金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水生生物功能性多肽的用途，尤其涉及金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的用途。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]金槍魚為大洋性魚類，是世界遠(yuǎn)洋漁業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)目標(biāo)魚種，也是國際營養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦為世界三大營養(yǎng)魚類之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，目前世界大洋性漁業(yè)總產(chǎn)量為850萬噸，其中金槍魚產(chǎn)量超過600萬噸，占公海漁業(yè)總產(chǎn)量70%以上。在金槍魚加工過程中產(chǎn)生大量暗色肉，約占原料的11%?，F(xiàn)有研宄表明，金槍魚暗色肉必需氨基酸含量豐富、全面，切易消化吸收，是制備活性肽的優(yōu)質(zhì)原料。但目前并未得到有效利用。
[0004]申請(qǐng)人研宄發(fā)現(xiàn)，以金槍魚暗色肉為原料，利用酶解技術(shù)制備抗宮頸癌多肽的工藝研宄處于空白階段，而以酶解產(chǎn)物為材料制備高活性抗宮頸癌多肽更是未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著的抑制作用金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的用途。
[0006]本發(fā)明的金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的氨基酸序列為Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp (QYDEYW)，ES1-MS 檢測(cè)分子量為 902.88 Da。
[0007]—種金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
1)金槍魚暗色肉的預(yù)處理:金槍魚暗色肉勻漿，加熱至95?100°C后保溫10?15min，然后降至室溫，按照料液比lg:4?5mL加入異丙醇，室溫下脫脂22?24 h，然后于4°C、10000 rpm離心15?20 min除去異丙醇，收集脫脂金槍魚暗色肉固形物，即為脫脂金槍魚暗色肉蛋白；
2)脫脂金槍魚暗色肉蛋白的酶解:以脫脂金槍魚暗色肉蛋白作為原料，按固液比Ig:20?25 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05 mol/L，pH 9?10)，得混合液；將混合液溫度升至45?55 °C預(yù)熱5?10 min，按照脫脂金槍魚暗色肉質(zhì)量的1.5?2.5%加入蛋白酶，酶解溫度為45?55 °C，酶解4?5 h后，將溶液升溫至90?95°C，并于此溫度保持10?15min后，1000g離心20?25 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
3)金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，再將酶解液依次經(jīng)凝膠過濾層析、細(xì)胞膜色譜和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到抗宮頸癌多肽。
[0008]作為優(yōu)選，所述步驟I)中的金槍魚為鰹魚(ifatswfo/ws pelamis)。
[0009]作為優(yōu)選，所述步驟2)中的蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力多2.0XlO5 U/g0
[0010]作為改進(jìn)，所述步驟3)中的凝膠過濾層析、細(xì)胞膜色譜和RP-HPLC純化的具體過程為: 凝膠過濾層析:將上述超濾酶解液用pH 6.5?7.5磷酸鹽緩沖液配成15?25 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱層析(2.6 X 80 cm)分離，用pH 6.5?7.5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著抑制作用的組分為凝膠層析酶解物。
[0011]細(xì)胞膜色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用三蒸水配成40?50 μ g/mL的溶液，加入到細(xì)胞膜色譜柱進(jìn)行純化，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著抑制作用的組分為細(xì)胞膜色譜純化酶解物。
[0012]RP-HPLC純化:將上述細(xì)胞膜色譜純化酶解物用三蒸水配成80?100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值抑制作用得I個(gè)高活性抗宮頸癌多肽 Gin-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp (QYDEYff), ES1-MS 檢測(cè)分子量為 902.88 Da。
[0013]優(yōu)選，所述細(xì)胞膜色譜條件為:進(jìn)樣量5?10 μ L ;細(xì)胞膜色譜柱(150 mm X
4.6mm, 5 μπι);柱溫為37 °C ;流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L, pH 7.4);紫外檢測(cè)波長220 nm ;流速:0.2 ml ,/mi η η
[0014]優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量15~20 μ L ;色譜柱為Zorbax C18C250 mm X
4.6mm, 5 μπι);流動(dòng)相為35 %乙腈；紫外檢測(cè)波長為220 nm。
[0015]再優(yōu)選，所述細(xì)胞膜色譜柱中采用細(xì)胞膜為中國白兔紅細(xì)胞膜，所用固定細(xì)胞膜的載體為硅膠(5μπι，200Α)。
[0016]本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:本發(fā)明所制備的金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp (QYDEYW)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著抑制作用，IC5tl為 0.16 mg/mL ;Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp (QYDEYW)具有安全無毒副作用和活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于制備防治宮頸癌的藥物。
[0017]
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明的超濾酶解液(<3 kDa組分)的葡聚糖凝膠G_25柱層析色譜圖。
