Rsv-特異性結(jié)合分子的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是2009. 10. 06提交的CN 200980162731. 3,題為"RSV-特異性結(jié)合分子" 的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 呼吸道合胞病毒（RSV)為屬于副粘病毒家族的感冒病毒。RSV為毒性的、容易傳染 的并且是2歲以下兒童下呼吸道疾病最常見的病因。在一個(gè)RSV感染季上至98%的日托 兒童將會(huì)被感染。0.5%和3. 2%之間的RSV感染兒童需要住院治療。報(bào)道美國(guó)醫(yī)院每年 接收大約90, 000例，4500例死亡。由于RSV而住院治療的主要風(fēng)險(xiǎn)因素為早產(chǎn)、慢性肺疾 病、先天性心臟病、受損的免疫力，在其他情況下健康的為小于6周的年齡的兒童中。除了 充足營(yíng)養(yǎng)形式的維持療法和氧療法外，對(duì)RSV陽(yáng)性毛細(xì)支氣管炎沒有可用的有效治療?？?病毒療法諸如利巴韋林未被證明在RSV感染中有效。一種單克隆抗體，帕利珠單抗（也稱 為Synagis)，注冊(cè)用于對(duì)RSV感染的預(yù)防。帕利珠單抗為針對(duì)RSV融合蛋白（F蛋白）遺傳 設(shè)計(jì)（人源化）的單克隆抗體。RSV的F蛋白為病毒膜蛋白并且負(fù)責(zé)附著后病毒粒子與宿 主細(xì)胞的融合。另外，F(xiàn)蛋白促進(jìn)相鄰細(xì)胞通過(guò)形成合胞體的感染并且認(rèn)為其功能取決于 所述蛋白質(zhì)最初的寡聚結(jié)構(gòu)。然而，帕利珠單抗并不總是有效的。因此，本領(lǐng)域有針對(duì)RSV 的替代和/或補(bǔ)充抗體以及療法的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的為提供針對(duì)RSV的改進(jìn)的抗體或所述抗體的功能等同物。另 外的一個(gè)目的為提供針對(duì)RSV的補(bǔ)充的抗體，其結(jié)合已有的RSV-特異性抗體，提供協(xié)同效 應(yīng)。另一個(gè)目的為提供針對(duì)RSV F蛋白的人或人源化抗體或功能等同物，其針對(duì)不同于已 知RSV-特異性抗體所針對(duì)的表位。
[0006] 因此，本發(fā)明提供分離的、合成的或重組的抗體或能夠特異性結(jié)合呼吸道合胞病 毒的功能部分、衍生物和/或類似物，并且其包括：
[0007] -重鏈⑶R1序列，其包括與序列KLSIH至少70%相同的序列，和/或
[0008] -重鏈CDR2序列，其包括與序列GYEGEVDEIFYAQKFQH至少70%相同的序列，和/ 或
[0009] -重鏈⑶R3序列，其包括與序列LGVTVTEAGLGIDDY至少70%相同的序列，和/或
[0010] _輕鏈⑶R1序列，其包括與序列RASQIVSRNHLA至少70%相同的序列，和/或
[0011] -輕鏈CDR2序列，其包括與序列GASSRAT至少70%相同的序列，和/或
[0012] _輕鏈^1?3序列，其包括與序列1^50551至少70%相同的序列。
[0013] 本發(fā)明提供命名為"AM22"的抗體，其具有如圖2所述的重鏈和輕鏈序列。尤其關(guān) 乎AM22抗原-結(jié)合特性的AM22的⑶R序列也在圖2中描述?？贵wAM22完全為人的，能夠 特異性結(jié)合RSV (圖3)并且因此優(yōu)選用于人個(gè)體的預(yù)防和/或治療用途。
