膜分選培養(yǎng)器、膜分選培養(yǎng)試劑盒、和使用其的干細胞分選方法、以及分離膜的制作方法
【專利說明】膜分選培養(yǎng)器、膜分選培養(yǎng)試劑盒、和使用其的干細胞分選 方法、W及分離膜
[0001] 本申請是2012年3月30日提交的題為"膜分選培養(yǎng)器、膜分選培養(yǎng)試劑盒、和使 用其的干細胞分選方法、W及分離膜"的PCT/JP2012/058637號發(fā)明專利申請的分案申請， 原申請進入中國國家階段獲得的國家申請?zhí)枮?01280016688. 1。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及用于分選任意生物種類的干細胞和牙髓干細胞的膜分選培養(yǎng)器、膜分 選培養(yǎng)試劑盒、和使用其的干細胞分選方法。本發(fā)明特別涉及用于分選為了牙髓再生而填 充于根管中的牙髓干細胞或間充質(zhì)干細胞的膜分選培養(yǎng)器、膜分選培養(yǎng)試劑盒和使用其的 干細胞分選方法。本發(fā)明還涉及分離膜、表面改性方法和利用其的分離膜的制造，提供不損 害分離性能而將由疏水性聚合物構成的膜親水化W抑制將細胞透過分離時對膜的粘附的 分離膜。因此，本發(fā)明適用于W血液凈化領域、再生醫(yī)療為中也的細胞分離純化領域中。另 夕F，聚合物表面改性方法可W簡便地進行僅聚合物表面的改性，由于同時還可進行滅菌處 理，因而與W往方法相比可有助于生產(chǎn)效率化。
【背景技術】
[0003] 現(xiàn)在，拔髓治療或感染根管治療的生物學根管填充材料中所用的牙髓干細胞是 血管新生能力、神經(jīng)再生能力和牙髓再生能力優(yōu)異的級分。主要使用的是來源于牙髓的 CD3rSP (邊緣群)細胞、CD105+細胞或CXCR4+細胞等。SP細胞是用化echst33342標記，并 通過流式細胞儀用化echst Blue和化echst Red來對強烈排出該色素的級分進行分選， 大量含有干細胞。然而，由于化echs口3342是DNA結合色素，而且必須使用流式細胞儀，因 而人們認為在細胞的安全性方面存在問題。
[0004] 另一方面，開發(fā)有在使用針對干細胞特異性膜表面抗原的抗體時，不使用流式細 胞儀而使用磁珠的方法。例如，作為骨髓干細胞，已知CD34或CD133抗體珠，但需要一定程 度的組織細胞量。所W，不適于從牙髓組織進行分選的情形。另外，人牙髓的情形中，CD34 陽性細胞和CD133陽性細胞分別為牙髓樣本細胞的0. 01%和0. 5%，基本不存在，因而現(xiàn)存 (市售)的磁珠法不適合。對CD105或CXCR4的抗體珠來說，由于是定制品，因而有可能非常 昂貴。另外，作為從脂肪組織分離干細胞的儀器，在臨床上已經(jīng)使用了 W利用酶消化法和離 也分離法的細胞分離為基本的Celution 800/CRS系統(tǒng)，但需要大量組織，所得細胞為異源 群體且多含前體細胞，而且昂貴。進而，作為從骨髓組織分離干細胞的儀器，商品化有Bone Marrow MSC S巧aration Device。據(jù)說其通過用由人造絲和聚己帰形成的纖維來捕獲骨髓 間充質(zhì)細胞，從而可在短時間（20分)內(nèi)采集干細胞，比較廉價，但卻需要比較大量的骨髓組 織(髓液)，所得細胞仍然為異源群體且多含前體細胞。因此，不使用酶消化法而從固體的組 織分選干細胞并使之增殖的裝置尚未發(fā)明。
