一種利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種利用重組大腸桿菌直接從葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]反式-4-羥脯氨酸是一些化學(xué)合成藥物的重要前體物，傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法主要是水解動物膠原蛋白獲得，這種方法需要一套完整而復(fù)雜的純化步驟，并且會產(chǎn)生大量的廢棄物。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前多采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，可以克服水解法的種種缺陷，提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本等等。
[0003]在微生物體內(nèi)，脯氨酸羥化酶催化脯氨酸生成反式-4-羥脯氨酸，脯氨酸的合成則是以谷氨酸作為底物，經(jīng)過γ-谷氨酸激酶、谷氨酸脫氫酶、Δ 二氫吡咯-5-羧酸還原酶這三個酶的依次催化生成脯氨酸。根據(jù)已有的對脯氨酸羥化酶的研宄，對來源于指胞囊菌的脯氨酸羥化酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，其轉(zhuǎn)化脯氨酸的能力相比于原始的基因有了很大提升，且適合在現(xiàn)有的宿主細(xì)胞中表達(dá)。而已有的關(guān)于脯氨酸的生物合成的研宄中，大都采用定點(diǎn)突變對其合成途徑中的限速酶γ-谷氨酸激酶進(jìn)行研宄，其中的一些突變可以得到脯氨酸高產(chǎn)菌株，尤其是含有兩個氨基酸突變?yōu)辄c(diǎn)的雙突變菌株，其脯氨酸產(chǎn)量較高，可以直接利用葡萄糖生成脯氨酸。
[0004]通過將脯氨酸羥化酶基因(hyp)和受脯氨酸反饋抑制作用降低的γ -谷氨酸激酶基因(ρι.οΒΑ2)轉(zhuǎn)入同一個宿主細(xì)胞，使兩個基因共表達(dá)，在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，實(shí)現(xiàn)從葡萄糖到脯氨酸再到反式-4-羥脯氨酸的連續(xù)轉(zhuǎn)化，改變了傳統(tǒng)的需要添加脯氨酸為底物以生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的工業(yè)生產(chǎn)方法，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明通過將proBA2與hyp共表達(dá)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源，在不額外添加脯氨酸的情況下通過生物發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。
[0006]本發(fā)明所述的方法主要是通過重組菌的發(fā)酵可以大量獲得L-脯氨酸，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化得到反式-4-羥脯氨酸，其特征在于，所述的重組大腸桿菌由如下方法構(gòu)建:將proBA2以及hyp重組到一個載體上，或者，將含有proBA2的重組質(zhì)粒以及含有hyp的重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)兩種基因的共表達(dá)。培養(yǎng)該重組細(xì)胞，可積累產(chǎn)生羥脯氨酸。
[0007]本發(fā)明中的兩種基因均含有獨(dú)立的高效啟動子-色氨酸串聯(lián)啟動子(Ptrp2)，從已有的重組載體上酶切獲得。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)兩種基因的共表達(dá)，有兩種策略:一是將proBA2和hyp整合到同一個載體上，使用各自的高效啟動子表達(dá)；另一個是把含有proBA2的重組質(zhì)粒和含有hyp的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化同一宿主，使用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
[0009]作為表達(dá)載體，要能夠在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，例如有pET-28a、pKYP1、pUC19、pAMP、pBR322 等。
[0010]作為雙質(zhì)粒表達(dá)的載體，兩種要能夠穩(wěn)定的共存于同一宿主中，且各自的復(fù)制互不影響，可以是含有相同復(fù)制子的質(zhì)粒，也可是含有不同復(fù)制子的質(zhì)粒。
[0011]作為雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)的載體，為了穩(wěn)定共存，兩種載體要含有不同的抗生素篩選標(biāo)記，例如 pET-28a 與 pUC19，pET_28a 與 pET_21a 等。
[0012]作為宿主細(xì)胞，要能夠表達(dá)目的基因，除了使用大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌、芽孢桿菌、酵母菌等菌株，也可以使用動物細(xì)胞作為宿主。
[0013]本發(fā)明可以應(yīng)用于反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)中，培養(yǎng)重組菌的培養(yǎng)基要含有微生物可以利用的碳源、氮源、無機(jī)鹽等，可以是天然培養(yǎng)基，也可以是合成培養(yǎng)基。
[0014]作為微生物可以利用的氮源，可以是氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽類或其他含氮化合物，還可以有酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、豆柏等有機(jī)氮源。