[0014] 如上所述唯一已有的臨床使用抗-RSV抗體為帕利珠單抗。其為針對(duì)RSVF蛋白抗 原位點(diǎn)中表位的人源化單克隆抗體。人源化抗體還包含鼠抗體的一部分并且雖然相比完全 鼠抗體其免疫原性特性減弱，但在應(yīng)用于人時(shí)還可能出現(xiàn)人源化抗體的副作用。然而本發(fā) 明人成功地獲得和培養(yǎng)產(chǎn)RSV-特異性抗體的人B細(xì)胞，以提供人RSV-特異性抗體，其具有 作為完全人序列結(jié)果的強(qiáng)烈降低的"即使有的"免疫原性活性。如實(shí)施例所示，根據(jù)本發(fā)明 的抗體具有相比帕利珠單抗更優(yōu)的特性（圖1和表1)。本發(fā)明人已表明通過(guò)肌內(nèi)注射給予 本發(fā)明抗體隨后用RSV-X鼻內(nèi)激發(fā)（challenge)的棉鼠（Sigmodon hispidus)具有比給予 帕利珠單抗隨后用RSV-X激發(fā)的棉鼠更低的病理學(xué)指數(shù)（圖4C和表2)。本文所用的病理 學(xué)指數(shù)為用以區(qū)分肺損傷的三個(gè)獨(dú)立標(biāo)志的得分總數(shù)。這三個(gè)標(biāo)志為支氣管和細(xì)支氣管上 皮肥大、支氣管和細(xì)支氣管周圍的炎癥（支氣管和細(xì)支氣管周炎）和肺泡中的炎癥（肺泡 炎）。另外，通過(guò)TCID50 (50%組織培養(yǎng)感染劑量）測(cè)定法測(cè)定的，用本發(fā)明抗體肌內(nèi)注射 且隨后RSV-X激發(fā)的棉鼠具有比給予帕利珠單抗隨后用RSV-X激發(fā)的棉鼠更低的肺病毒效 價(jià)。因此，AM22優(yōu)于帕利珠單抗。
[0015] 除了帕利珠單抗外，還已知一些其他的RSV-特異性抗體。W0 2008/147196公開 了 RSV結(jié)合分子，即抗體D25、AM14、AM16和AM23的序列。如本申請(qǐng)實(shí)施例1所詳述的，RSV 特異性抗體AM22獲自與抗體D25、AM14、AM16和AM23相同的供體。然而很明顯的是，AM22 比獲自相同供體的所有其他抗體更有效地識(shí)別RSV。AM22的IC 5(I值，1. 15ng ml-1，比帕利 珠單抗、D25、AM14、AM16或AM23更低。因此，使用AM22用于RSV-相關(guān)病癥的治療和/或 預(yù)防比使用其他的RSV特異性抗體更有優(yōu)勢(shì)。相比其他抗體，獲得類似的效果只需要更少 的AM22抗體。因此，給予個(gè)體更少的AM22用于RSV-相關(guān)病癥的治療和/或預(yù)防?；蛘?， 相比其他抗體，用類似量的AM22可以獲得更有效的RSV-相關(guān)病癥的治療和/或預(yù)防。
[0016] 此外，本發(fā)明的RSV-特異性抗體識(shí)別不同于如前公開的RSV結(jié)合分子的表位。 AM22與之前鑒定的抗體（W02008/147196)類似，能夠結(jié)合RSV F蛋白（圖3A)。然而， AM22不結(jié)合單體RSV F蛋白（圖3B的左和右組）。與AM22相反，已知抗體帕利珠單抗和 AM16 (W02008/147196和圖3B中公開）能夠結(jié)合F蛋白的單體形式。重要的是表達(dá)抗原特異 性B細(xì)胞受體（BCR)的AM22B細(xì)胞系不識(shí)別F蛋白的重組形式（圖3C)。因此AM22結(jié)合與 帕利珠單抗、D25、AM23和AM16不同的F蛋白表位。當(dāng)重組F蛋白在包含具有8個(gè)HIS-標(biāo) 簽（ILZ-8xHIS)的異亮氨酸拉鏈三聚基序的載體中表達(dá)時(shí)，AM22識(shí)別該三聚體，其為構(gòu)象 依賴型結(jié)構(gòu)（圖3D)。相反AM14不識(shí)別F蛋白的單體形式或所述ILZ-8xHIS F蛋白。因 此AM22結(jié)合同樣與AM14不同的F蛋白表位。此外人們發(fā)現(xiàn)AM22不妨礙D25或帕利珠單 抗結(jié)合RSV感染的H印2細(xì)胞。因此相比D25、AM14、AM16、AM23和帕利珠單抗，AM22結(jié)合不 同的F蛋白表位。因此，本發(fā)明的RSV-特異性抗體或其功能等同物優(yōu)選與已知的RSV-特 異性抗體，諸如帕利珠單抗、D25、AM14、AM16和AM23聯(lián)用。通過(guò)將本發(fā)明的抗體與已知的 RSV-特異性抗體聯(lián)用，在同樣的療法期間可以識(shí)別兩個(gè)或更多不同的RSV表位。因此獲得 對(duì)RSV更強(qiáng)的免疫原性應(yīng)答。此外，可通過(guò)已知的RSV-特異性抗體與本發(fā)明的AM22抗體 聯(lián)用而實(shí)現(xiàn)對(duì)RSV更高的抗體特異性。隨著對(duì)RSV更強(qiáng)的免疫原性應(yīng)答和更高的特異性， 所述聯(lián)用將產(chǎn)生更有效的RSV-相關(guān)病癥的治療和/或預(yù)防。最后，如通過(guò)其約1. 15ng/ml 的低IC5Q值所示，由于相比帕利珠單抗、D25、AM14、AM16和AM23, AM22具有對(duì)F蛋白更強(qiáng) 的結(jié)合力，因此需要較低的總抗體劑量。