[0019]圖2是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-25制備酶解物(Fr.A3)的細(xì)胞膜色譜圖。
[0020]圖3是本發(fā)明的細(xì)胞膜色譜純化酶解物(Fr.A3_l)的RP-HPLC色譜圖。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0023]一種金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的制備方法，制備工藝流程如下:金槍魚暗色肉一脫脂一酶解一超濾一凝膠過濾層析一細(xì)胞膜色譜純化一高效液相色譜純化一抗宮頸癌多肽。
[0024]實(shí)施例:
1)金槍魚暗色肉的預(yù)處理:金槍魚暗色肉勻漿，加熱至95°C后保溫10min，然后降至室溫，按照料液比lg: 5mL加入異丙醇，室溫下脫脂24 h，然后于4°C、10000 rpm離心20min除去異丙醇，收集脫脂金槍魚暗色肉固形物，即為脫脂金槍魚暗色肉蛋白；
2)脫脂金槍魚暗色肉蛋白的酶解:以脫脂金槍魚暗色肉蛋白作為原料，按固液比Ig:25 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.5)，得混合液；將混合液溫度升至50 °〇預(yù)熱10 min，按照脫脂金槍魚暗色肉質(zhì)量的2%加入蛋白酶，酶解溫度為50°C，酶解4 h后，將溶液升溫至95°C，并于此溫度保持10 min后，1000g離心25 min，取上清液，即為酶解產(chǎn)物；
3)金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的制備:將制備的酶解產(chǎn)物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，再將酶解液依次經(jīng)凝膠過濾層析、細(xì)胞膜色譜和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到抗宮頸癌多肽。
[0025]①凝膠過濾層析:將上述超濾酶解液用pH 7.0磷酸鹽緩沖液配成20 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱層析(2.6 X 80 cm)分離，用pH 7.0磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著抑制作用的組分為凝膠層析酶解物Fr.A3 (見圖1)。
[0026]②細(xì)胞膜色譜純化:將上述凝膠層析酶解物Fr.A3用三蒸水配成50 μ g/mL的溶液，加入到細(xì)胞膜色譜柱進(jìn)行純化(進(jìn)樣量5 μ L ;中國白兔紅細(xì)胞膜色譜柱(150 _ X4.6 mm, 5 μπι);柱溫為37 °C ;流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖液(25 mmol/L, pH 7.4);紫外檢測(cè)波長220 nm;流速:0.2 mL/min)，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著抑制作用的組分為細(xì)胞膜色譜純化酶解物Fr.A3-1 (見圖
2)0
[0027]③RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物Fr.A3_l用超純水配成100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化(進(jìn)樣量15 yL ;色譜柱為Zorbax C18 (250 mm X 4.6 mm,5 μπι);流動(dòng)相為35 %乙腈；紫外檢測(cè)波長為220 nm)，根據(jù)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值抑制作用得I個(gè)高活性抗宮頸癌多肽(見圖3)。
[0028]④結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值抑制作用最強(qiáng)的多肽經(jīng)檢測(cè)為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定氨基酸序列為Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp(QYDEYff), ES1-MS 檢測(cè)分子量為 902.88 Da。
[0029]將上述制得的金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp(QYDEYW)進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明！Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp (QYDEYW)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著抑制作用，IC5tl為0.16 mg/mL。
[0030]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的用途，其特征在于所述的金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽用于制備防止宮頸癌的保健食品或食品添加劑；所述的金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的氨基酸序列為Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp，ES1-MS檢測(cè)分子量為902.88 Da。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金槍魚暗色肉蛋白抗宮頸癌多肽的用途，該抗宮頸癌多肽的氨基酸序列為Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp（QYDEYW），ESI-MS檢測(cè)分子量為902.88 Da，制備時(shí)以金槍魚暗色肉作為原料，經(jīng)過脫脂、堿性蛋白酶酶解、超濾、凝膠過濾層析、細(xì)胞膜色譜純化和反相高效液相純化，得抗宮頸癌多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp。該多肽對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增值具有顯著抑制作用，IC50為0.16 mg/mL，可用于制備防治宮頸癌的藥物、保健食品或有關(guān)添加劑。
【IPC分類】C07K1-36, C12P21-06, A23L1-305, C07K7-06, A61P35-00, C07K1-16, A23L1-29, C07K1-34
【公開號(hào)】CN104774898
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510197968
【發(fā)明人】遲長鳳, 王斌, 趙玉勤, 孫坤來
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年4月24日