[0015]作為微生物可以利用的無機(jī)鹽，有磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、氯化鈣等。
[0016]重組菌的培養(yǎng)需要震蕩或攪拌以維持菌體生長所需的氧氣量。培養(yǎng)溫度在20-37°C，培養(yǎng)時間12-72小時。
[0017]本發(fā)明的方法是通過重組大腸桿菌發(fā)酵從葡萄糖直接生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸而不需要額外添加脯氨酸，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0018]圖1是單一表達(dá)載體pET28a_PH的構(gòu)建。
[0019]圖2是含單一表達(dá)載體菌株的獲得。
[0020]圖3是含雙質(zhì)粒表達(dá)載體菌株的獲得。
【具體實(shí)施方式】
[0021]—般性說明:【具體實(shí)施方式】中所用到的酶全部從TaKaRa公司購買，sanprep柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自上海生工，每個操作完全按照試劑盒的說明。
[0022]種子培養(yǎng)基(LB):胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，磷酸氫二鉀3g/L，氯化鈉2g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸亞鐵ImM，氯化鈣0.015g/L。
[0024]Kan、Amp雙抗平板:1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母抽提物，I % NaCl,硫酸卡那霉素50 μ g/mL，氨節(jié)青霉素鈉50 μ g/mL。
[0025]5XKCM(大腸桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液):0.5M KCl,0.15M CaCl2,0.25M MgCl2。
[0026]重組菌生成的反式-4-羥脯氨酸的測定方法采用氯胺T法:將發(fā)酵液離心后，取上清，稀釋后取2.5mL于1mL試管中，加入ImL氯胺T (氯胺T溶液:將1.41g氯胺T溶于1mL水中，依次加入1mL正丙醇和80mL緩沖溶液，其中緩沖溶液配方為:將50g檸檬酸，26.3g NaOH和146.1g結(jié)晶乙酸鈉溶于水至1L，然后與200mL水以及300mL正丙醇混合)，搖勻后在室溫中放置20min ;然后加入ImL顯色劑(顯色劑:稱取1g對二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，緩慢加入65mL異丙醇)，搖勾后迅速將試管置于60°C水浴鍋中，20min后取出冷水冷卻，用分光光度計在560nm波長處測定吸光度值。
[0027]實(shí)施例1:含有proBA2的重組質(zhì)粒(pET28a_Ptrp2-proBA2)的獲得
[0028]取實(shí)驗(yàn)室保存的含有目的質(zhì)粒的菌株活化，于37°C，220rpm培養(yǎng)12-16小時。取培養(yǎng)后的菌液提取質(zhì)粒，所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
[0029]實(shí)施例2:含有hyp的重組質(zhì)粒(pUC19-Ptrp2_hyp)的獲得
[0030]取實(shí)驗(yàn)室保存的含有目的質(zhì)粒的菌株活化，于37°C，220rpm培養(yǎng)12-16小時。取培養(yǎng)后的菌液提取質(zhì)粒，所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
[0031]實(shí)施例3:含有兩種基因的單一表達(dá)載體pET28a_PH及重組菌的獲得
[0032]用EcoR1、BamHI 兩種酶分別雙酶切處理 pET28a_Ptrp2-proBA2、pUC19_Ptrp2_hyp，酶切產(chǎn)物膠回收得到線性的pET28a_Ptrp2-proBA2以及Ptrp2_hyp片段，用T4DNA連接酶將兩者置于16°C連接過夜后，將10 μ L的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒即為pET28a-PH。
[0033]將pET28a-PH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-PHo
[0034]實(shí)施例4:含有兩種基因的雙表達(dá)載體重組菌的獲得
[0035]將等量的兩種質(zhì)粒pET28a-Ptrp2_proBA2、pUC19_Ptrp2_hyp共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落培養(yǎng)、提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，經(jīng)酶切驗(yàn)證正確的單菌即為含有兩種基因的雙表達(dá)載體重組菌大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-Ptrp2-proBA2、pUC19-Ptrp2-hyp。