[0017] 因此一個(gè)實(shí)施方案提供在體外中和測(cè)定法中具有小于1. 25ng/ml的IC5Q值的本發(fā) 明抗體或功能等同物，該測(cè)定法中ffip-2細(xì)胞被RSV-A2病毒感染。所述抗體或功能等同物 優(yōu)選具有小于1. 2ng/ml的IC5(I值，優(yōu)選在0. 5ng/ml和1. 2ng/ml之間。另外，本發(fā)明的抗 體或功能等同物在其中ffip-2細(xì)胞被RSV-A2病毒感染的體外中和測(cè)定法中優(yōu)選具有比帕 利珠單抗IC5(I值低至少120倍，更優(yōu)選至少130倍的1C5(|值。所述抗體或功能等同物優(yōu)選 具有約1. 15ng/ml的IC5Q值。因此本發(fā)明的RSV-特異性抗體或其功能等同物與至少一種 已有的RSV-特異性抗體聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)更有效的RSV-相關(guān)病癥的治療和/或預(yù)防。
[0018] 抗體的功能等同物在此定義為抗體的功能部分、衍生物或類似物?？贵w的功能等 同物優(yōu)選為人工結(jié)合化合物，包括抗體的至少一個(gè)CDR序列。
[0019] 抗體的功能部分定義為具有與所述抗體在類型上而不必要在數(shù)量上相同的至少 一種特性的部分。所述功能部分能夠（雖然不一定以相同的程度）結(jié)合與所述抗體相同的 抗原。抗體的功能部分優(yōu)選包括單一結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈抗體、單鏈可變片斷（scFv)、Fab片 段或F(ab'）2片斷。
[0020] 抗體的功能衍生物定義為已經(jīng)過(guò)改變而使得產(chǎn)生的化合物的至少一種特性（優(yōu) 選抗原結(jié)合特性）在類型上而不必要在數(shù)量上基本相同的抗體。通過(guò)許多途徑提供衍生 物，例如通過(guò)保守的氨基酸取代，氨基酸殘基由通常具有相似特性（大小、疏水性等等）的 另一個(gè)殘基取代而使得整體功能很可能并不嚴(yán)重受影響。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很好地生成類似的抗體化合物。其例如利用肽庫(kù)或噬菌體展 示庫(kù)完成。所述類似物基本上具有所述抗體的至少一種在類型上而不必要在數(shù)量上相同的 特性。
[0022] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選為人抗體。使用人抗體用于人的預(yù)防和治療減少了由于人個(gè)體 中對(duì)非-人序列的免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的副作用的可能性。在另一實(shí)施方案中本發(fā)明的抗體、 功能部分、衍生物或類似物為人源化抗體。通過(guò)將非-人高變結(jié)構(gòu)域引入人抗體而產(chǎn)生人 源化抗體并且因此相比完全非-人抗體，減弱了免疫原性特性。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本 發(fā)明的抗體、功能部分、衍生物或類似物為嵌合抗體。這種情況下，目的序列，例如目的結(jié)合 位點(diǎn)可包含在本發(fā)明的抗體或功能等同物中。
[0023] 如技術(shù)人員熟知的，抗體的重鏈為裝配免疫球蛋白分子的兩類鏈中較大的鏈。重 鏈包括恒定區(qū)和可變區(qū)，可變區(qū)參與抗原結(jié)合?？贵w的輕鏈為裝配免疫球蛋白分子的兩類 鏈中較小的鏈。輕鏈包括恒定區(qū)和可變區(qū)。其可變區(qū)與重鏈可變區(qū)一起參與抗原結(jié)合。
