一種Vimentin-Fc融合蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的重組Vimentin-Fc融合蛋白 及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)，我國(guó)又稱乙腦病毒，屬于黃 病毒科黃病毒屬。JEV引起的流行性乙型腦炎（乙腦)，是一種嚴(yán)重的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳 染病，主要流行于東亞、東南亞和南亞，臨床以高熱、驚厥、意識(shí)障礙及腦膜刺激征為主。JEV 每年引起大約3~5萬(wàn)人感染，1~1. 5萬(wàn)人死亡，幸存者中高達(dá)50%伴有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺 癥。乙腦是2004年我國(guó)衛(wèi)生部公布的病死率最高的十大傳染病之一，2006年山西等地再次 出現(xiàn)疫情。近年來(lái)在一些乙腦非流行地區(qū)，如塞班島、巴基斯坦和澳洲北部也有病例報(bào)道， 表明乙腦已經(jīng)擴(kuò)大流行，并且有繼續(xù)擴(kuò)大流行的趨勢(shì)。JEV更可作為生物戰(zhàn)劑使用，其重要 性不應(yīng)忽視。
[0003] 目前對(duì)JEV的病原學(xué)研宄已較深入，病毒基因組和蛋白的結(jié)構(gòu)與功能已基本清 楚。但JEV宿主細(xì)胞上受體分子尚未完全明確，JEV的致病機(jī)制尚未闡明，正在使用的疫 苗尚不理想，滅活疫苗免疫力不持久、伴隨一些副作用，減毒活疫苗有潛在的毒力變異危險(xiǎn) 性。JEV的發(fā)病機(jī)理和抗病毒研宄成為當(dāng)前研宄的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0004] Vimentin是目前發(fā)現(xiàn)的JEV的重要潛在受體之一，研宄證實(shí)，波形蛋白是一個(gè)能 夠與JEV病毒粒子相互作用的細(xì)胞表面分子，并且體外原核表達(dá)出的重組波形蛋白競(jìng)爭(zhēng)性 抑制JEV病毒的感染。因此對(duì)于JEV的感染起著關(guān)鍵作用。
[0005] "病毒受體陷阱（virus rec印tor trap)療法"是指利用人工合成的可溶性病毒受 體來(lái)結(jié)合病毒，進(jìn)而阻斷病毒與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合及隨后的病毒內(nèi)吞。病毒受體陷阱 已被成功應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性小鼠 CVB3心肌炎的治療，且表現(xiàn)出良好的抗病毒效果。目前國(guó)內(nèi)外 基于病毒受體融合蛋白的"病毒受體陷阱"研宄在其它病毒的研宄中則非常有限。
[0006] 該融合蛋白將JEV受體基因的cDNA融合入人IgGl的Fc區(qū)即構(gòu)建成重組二聚體 蛋白（Vimentin-Fc)，Vimentin-Fc 的 Vimentin 段相當(dāng)于 IgG 的 Fab 區(qū)，因此 Vimentin-Fc 有可能作為JEV感染神經(jīng)細(xì)胞的抑制劑。此融合蛋白的成功研制將為新型抗病毒藥物開(kāi)發(fā) 提供思路，并對(duì)提高乙型腦炎的防控和治療效果具有重要意義和實(shí)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種Vimentin-Fc融合蛋白， 融合蛋白的氨基端是中間絲的波形蛋白，羧基端是人免疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白與Fc 片段之間直接融合或通過(guò)連接序列融合；所述Vimentin-Fc融合蛋白為P1-L-P2或P1-P2 形式，其中Pl為Vimentin蛋白全長(zhǎng)，P2為人IgG Fc區(qū)段，L為連接肽。
[0008] 所述波形蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 所述人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 所述的連接肽序列為GlySerGly4。
[0011] 本發(fā)明另一目的在于提供編碼上述Vimentin-Fc融合蛋白的基因序列； 本發(fā)明還提供了編碼Vimentin全長(zhǎng)區(qū)段、Linker與Fc融合蛋白的編碼基因在融合后 的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