[0005] 另外作為膜分選器，可W將作為上部結構的插入式細胞培養(yǎng)皿（Cellcul化re Inse;rt)(聚碳酸醋膜（Polycarbonate Membrane)Transwell(注冊商標）Inserts、2Xl〇5孔 /cm2、孔尺寸8 y m、底面的直徑6. 4 mm、開口部的直徑11. 0 mm、高度17. 5 mm) (Corning) 插入作為下部結構的24孔板（直徑15. 0 mm、開口部的直徑15. 0 mm、高度22. 0 mm) (Falcon)來使用。然而，對于PET膜或聚碳酸醋膜來說，細胞的附著多，無法有效地進行向 下層的遷移。進而，由于是開放形狀，因而微生物所致的污染的危險大，無法保證細胞的安 全性。
[0006] 因此，需要開發(fā)廉價且有效地從人牙髓組織或人牙髓細胞分選干細胞的方法。
[0007] 迄今為止，已知可W將骨髓中存在的CXCR4+細胞、C-MET+細胞或LIF-R+細胞分 別利用其配體SDF1、HGF或LIF的濃度梯度，通過遷移趨化效果而濃縮為骨髓的干細胞(非 專利文獻1)。
[0008] 另外，已知可W將骨髓、末梢血和廝帶血的干細胞（CXCR4+ /lin7CD133+ /CD45+ 細胞的造血干細胞和CXCR4+ ^in7CD133+ /CD45-細胞的間充質(zhì)干細胞)通過SDF1的濃度 梯度同樣地濃縮(非專利文獻2)。此時，在現(xiàn)成的Costar化answell 24-孔的Sum孔徑 (孔尺寸）的濾器下部的腔室中裝入SDF-1，在上部裝入欲要濃縮的細胞。然而，考慮安全性 時，由于SDF-1還未受到藥事認可，因而期望使用替代SDF-1的安全且有效的遷移因子。
[0009] 另外，作為對骨髓干細胞的遷移有效的因子，已知來源于血小板的銷胺醇-1-磯 酸（S1P)(非專利文獻3)，作為對脂肪干細胞的遷移有效的因子，已知原兒茶酸（非專利文 獻4)。但是，仍然尚未解決安全性的問題。進而，還已知血管新生?神經(jīng)再生和牙髓再生 能力優(yōu)異的牙髓CD31-SP細胞相對于SDF-1或VEGF遷移（非專利文獻5)。但是，目前對 SDF-1 W外的血管新生?神經(jīng)再生和牙髓再生能力優(yōu)異的牙髓干細胞的分選有效的遷移因 子并不明確。
[0010] 能夠安全且實用地分選牙髓干細胞的膜分選培養(yǎng)器和遷移因子受到需求。另外， 在人干細胞之外，各種生物種類中由干細胞分化誘導各組織的機理的闡明在生物學研究中 受到追求。伴隨再生醫(yī)療的進展，能夠簡便且穩(wěn)定地分選干細胞的膜分選培養(yǎng)器和遷移因 子受到期待。
[0011] 對于與體液、血液或細胞接觸的醫(yī)療用的分離膜，若蛋白質(zhì)或血小板、細胞等附著 則分離膜的性能降低、或成為引起機體反應的原因，細胞自身的吸附也受到促進等，要解決 的問題多。另外，凈水器等的水處理膜中，蛋白質(zhì)或有機物的附著會引起分離膜的性能降 低。對于上述問題，嘗試了通過將分離膜親水化來解決，進行各種研究。例如，公開了使作 為親水性高分子的聚己帰基化咯焼麗與由聚諷形成的膜在制膜原液的階段混合并進行成 形，由此對膜賦予親水性W抑制污垢的方法(專利文獻1)。然而，該些方法中，對表面賦予親 水性時受到下述制約；需要增多制膜原液中的親水性高分子的量、或者限于與作為基材的 高分子具有相容性的親水性高分子、或者對應于材料的使用用途必需研究最適的原液組成 等。
[0012] 另外，專利文獻2中公開了將聚己帰醇縮酵二己基氨基己酸醋和親水化試劑涂布 于膜來實現(xiàn)親水化的方法。該方法中，有可能聚己帰醇縮酵二己基氨基己酸醋被覆親水化 試劑、非附著相關的效果驟減。另外，由于使膜浸潰于聚己帰醇縮酵二己基氨基己酸醋和親 水化試劑的各溶液中，因而膜的分離性能也有可能降低。
[0013] 公開了通過高能射線使要進行水不溶化的聚己帰基化咯焼麗等親水性成分水不 溶化并導入所形成的膜中的方法(專利文獻3)、或使聚諷系的分離膜與聚己帰基化咯焼麗 等親水性高分子溶液接觸后、通過放射線交聯(lián)而形成不溶化的被膜層的方法(專利文獻4)。 然而，聚己帰基化咯焼麗等水性高分子和聚諷系高分子由于分子間的相互作用弱，因而存 在難W形成被膜層的問題。
