu)選，所述酵母為釀酒酵母、解脂屬酵母或克魯維屬酵母。除此之外，也可以 以藻類、霉菌（如鏈霉菌等）和細(xì)菌（如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等）為改造菌株將本發(fā)明 所限定的基因元件和模塊根據(jù)這些菌株的已被解析的類胡蘿卜素生物合成路徑來重組。
[0023] 更優(yōu)選地，所述釀酒酵母為CEN.PK系列釀酒酵母或BY系列釀酒酵母。進(jìn)一步優(yōu) 選地，所述CEN.PK系列釀酒酵母為釀酒酵母CEN.PK2-1C或釀酒酵母CEN.PK2-1D。
[0024] 本發(fā)明所述重組酵母菌株能夠大量的合成番茄紅素，因此本發(fā)明還提供了所述重 組酵母菌株在生產(chǎn)番茄紅素中的應(yīng)用以及在生產(chǎn)以番茄紅素為中間產(chǎn)物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0025] 此外，本發(fā)明還提供了所述重組酵母菌株的構(gòu)建方法，包括：
[0026] 步驟1、構(gòu)建由酵母gal7基因下游同源序列、DR-KlURA3-DR營養(yǎng)標(biāo)簽、gall基因 下游同源序列順次連接的敲除盒片段1或由酵母gal80基因上游同源序列、DR-KlURA3-DR 營養(yǎng)標(biāo)簽、gal80基因下游同源序列順次連接的敲除盒片段2,以及由ypl062w基因上游同 源序列、kanMX抗性標(biāo)簽、ypl062w基因下游同源序列順次連接的敲除盒片段3,利用敲除盒 片段1和3或者利用敲除盒片段2和3通過酵母自身同源重組敲除酵母gall、gal7、gal10 和ypl062w基因或敲除酵母gal80和ypl062w基因，獲得基因敲除酵母，備用；
[0027] 將酵母trpl位點(diǎn)上游同源序列、CYCl終止子、Btcrtl、GAL10啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng) 子、PacrtB、PGKl終止子、酵母trpl位點(diǎn)下游同源序列順次拼接，獲得基因片段1，即trpl 位點(diǎn)上游同源序列-la^-crtl-Pa^-PGAu-crtB-Tpaa-trpl位點(diǎn)下游同源序列，備用；
[0028] 將酵母leu2位點(diǎn)上游同源序列、LEU2標(biāo)記、TDH2終止子、ACTl終止子、截短的 HMG-CoA還原酶基因tHMGRl、GAL10啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、發(fā)光古生球菌來源或三孢布拉氏 霉菌來源或曼地亞紅豆杉來源的crtE、GPMl終止子、酵母leu2位點(diǎn)下游同源序列順次拼 接，獲得基因片段2,即leu2位點(diǎn)上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGRl-PGAUQ-PGAU-CrtE-T (；PM1-leu2位點(diǎn)下游同源序列，備用；
[0029] 步驟2、將基因片段1通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)入所述基因敲除酵母中，通過基因片段1中 trpl位點(diǎn)上、下游同源序列與基因敲除酵母基因組上trpl位點(diǎn)發(fā)生重組而整合到基因組 上；
[0030] 將基因片段2通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)入所述基因敲除酵母中，通過基因片段2中l(wèi)eu2位 點(diǎn)上、下游同源序列與基因敲除酵母基因組上leu2位點(diǎn)發(fā)生重組而整合到基因組上，獲得 重組酵母菌株。
[0031] 作為優(yōu)選，所述構(gòu)建方法還包括：
[0032] 構(gòu)建基因片段3,并在轉(zhuǎn)入基因片段1和2后，將基因片段3轉(zhuǎn)入基因敲除酵母中 獲得重組酵母菌株；
[0033] 具體為，將基因片段2中TDH2終止子及其上游同源序列、DR-KlURA3-DR營養(yǎng) 標(biāo)簽、CYCl終止子、Btcrtl、GAL3啟動(dòng)子、基因片段2中ACTl終止子及其下游同源序列 順次拼接，獲得基因片段3,即TDH2終止子及其上游同源序列-DR-KlURA3-DR-TCTa-Bt Crtl-PGAL3-TACT1-ACT1終止子及其下游同源序列，備用；
[0034] 將基因片段3繼續(xù)通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到已轉(zhuǎn)入基因片段2的基因敲除酵母中，通 過基因片段3中TDH2終止子及其上游同源序列、ACTl終止子及其下游同源序列，與已整合 的基因片段2上的TDH2終止子和ACTl終止子位點(diǎn)發(fā)生重組而插入到已整合基因片段2的 基因敲除酵母基因組上。
[0035] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述構(gòu)建方法還包括：
[0036] 構(gòu)建基因片段4,并在轉(zhuǎn)入基因片段1、2和3后，將基因片段4轉(zhuǎn)入基因敲除酵母 中獲得重組酵母菌株；
[0037] 具體為，將酵母內(nèi)源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTSl進(jìn)行連接，獲 得融合基因BTS1-ERG20,然后將酵母his3位點(diǎn)上游同源序列、HIS3標(biāo)記、EN02終止子、 ACTl終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGRl、GALlO啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、融合基因 BTS1-ERG20、FBA1終止子、酵母his3位點(diǎn)下游同源序列順次拼接，獲