[0012] 本發(fā)明另一目的在于提供上述Vimentin-Fc融合蛋白在制備用于抗乙型腦炎病 毒感染藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)下述具體方法和步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)： a) 根據(jù)Vimentin和人IgG Fc基因序列分別設(shè)計(jì)引物，并分別在人IgG Fc和Vimentin 基因的正向和反向引物中引入Linker蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列GGATCAGGCGGGGGTGGG，以便在 隨后的融合PCR中在Vimentin和人IgG Fc的融合基因間引入Linker序列； b) 將步驟a)中的設(shè)計(jì)并合成的引物分別對(duì)成神經(jīng)瘤細(xì)胞和人淋巴細(xì)胞的cDNA進(jìn)行 擴(kuò)增，分別獲得Vimentin和人IgG Fc基因片段后，再以兩個(gè)基因片段為模板，以Vimentin 正向引物和人IgG Fc基因反向引物為上下游引物，進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，獲得Vimentin-Fc 融合基因； c) 利用融合基因兩端引入的和I酶切位點(diǎn)，將融合基因片段引入表達(dá)載體 中，獲得Vimentin-Fc融合蛋白的重組表達(dá)載體； d) 將步驟c)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，篩選獲得表達(dá)Vimentin-Fc融合蛋白 的工程菌； e) 培養(yǎng)步驟d)獲得的工程菌； f) 從步驟e)中的培養(yǎng)產(chǎn)物中以親和純化的方式分離Vimentin-Fc融合蛋白，以PBS 溶液進(jìn)行蛋白復(fù)性。
[0014] 所述步驟c)中的表達(dá)載體可以選用各種已知的載體，優(yōu)選為載體pET32a或載體 pPIC9K〇
[0015] 所述步驟d)中的宿主細(xì)胞優(yōu)先為與載體pET32a對(duì)應(yīng)的Rosetta菌或與載體 PPIC9K對(duì)應(yīng)的畢赤酵母菌。
[0016] 本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，上述Vimentin-Fc融合蛋白的制備方法為：將篩 選得到并測(cè)序正確的工程菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件為37°C，0. 5mM IPTG條件下誘導(dǎo)表 達(dá)4小時(shí)，9000rpm離心后，收集菌體，超聲破碎，用8M尿素裂解過(guò)夜，再用Ni-NTA分離 Vimentin-Fc融合蛋白。
[0017] 本發(fā)明通過(guò)基因克隆和基因重組技術(shù)合成一種Vimentin-Fc融合蛋白，該融合 蛋白中的Vimentin部分是Vimentin蛋白全長(zhǎng)，通過(guò)其乙型腦炎病毒受體的功能來(lái)結(jié)合 并達(dá)到捕獲病毒的目的；而Fc部分則起效應(yīng)功能，如抗體依賴的細(xì)胞毒作用和補(bǔ)體依 賴的細(xì)胞毒作用，從而達(dá)到使捕獲的病毒易于機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除的作用。通過(guò)將 Vimentin-Fc融合蛋白的基因克隆到一個(gè)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞得到工程菌，擴(kuò)大培養(yǎng) 制備Vimentin-Fc融合蛋白。通過(guò)蛋白復(fù)性，使得Vimentin-Fc融合蛋白具有較高的生物 活性。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是本發(fā)明中重組質(zhì)粒的電泳結(jié)果示意圖；其中泳道M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo) 記；泳道1為Vimentin-Fc融合基因菌液PCR結(jié)果； 圖2是本發(fā)明中重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果示意圖；其中泳道M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo) 記；泳道1為雙酶切鑒定重組質(zhì)粒； 圖3是本發(fā)明中蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中泳道M為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)；泳道1為未誘導(dǎo)菌液樣品；泳道2為已誘導(dǎo)菌液樣品； 圖4是本發(fā)明中純化后的蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)示意圖；其中泳道M為蛋白相對(duì)分子質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為未誘導(dǎo)菌液樣品；泳道2為已誘導(dǎo)菌液樣品；泳道3-7為純化條帶； 圖5是本發(fā)明不同濃度Vimentin-Fc重組蛋白對(duì)JEV復(fù)制的影響結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而非對(duì)本發(fā)明有任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的啟示下對(duì)本發(fā)明實(shí)施中所做的 任何變動(dòng)都將落在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