[0014] 因此，公開了使一定范圍的皂化度的聚己帰醇水溶液與聚諷系分離膜接觸，通過 聚諷和己酸己帰醋的疏水性相互作用而有效地形成膜表面的被膜層的方法(專利文獻5)。 然而，該文獻并非關于附著抑制的方法，因而本發(fā)明人的研究結果得知，若將聚己帰醇單純 地被覆于分離膜，則分離膜的性能降低顯著。另外，已知聚己帰醇的羥基在與血液接觸時容 易將補體活化。
[0015] 進而，據(jù)說即使用聚己帰基化咯焼麗、聚己二醇之類的親水性高分子被覆材料表 面，附著抑制效果也僅能暫時性地抑制(非專利文獻6)。目P，尚未確立用高性能的分離膜來 滿足血液適合性的分離膜組件。
[0016] 現(xiàn)有技術文獻 專利文獻 專利文獻1 ;日本特公平2-18695號公報 專利文獻2 ;日本特開平8-131791號公報 專利文獻3 ;日本特公平8-9668號公報 專利文獻4 ;日本特開平6-238139號公報 專利文獻5 ;日本特開2006-198611號公報 非專利文獻 非專利文獻 1 :Kucia M. , et al. , Arch. Immunol. Ther. Exp. 2006 非專利文獻 2 :Baumert B. et al. , Folia Histochemica Et Cytobiologica 2008 非專利文獻 3 ;Meriane M.，et al.，Stem Cells 2006 非專利文獻 4 ;Wang H. , et al. , Elur. J.化armacol. 2008 非專利文獻 5;Iohara K.et al., STEM CEIXS Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418， September 2008 非專利文獻6:醫(yī)療ナ/テク/口ッ一杏林圖書PP115-116。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0017] 發(fā)明要解決的技術問題 W往的流式細胞儀或磁抗體珠法無法成為滿足臨床使用基準(藥品和準藥品的制造管 理和品質(zhì)管理的基準相關的部令（醫(yī)薬品及醫(yī)薬部外品0製造管理及品質(zhì)管理0基 準^関十^省令）（GMP))的安全且高效、廉價的分選方法。本發(fā)明是鑒于上述問題而完成 的發(fā)明，其目的在于針對牙髓再生治療和其它再生治療提供不使用流式細胞儀或磁抗體珠 而由少量的組織也可W安全、高效且廉價地得到所期望的干細胞的培養(yǎng)器、用于其的遷移 因子W及干細胞分選方法。進而，其目的在于提供能夠適用于所有生物種類的干細胞(胚胎 干細胞、iPS細胞和組織干細胞）的分選的膜分選培養(yǎng)器、膜分選培養(yǎng)試劑盒和干細胞分選 方法。
[001引本發(fā)明的進一步的目的在于提供改良了分離膜相關的現(xiàn)有技術的缺點，具有能夠 在通常的細胞培養(yǎng)用賠育器、潔凈臺中使用的緊湊性，改良了基于孔徑的過濾性能W及表 面親和性的高性能的分離膜。
[0019] 用于解決技術問題的方法 本發(fā)明人為了達成上述課題而進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，利用細胞遷移因子的濃度 梯度，可W使干細胞從膜上部至膜下部選擇性地通過，可W分選干細胞，從而完成了本發(fā) 明。所W，根據(jù)一個方式，本發(fā)明是膜分選培養(yǎng)器，其含有上部結構體和下部結構體，所述上 部結構體由容器構成，該容器的底面的至少一部分用具有干細胞透過用孔的分離膜形成， 所述下部結構體由容器構成，該容器保持使所述上部結構體的膜浸潰于其中的流體。