[0024] 互補(bǔ)-決定區(qū)（⑶R)為重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的高變區(qū)。重鏈和連接的抗體 輕鏈的CDR共同形成抗原結(jié)合部位。
[0025] 因?yàn)楸景l(fā)明提供了以下理解，即圖2中所述的CDR序列提供所需的結(jié)合特性，技術(shù) 人員完全能夠生成包含至少一種改變的CDR序列的變體。例如，應(yīng)用保守的氨基酸取代。而 改變圖2中所述的至少一種CDR序列以生成相比AM22具有至少一種改變的特性的變體抗 體或其功能等同物也是可能的。優(yōu)選，提供包含CDR序列的抗體或功能等同物，該CDR序列 與圖2中所述CDR序列至少70%相同而使得AM22的良好結(jié)合特性至少部分維持或甚至得 到改進(jìn)。優(yōu)選改變圖2中所述的CDR序列使得得到的抗體或功能等同物相比AM22包含至 少一種改進(jìn)的特性，例如改善的穩(wěn)定性和/或結(jié)合親和力。優(yōu)選維持結(jié)合特異性（同樣，而 不必全部）。包含與圖2中所述CDR序列至少70%相同的氨基酸序列的變體抗體或其功能 等同物也因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用于改變氨基酸序列的各種方法是本領(lǐng)域中可得到的。 例如，人工合成具有所需CDR序列的重鏈或輕鏈序列。優(yōu)選，例如利用隨機(jī)或定點(diǎn)-誘變突 變編碼CDR序列的核酸序列。
[0026] 抗原和抗體之間結(jié)合的親和常數(shù)和特異性的測(cè)定優(yōu)選用以測(cè)定預(yù)防、治療、診斷 的功效以及利用本發(fā)明抗-RSV抗體的研宄方法。"結(jié)合親和力"通常指分子（例如抗體） 的單一結(jié)合位點(diǎn)和其結(jié)合配體（例如抗原）之間總的非共價(jià)相互作用的力。除非另外指 出，如此處所用的，"結(jié)合親和力"指反映結(jié)合對(duì)（例如抗體和抗原）成員間1 :1相互作用 的固有結(jié)合親和力。親和力通常可由計(jì)算為比值的平衡離解常數(shù)（Kd)表示。參 見例如Chen，Y.，等.，（1999) J. Mol Biol 293:865-881?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的常見方法 測(cè)定親和力，例如表面胞質(zhì)共振（SPR)測(cè)定法，諸如IBIS Technologies BV(Hengelo，the Netherlands)的 BiaCore 或 IBIS-iSPR 儀器，或液相測(cè)定法，諸如 Kinexa。
[0027] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的抗-RSV抗體對(duì)RSV F蛋白的表位具有結(jié)合親 和力，其包括小于 1 X 1(T2M、1 X 1(T3M、1 X 1(T4M、1 X 1(T5M、1 X 1(T6M、1 X 1(T7M、1 X 1(T8M、 1 X 10_9M、1 X 10_1qM、1 X 10_nM、1 X 10_12M、1 X 10_13M、1 X 10_14M 或小于 1 X io_15m 的離解常 數(shù)（Kd)。在一實(shí)施方案中，抗-RSV抗體具有小于10_7M、小于5X1(T 8M、小于1(T8M、小于 5X 1(T9M、小于 1(T9M、小于 5X 10^1、小于 10^1、小于 5X l(TnM、小于 l(TnM、小于 5X 1(T12M、 小于 1(T12M、小于 5X1(T13M、小于 1(T13M、小于 5X1(T14M、小于 1(T14M、小于 5X1(T15M 或小于 1(T15M 的 Kd。
[0028] 本發(fā)明進(jìn)一步提供分離的、合成的或重組的抗體或其功能部分、衍生物和/或類 似物，其包括：
[0029] -重鏈⑶R1序列，其包括具有與序列KLSIH至少70%序列同一性的序列，和/或
[0030] _重鏈^1?2序列，其包括具有與序列6￥￡6￡￥0￡正