[0020] 實(shí)施例1 :融合蛋白Vimentin-Fc的載體構(gòu)建和蛋白表達(dá) Vimentin-Fc融合蛋白的表達(dá)過(guò)程包括以下步驟：克隆基因；把基因插入表達(dá)載體， 將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入Rosetta菌；利用表達(dá)載體的Kana抗性篩選出正確轉(zhuǎn)入載體的 Rosetta菌株，培養(yǎng)該菌株，利用IPTG作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，最后從包涵體中分離純 化Vimentin-Fc蛋白，具體包括： 1、基因克隆 在基因合成的專業(yè)公司（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）合成引物，利用引物通 過(guò)融合PCR技術(shù)從人淋巴細(xì)胞和成神經(jīng)瘤細(xì)胞中克隆SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。其 中1-6是及I的酶切位點(diǎn)；7-1404是編碼中間絲的波形蛋白的核苷酸序列，1405-1422 是插入的linker序列，1423-2091是編碼IgG Fc片段的核苷酸序列；2091-2099是I 的酶切位點(diǎn)。
[0021] I. I Vimentin 基因的獲得 1. 1. 1病毒培養(yǎng) 將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)中匯合率長(zhǎng)至90%的成神經(jīng)瘤細(xì)胞，以PBS溶液洗1遍，再以Iml Trizol 裂解液加入裂解細(xì)胞。
[0022] I. I. 2 RNA 提取 將Trizol裂解的細(xì)胞靜置5min，加200 μ 1氯仿，劇烈震蕩5s。室溫靜置5min，然后 4°C，12000r/min離心15min。取上層水相移至另一個(gè)Ep管中。加入500 μ1異丙醇輕柔 顛倒混勾，室溫靜置5min，13000r/min離心5min棄上清。加入1ml 75%乙醇洗絳沉淀，溫 和震蕩離心管，使沉淀懸浮。13000r/min離心15min棄上清，室溫晾干15min。加入30 μ 1 DEPC 水溶解 RNA，用 spectro photometer 檢測(cè) RNA 濃度。
[0023] I. 1. 3 反轉(zhuǎn)錄 使用RevertAidFirst Stand cDNA Synthesis Kit，按照使用說(shuō)明操作，反應(yīng)體系：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：融合蛋白包括中間絲的波形蛋白和人免 疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白與Fc片段之間直接融合或通過(guò)連接序列融合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：所述波形蛋白氨基酸 序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：所述人免疫球蛋 白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
4. 編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述Vimentin-Fc融合蛋白的核酸分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
6. 權(quán)利要求1所述的Vimentin-Fc融合蛋白在制備抗乙型腦炎病毒感染藥物中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種Vimentin-Fc融合蛋白及其應(yīng)用，本發(fā)明利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建波形蛋白Vimentin與人IgG的Fc片段的融合蛋白，所述的融合蛋白包括中間絲的波形蛋白和人免疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白與Fc片段之間直接融合或通過(guò)連接序列融合；本發(fā)明提供的融合蛋白可用于乙型腦炎病毒感染的預(yù)防或治療或作為生物制劑用于Vimentin和Fc蛋白功能的相關(guān)科學(xué)研究。
【IPC分類】A61K38-17, A61K47-48, A61P31-14, C07K19-00, C12N15-62
【公開(kāi)號(hào)】CN104877029
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510197134
【發(fā)明人】張金陽(yáng), 靳子安, 宋玉竹, 韓芹芹, 陳強(qiáng), 夏雪山
【申請(qǐng)人】昆明理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年4月24日