[0020] 優(yōu)選的是所述分離膜具備基材膜和功能層，所述基材膜由疏水性聚合物構成，所 述功能層是選自己帰基化咯焼麗系聚合物、聚己二醇系聚合物和己帰醇系聚合物中的1種 W上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合于所述基材膜的表面而成的功能層，構成所述功能層 的親水性聚合物的重量為所述分離膜總重量的1. 5重量％至35重量％。
[002U 優(yōu)選的是所述孔的尺寸為3ym~10ym，密度為lX105~4X10 6孔/cm2。
[0022] 優(yōu)選的是具備多個所述上部結構體，并進一步含有框體，所述框體容納于所述下 部結構體中、且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件。
[0023] 或者優(yōu)選的是具備多個所述上部結構體，并進一步含有框體，所述框體容納于所 述下部結構體中、且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件，所 述下部結構體由于所述該多個上部結構體的各個對應的多個容器構成。
[0024] 或者還優(yōu)選所述多個上部結構體具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
[00巧]優(yōu)選進一步含有蓋狀結構體，所述蓋狀結構體可覆設或密封上述上部結構體和下 部結構體。
[0026] 優(yōu)選所述蓋狀結構體進一步含有具備氣體導入口和氣體排出口的氣體交換裝置。
[0027] 優(yōu)選所述蓋狀結構體的至少一部分是由具有孔尺寸1~lOOnm的孔的膜形成的。
[0028] 優(yōu)選在所述蓋狀結構體和所述下部結構體之間設置有密封用的彈性體。
[0029] 優(yōu)選進一步具備溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)含有溫度測定裝置和溫度調(diào)節(jié)裝 置。
[0030] 優(yōu)選所述下部結構體進一步含有具備培養(yǎng)基導入口和培養(yǎng)基送出口的培養(yǎng)基交 換系統(tǒng)。
[0031] 根據(jù)另一方面，本發(fā)明是膜分選培養(yǎng)試劑盒，其含有前述任一項中所述的膜分選 培養(yǎng)器、和用于注入所述下部結構體的細胞遷移因子。
[0032] 優(yōu)選所述細胞遷移因子是選自SDF-l、G-CSF、bFGF、TGF-目、NGF、PDGF、抓NF、GDNF、 EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原兒茶酸、和血清中的一種 W上。
[0033] 優(yōu)選所述細胞遷移因子的濃度為Ing/ml~50化g/ml。
[0034] 優(yōu)選進一步含有用于注入所述下部結構體的血清，所述細胞遷移因子為G-CSF或 bFGF。
[0035] 根據(jù)又一方面，本發(fā)明是使用上述任一膜分選培養(yǎng)器的干細胞分選方法，其包括： 將樣本細胞或樣本組織接種于所述上部結構體的膜的步驟、將含有細胞遷移因子的培養(yǎng)基 填充于所述下部結構體的容器的步驟、和使所述上部結構體的膜與所述下部結構體中的培 養(yǎng)基接觸的步驟。
[0036] 優(yōu)選所述細胞遷移因子是選自SDF-l、G-CSF、bFGF、TGF-目、NGF、PDGF、抓NF、GDNF、 EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、SIP、原兒茶酸、和血清中的一種 W上。
[0037] 優(yōu)選所述細胞遷移因子的濃度為Ing/ml~50化g/ml。