[0036]實(shí)施例5:重組菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0037]搖瓶培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a_PH:在Kan抗性平板上挑取重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-PH單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基(含硫酸卡那霉素)中，37°C、220rpm過夜培養(yǎng)后，按6%接種量接入250mL搖瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)式搖床中30°C、220rpm培養(yǎng)24h，然后取發(fā)酵液檢測反式_4_羥脯氨酸濃度。反式_4_羥脯氨酸的測定方法詳見實(shí)施例一般性說明。發(fā)酵結(jié)果顯示，重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-PH的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為30mg/L。
[0038]搖瓶培養(yǎng)重組菌大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a_Ptrp2-proBA2、pUC19_Ptrp2_hyp:在Kan、Amp雙抗平板上挑取重組菌大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-Ptrp2-proBA2,pUC19-Ptrp2-hyp單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基(含硫酸卡那霉素、氨芐青霉素鈉)中，37°C、220rpm過夜培養(yǎng)后，按6 %接種量接入250mL搖瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)式搖床中30°C、220rpm培養(yǎng)24h，然后取發(fā)酵液檢測反式-4-羥脯氨酸濃度。反式_4_羥脯氨酸的測定方法詳見實(shí)施例一般性說明。發(fā)酵結(jié)果顯示，重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-Ptrp2_proBA2、pUC19_Ptrp2_hyp 的反式-4-輕脯氨酸產(chǎn)量為 109mg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高含有重組DNA的反式-4-羥脯氨酸生物合成系統(tǒng)活性的方法，其中的含有重組DNA的反式-4-羥脯氨酸生物合成系統(tǒng)是通過將proBA2、hyp重組到載體上并轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞共表達(dá)，得到具有反式-4-羥脯氨酸生物合成活性增強(qiáng)的重組微生物。2.權(quán)利要求1所述的重組微生物中的兩個基因共表達(dá)策略，可以是重組于同一個載體上的兩個基因的共表達(dá)，也可以是分別重組于兩個不同抗性載體的兩個基因的共表達(dá)。3.權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)反式-4-羥脯氨酸生物合成系統(tǒng)活性的方法，其特征在于通過導(dǎo)入proBA2以及hyp并增加重組微生物中的兩個基因的拷貝數(shù)來實(shí)現(xiàn)。4.權(quán)利要求3所述的增加proBA2以及hyp在重組微生物中的拷貝數(shù)的方法，其特征是將兩個基因連重組到一個或兩個多拷貝質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)。5.權(quán)利要求2、4所述的載體、多拷貝質(zhì)粒包括但不局限于pET-28a、pUC19、pKYP10等。6.反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)方法，其特征是將權(quán)利要求1、2、3、4所述的重組微生物在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)物、菌體或者它們的處理物作為酶源，在葡萄糖存在下，于水性介質(zhì)中使葡萄糖轉(zhuǎn)化為L-脯氨酸，再從L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸，最后從該水性介質(zhì)中提取生成的反式-4-羥脯氨酸。7.權(quán)利要求1、2、3、4所述的重組微生物包括但不局限于大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌、酵母菌等。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用重組大腸桿菌在不添加外源L-脯氨酸的條件下，從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法，該重組大腸桿菌攜帶的重組質(zhì)粒具有突變基因proBA2以及脯氨酸4-羥化酶基因(hyp)，其中proBA2的突變發(fā)生在谷氨酸激酶編碼基因proB上，突變后的基因編碼的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反饋抑制作用顯著降低。proBA2與hyp共表達(dá)，可以直接利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，不需要添加外源的L-脯氨酸。其中的重組質(zhì)粒是將proBA2和hyp重組到同一個表達(dá)質(zhì)粒上，或?qū)⒎謩e含有兩個基因的不同抗性的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化得到的。本發(fā)明還公開了所述大腸桿菌在羥脯氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N1/19, C12N1/21, C12P13/24, C12N1/15, C12N15/63
【公開號】CN104928311
【申請?zhí)枴緾N201510275286
【發(fā)明人】張震宇, 胡丹丹, 姚動邦, 范永明
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月26日